全 文 ：临床分离株的 M IC均为 31. 25 m g /m l。
2. 3　黄连 、大黄联合头孢他啶的体外抑菌作用　黄连联合头孢
他啶的药敏试验中 , 3 /4菌株的两药合用抑菌环直径均大于单
用头孢他啶抑菌环直径 , 1株菌抑菌环直径无变化;大黄联合头
孢他啶的药敏试验中 , 3菌株的两药合用抑菌环直径均大于单
用头孢他啶抑菌环直径 ,详见表 2、3。
　　表 2　头孢他啶单用和联合黄连的药敏纸片抑菌环直径 　(毫米)
受 试 菌 黄连含量(mg /m l) (M IC)
头孢他啶
联合(a) 单用(b) a-b
大肠埃希菌 ATCC25922 62. 5 (0. 5) 29 26 3
大肠埃希菌(临床分离株 1) 62. 5 (0. 5) 30 24 6
大肠埃希菌(临床分离株 2) 15. 625 (0. 5) 40 20 20
大肠埃希菌(临床分离株 4) 62. 5 22 22 0
–x±s 50. 8±23. 4 30. 3 ±7. 4 23 ±2. 6 7. 25±8. 8
　　表 3　头孢他啶单用和联合大黄的药敏纸片抑菌环直径 (毫米)
受 试 菌 大黄含量(mg /m l) (M IC)
头 孢 他 啶
联合(a) 单独(b) a-b
大肠埃希菌 ATCC25922 15. 625 (0. 5) 33 28 5
大肠埃希菌 (临床分离株 1) 15. 625 (0. 5) 35 22 13
大肠埃希菌 (临床分离株 6) 15. 625 (0. 5) 30 20 10
–x±s 15. 625±0 32. 7±2. 5 23. 3±4. 2 9. 3±4. 0
3　讨论
　　本文结果表明:黄连或大黄合用头孢他啶可增强体外和体
内抗大肠埃希菌作用。大黄单用时无体内抗感染作用 , 而合用
头孢他啶则抗大肠埃希菌感染作用增强 ,小鼠死亡率为 0%。
花叶开唇兰清除活性氧作用研究*
龚　宁 ,邓琳琼 , 唐兰秀 ,余正祖 , 罗元丽
(贵州师范大学生物技术与工程学院 ,贵阳　 550001)
　　摘　要　目的:探讨花叶开唇兰的活性氧清除作用。方法:制备花叶开唇兰水提液(ARE)、石油醚提取部位(AP)、氯仿提取
部位(AC)、乙醇提取部位(AE)和水提取部位(AW),分别用 NBT光化还原法 、Fenton反应法和钼酸铵显色分光光度法检测对 O 2 -、
OH及 H2O2活性氧的清除作用。结果:ARE对 O2 -、 OH具有清除作用 ,曲线为抛物线型 , EC50分别为 1. 72mg /m l和 1. 94m g /m l;
ARE对 H
2
O
2
无明显清除作用。 AW对 O
2
-和 OH的清除作用明显高于 AP、AC和 AE。结论:花叶开唇兰具有清除 O
2
-和 OH的
能力 , 活性主要存在于其水提取部位中。
　　关键词　花叶开唇兰;活性氧
　　花叶开唇兰(Anoec tochilus roxbu rghii(W al.l )L ind.l )为兰科
开唇兰属植物 , 是民间作为 “金线莲”药材使用的道地品种 [ 4] 。
金线莲在民间有 “神药”、“药王”之称 [ 1] , 但目前对其药用和保
健作用的机理却研究很少 。本文首次测定了花叶开唇兰提取
液对 O2 - 、 OH和 H2O2几种活性氧的清除作用 ,并对其有效成
分的筛选进行了初步研究。
1 　材料与方法
1. 1 　试验药物 　花叶开唇兰(Anoec to chilus roxburgh ii(W al.l )
L ind.l )于 2005年 7月采集自贵州省荔波县翁昂乡 ,经贵州师范
大学王承录副教授鉴定 ,标本保存于贵州师范大学生物技术与
工程学院。花叶开唇兰全草于 40℃烘干至恒重 , 干 /鲜为 11.
