全 文 ：收稿日期:2009-08-31;　修订日期:2009-11-26
基金项目:教育部春晖计划项目(No.Z2008-1-75014);
宁夏回族自治区自然科学基金(No.NZ0892);
宁夏医科大学面上科研项目
作者简介:王基云(1985-),男(汉族),山东烟台人 ,现为宁夏医科大学基
础医学院 2007级硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学及中药
药理学研究工作.
＊通讯作者简介:王　妍(1958-), 女(汉族),陕西西安人 , 现任宁夏医科
大学基础医学院教授 ,硕士研究生导师 , 学士学位 ,主要从事天然产物化
学研究工作.
沙枣花黄酮成分的含量测定及其药理作用的初步研究
王基云 1 ,姚　遥1, 2 ,肖　旭 1 ,王　锐1 ,陈　虎 1 ,张振华1 ,王　妍 1＊
(1.宁夏医科大学基础医学院 ,宁夏 银川　750004;
　2.宁夏医科大学医学科学技术研究中心 ,宁夏 银川　750004)
摘要:目的 参照中国药典(2005版)测定沙枣花(Elaeagnusangustifoliablossoms, EAB)中总黄酮和芦丁的含量 , 并初步
探讨沙枣花醇提物(thealcoholextractofElaeagnusangustifoliablossoms, AE-EAB)对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性
肝损伤的保护作用。方法 参考《中国药典》通过分光光度法和高效液相色谱法测定 EAB中总黄酮和芦丁的含量 ,并通
过测定小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和肝组织匀浆中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化
酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及观察肝脏形态学改变 , 研究不同剂量 AE-EAB对小鼠 CCl4急性肝损伤模型的保护
作用。结果 测得 EAB中总黄酮的含量为 27 mg/g,芦丁的含量为 0.029 mg/g。与 CCl
4
诱导的肝损伤模型比较 , AE-
EAB给药组小鼠血清中 ALT, AST活性明显降低(P<0.05), 同时小鼠肝组织中 MDA含量明显下降(P<0.01), GSH含
量有所升高(P<0.05), SOD活力明显增强(P<0.01)。形态学观察 , AE-EAB能明显减轻 CCl
4
对肝组织的损伤。结
论 EAB含有黄酮类化合物 , AE-EAB对 CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。
关键词:沙枣花;　黄酮;　急性肝损伤;　四氯化碳
中图分类号:R284.2;R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)04-0812-03
DeterminationoftheContentsofTotalFlavonoidsinElaeagnusangustifoliaBlossomsand
itsPharmacologicalActions
WANGJi-yun1 , YAOYao1, 2 ,XIAOXu1 , WANGRui1 , CHENHu1 , ZHANGZhen-hua1 ,WANGYan＊
(1.BasicMedicalSchoolNingxiaMedicalUniversity, Yinchuan750004, China;2.ResearchCenterofMedical
Scienceandtechnology, NingxiaMedicalUniversity, Yinchuan, Ningxia750004, China)
Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentsoftotalflavonoidsandrutininElaeagnusangustifoliablossoms(EAB)according
toTechnicalStandardForChinesePharmacopoeia(2005version), andtostudytheprotectiveefectsofthealcoholextractofElae-
agnusangustifoliablossoms(AE-EAB)onacutehepaticinjuryinducedbycarbontetrachloride(CCl4)inmice.MethodsSpec-trophotometricmethodandhighperformanceliquidchromatographywereusedtodeterminethecontentsoftotalflavonoidsandru-
tininEAB, accordingtoTechnicalStandardForChinesePharmacopoeia(2005 version).ThelevelsofALT, ASTinserumand
MDA, SODandGSHinliverweremeasuredandthehepatichistologicalchangeswereobservedbyopticalmicroscopeinorderto
studytheprotectiveefectsofdiferentdosesofalcoholextractofAE-EABonacutehepaticinjuryinducedby0.1% CCl4 inmice.ResultsThecontentoftotalflavonoidsofEABis27mg/g(27mgtotalflavonoidsin1gEAB), andthatofrutinwas
0.029 mg/g(0.029mgrutinin1gEAB).Comparedwithmodelgroup, thelevelsofALT, ASTinserumwereobviouslyde-
creased(P<0.05), andthelevelofMDAinliverwasalsolowered(P<0.05), buttheactivitiesofGSHandSODinliverwere
markedlyimproved(P<0.05, P<0.01)afterpretreatmentwithAE-EAB.AE-EABamelioratedthehepaticpathologicalchan-
gestoo.ConclusionTheresultsshowthatEABcontainsflavonoids, andAE-EABhasprotectiveeffectsonacutehepaticinjury
inducedbyCCl
4
inmice.
Keywords:EAB;　Flavonoids;　Acutehepaticinjury;　Carbontetrachloride
　　沙枣花为胡颓子科植物沙枣 ElaeagnusangustifoliaL.的花 ,
主产于西北地区。宁夏沙枣树抗旱耐碱 , 具有很强的生命力 ,
也是宁夏防风固沙的重要植物。沙枣花呈银白色 , 下垂 , 花呈漏
斗形 , 长 5 ～ 7mm。据 《中药大辞典》记载 , 沙枣花主