23%, 称取干品 ,粉碎过 2号筛 ,加入 15倍蒸馏水 80℃恒温震荡
提取 1小时 ,过滤 , 滤渣再加 6倍蒸馏水 80℃恒温震荡提取 1小
时 , 过滤 ,合并两次滤液即得花叶开唇兰水提液 (ARE)。另取
干品 , 粉碎过 2号筛 , 加入石油醚 , 室温下震荡提取 4小时 , 过
滤 , 滤液即为石油醚提取部位(AP);滤渣风干后加入氯仿 , 40℃
恒温震荡提取 4小时 , 过滤 ,滤液为氯仿提取部位 (AC);滤渣风
干后加入无水乙醇 , 60℃恒温震荡提取 4小时 , 过滤 ,滤液为乙
醇提取部位(AE);滤渣风干后加入蒸馏水于 80℃恒温震荡提
取 2次 , 每次 1小时 , 过滤 , 合并两次滤液即为水提取部位
(AW)。将上述各提取液置于冰箱备用 , 用时根据预实验结果
配成不同浓度供试液 ,浓度以每毫升相当于多少毫克花叶开唇
兰干品表示。
1. 2 　试剂　 NBT为 Am resco公司产品;L-甲硫氨酸 、核黄素为
国产生化试剂;番红花红 T为国产生物染色素;其余为国产分
析纯。
1. 3 　方法
1. 3. 1　花叶开唇兰提取液清除 O2 -实验　基本同周志刚等的
方法 [ 2] 。加不同浓度供试液的体系为样品 , 以提取介质代替供
试液的体系为对照 ,均以 PBS液代替 NBT作空白 , 样品管和对
照管吸光度与各自空白之差分别记为 ΔA样品和 ΔA对照。提取液
对 O2 -的清除能力以清除率 E%表示 , 清除率按下式计算:E%
=(ΔA对照 -ΔA样品 /ΔA对照 )×100%
1. 3. 2　花叶开唇兰提取液清除 OH 实验　利用 Fen ton反应
原理 , OH由 EDTANa2-Fe(Ⅱ )-H2O2体系产生 , 由于 OH 可
39中药药理与临床 2006;22(2)
* 贵州省高校发展专项资金自然科学类重点项目(黔教科 2004110)
DOI牶牨牥牣牨牫牬牨牪牤j牣cnki牣zyy l牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牪牪
特异地使番红花红褪色 , 根据褪色程度用比色法来衡量 OH
的含量。实验参照靳菊情等的方法 [ 3]略加改进:反应体系包含
pH 7. 4的 PBS液 1m l、番红花红 T(70μg /m l)0. 5m l、 EDTANa2-
Fe(Ⅱ )(2mm o l /L) 1m l、不同浓度供试液 0. 25m l和 H2O 2(0.
33%)0. 5m l,混匀后于 37℃水浴保温 30m in,然后于 520nm处测
A值。加不同浓度供试液的体系其吸光度为 A样品 , 以提取介
质代替供试液的体系其吸光度为 A空白 , 二者均以未加 ED-
TANa2-Fe(Ⅱ )(用蒸馏水代替)作对照 ,各自与其对照之差分别
记为 ΔA样品和 ΔA空白。 供试液对 OH 的清除能力以清除率
E%表示 ,清除率按下式计算:E% =(ΔA空白 -ΔA样品 /ΔA空白)×
100%
1. 3. 3　花叶开唇兰提取液清除 H2O2实验　参照周强等测定
过氧化氢酶活性的方法 [ 4]建立实验模型。其工作原理是:花叶
开唇兰提取液作用于基质液中的 H2O2 , 剩余的 H2O 2可与钼酸
铵形成稳定黄色复合物 , 在一定范围内颜色的深浅与 H
2
O
2
的
浓度成正比 , 通过计算得出提取液对 H2O2 的清除率。于样品
管中加入 1. 2m l不同浓度的供试液和 1. 5m l基质液(65um ol /
LH2O2 ,用 pH7. 4PBS配制), 37℃水浴保温 1. 5m in后立即加入
钼酸铵 1. 5m l(32. 4mm o l /L), 5m in后在 405nm处测 A值;以提
取介质代替供试液作对照 , 均以 PBS液代替基质液作空白 , 样
品管和对照管吸光度与各自空白之差分别记为 ΔA样品和 ΔA
对照。提取液对 H2O 2的清除能力以清除率 E%表示 ,清除率按
下式计算:E% =(ΔA对照-ΔA样品 /ΔA对照)×100%
2 　结果
2. 1 　花叶开唇兰水提液对活性氧的清除作用　花叶开唇兰
水提液(ARE)对光照-核黄素体系产生的 O
2
-的清除作用见图
1,对 Fenton反应体系产生的 OH的清除作用见图 2。图 1和
图 2表明:ARE对 O 2 -和 OH具有清除作用 ,其清除率对 ARE
浓度的曲线呈抛物线型 ,即在低浓度时随浓度增加清除率增加
较快 , 当浓度增加到一定高度时 , 随浓度增加其清除率增加变
得缓慢。达 50%清除率所需 ARE浓度(EC50)分别为 1. 72m g /
m l和 1. 94m g /m l。 ARE对 H2O2的清除作用见图 3:当 ARE浓
度为 7. 62mg /m l和 22. 86mg /m l时 ,清除率分别为 1. 46%和 12.
44%。与前二者比较起来(当 ARE浓度为 6. 15mg /m l时 , 对 O2
-和 OH 的清除率分别达到 89. 16%和 78. 78%), ARE对
H2O 2的清除作用很弱。
Figu re 1　 S cavenging of superoxide anions by ARE. Data rep resen t the
m eans of trip licate determ ination from three experim en ts
Figu re 2　 Scaveng ing of hydroxyl rad ical by ARE. D ata rep resen t the m eans
of trip licate determ ination from three experim ents
Figu re 3　 S cavenging of hyd rogen peroxide by ARE. D ata rep resent the
m eans of trip licate determ ination from three experim en ts
2. 2 　花叶开唇兰各提取部位对 O2 -、 OH 和 H2O2 的清除作
用　测定了四个提取部位(即石油醚提取部位 AP、氯仿提取部
位 AC、乙醇提取部位 AE和水提取部位 AW)对 O2 - 、 OH 和
H2O 2的清除作用 ,结果见表 1。表中数据表明:水提取部位对
O 2
-和 OH的清除作用明显高于其余部位 , 说明花叶开唇兰清
除 O2 -和 OH的有效成分主要存在于水提取部位中。 AC和
AE对 H2O 2的清除作用未测出 , AP和 AW对 H2O2不具有明显
的清除作用。
　　表 1　 花叶开唇兰各提取部位对 O2 - 、 OH和 H 2O 2的清除作用 (–x±s)
Extraction
C learance rate(%)
O 2
-
6. 15mg /m l　 12. 30m g /m l　
OH
6. 15m g /m l　 12. 30m g /m l　
H2O2
6. 15mg /m l　 12. 30m g /m l　
AP 15. 48±1. 03 23. 01±0. 453 10. 23±0. 91 33. 52±2. 33 1. 676±0. 184 4. 57±1. 63
AC 19. 22±0. 74 47. 91±0. 37 10. 07±3. 66 16. 06±2. 50 　　 - 　　 -
AE 37. 20±1. 11 49. 13±0. 25 17. 27±3. 08 27. 78±1. 97 　　 - 　　 -
AW 89. 93±0. 30 96. 27±0. 30 63. 60±0. 80 76. 74±0. 88 2. 540±0. 813 6. 87±1. 55
　　Data represen t the m ean s of –x±s from three experim en ts. “-” =undetected
3 　讨论
　　据郑纯等的考证 [ 1]及大多数相关文献提及的种类 , 金线莲
的原植物有三种:花叶开唇兰 (Anoectoch ilu s roxburgh ii(W al.l )
L ind.l )、台湾开唇兰 (Anoec tochilus. form osanus H ayata)和高雄
开唇兰 (Anoectochilus. koshunensis H ayata), 以前二者较常见。
到目前为止 ,日本和台湾学者对金线莲的研究主要集中在台湾
开唇兰和高雄开唇兰 ,大陆学者则集中在花叶开唇兰。台湾开
唇兰的抗氧化作用已有报道 [ 5] , 而对花叶开唇兰则未见报道。
40 中药药理与临床 2006;22(2)
我们的实验结果说明花叶开唇兰提取液对 O2 -和 OH 具有较
强的清除作用 , 而对 H
2
O
2
则无明显清除作用 , 这一结果与
Chun-Ching Shih等用台湾开唇兰所做的结果 [ 8]基本一致。
　　用 Fen ton反应体系产生 OH的方法被许多研究者广泛使
用 , 文献中对清除率的计算多采用以下公式:E% =(A样品-A
空白 /A对照-A空白)×100%[ 3, 6] , 其中 A样品指样品组吸光
度值 , 即加有不同浓度供试液体系的吸光度值;A空白指空白组
吸光度值 , 即以蒸馏水代替供试液体系的吸光度值;A对照指对
照组吸光度值 , 即以蒸馏水代替供试液和 EDTANa2-Fe(Ⅱ )体
系的吸光度值。这一公式没考虑供试液本身对吸光度测定的
影响 , 我们认为应该考虑 , 因此在实验中增设了一个样品对照 ,
即在加有不同浓度供试液的体系中 , 用蒸馏水代替 EDTANa2-
Fe(Ⅱ )所测的吸光度值 ,记作 A样品对照 , 将清除率的计算公
式修订为:E% =[ (A对照-A空白)-(A样品对照-A样品) /(A
对照-A 空白 )] ×100% =(ΔA 空白-ΔA 样品 /ΔA 空白 ) ×
100%。我们发现 , 当供试液浓度很低时 , 测出的 A对照和 A样
品对照值非常接近 , 用两个公式计算的结果也非常接近 , 随着
供试液浓度的增高 , A对照和 A样品对照差距越来越大 , 两个
公式计算的结果差距也越来越大;在高浓度时 , 用上述原公式
计算结果 >100%。这些现象说明当供试液对吸光度的测定没
有影响(供试液无色或其颜色在 520nm处没有吸收)时 , 用原公
式计算清除率是可行的 ,反之 , 原公式就不适用了。我们制备的
花叶开唇兰提取液呈粉红色 , 这显然会对吸光度的测定产生影
响 , 因此有必要用修订的公式进行计算。
　　到目前为止从开唇兰属植物中得到了甾体 、有机酸 、苷类 、
黄酮 、氨基酸 、微量元素和糖类 [ 7] , 花叶开唇兰中的多糖含量高
达 13. 326%[ 8] ,而中药中的黄酮类 、苷类 、多糖类和某些微量元
素是具有抗氧化作用的 [ 12] 。花叶开唇兰对 O
2
-和 OH的清除
作用的抗氧化活性物质有待进一步研究。
参考文献
1　郑纯 ,黄以钟 ,季莲芳. 金线莲文献考证、原植物及商品调查. 中草
药, 1996;27(3)∶ 169～ 171
2　周志刚 ,刘志礼 ,刘雪娴.极大螺旋藻多糖的分离 、纯化及其抗氧化
特性的研究.植物学报 , 1997;39(1)∶77～ 81
3　靳菊情 ,丁东宁 ,边晓丽等.银杏叶多糖的化学及清除羟自由基作
用.西安医科大学学报 , 2000;21(5)∶417～ 419
4　周强 ,曹春艳.血清过氧化氢酶的比色测定.哈尔滨医科大学学报 ,
2001;35(6)∶ 473 ～ 474
5　 ShihC hun-ching , Wu Yueh-w ern, LinWen-chuan. Scavenging of reac-
tive oxygen species and inhibit ion of th e oxidation of low dens ity lipop rotein by
the aqueou s ex traction of anoectoch ilu s form osanus. Am JC hin, 2003;31(1)
∶25～ 36
6　李平 ,王艳辉 ,马润宇.山茱萸多糖 PFCAⅢ抗氧化性能研究.北京化
工大学学报 , 2003;30(3)∶35 ～ 38
7　何春年 ,王春兰 ,郭顺星等.兰科开唇兰属植物的化学成分和药理活
性研究进展.中国药学杂志 , 2004;39(2)∶81～ 84
8　赖应辉 ,吴锦忠.金线莲中无机元素及糖类的分析. 中药材 , 1997;20
(2)∶84 ～ 85
Scaveng ing of reactive oxygen species by the extraction ofAnoectochilus roxburghii(W al.l )L ind.l
Gong N ing, Deng Linqiong, Tang Lanx iu, Yu Zheng zu, Luo Yuan li
(Schoo l of B io log ical Techno logy and Eng ineering, Gu izhou No rm al University, Guiyang　 550001)
　　Objec t:To eva luate the ability on scaveng ing o f reactive oxygen species by Anoectoch ilus roxbu rghii(W al.l )L ind.l M ethods:prepara-
tion aqueous ex trac tion o fAnoectoch ilus roxburghii(W al.l )L ind.l (ARE), ex trac tions by pe tro leum(AP), ch lo ro form(AC), e thano l(AE)
and w ater(AW) o f Anoectochilus roxburghii(W al.l ) L ind.l The scaveng ing o f O2 -、 OH and H2O2 w as estima ted sepa ra te ly by me thods
based on nitro blue terra-zo lium pho tochem ica l reduc tion, Fenton reac tion and spectropho tom etric assay. R esu lts:ARE had capacity o f scav-
eng ing O2
- and OH gene ra ted sepa ra te ly by system of NBT pho tochem ical reduc tion and Fenton reac tion. The EC50 forARE w as separa tely
1. 72mg /m l and 1. 94mg /m .l while the capacity o f scaveng ingH2O2 w as low. The capacity o f scaveng ing O2
- and OH byAW was obv iou s-
ly higher than by AP, AC and AE. Conclusion:The ex traction from Anoectoch ilus roxbu rghii(W al.l ) L ind.l had ability o f scaveng ing O
2
-
and OH and the ability has been assigned to AW ma in ly.
K eywords　 Anoectoch ilus roxburghii(W al.l )L ind.l;scaveng ing;reac tive oxygen species
竹荪托盖液对 IL-2、NK细胞的影响
郭渝南 ,熊　彬 ,唐　礴 ,范　娟
(泸州医学院附一院 ,泸州　646000)
　　摘　要　目的:研究竹荪托盖液对辐射损伤大鼠 IL-2、NK的影响。方法:SD大鼠以 60Co-γ线一次性全身照射造成辐射损伤。
灌服竹荪托盖液 30天采血作 IL-2、NK细胞指数检测 ,解剖取胸腺 、脾脏作指数测定。结果:竹荪托盖液组胸腺 、脾脏指数明显增加 ,
IL-2、NK提高。结论:竹荪托盖液能增加胸腺 、脾脏指数 , 增加 IL-2、NK细胞指数。
41中药药理与临床 2006;22(2)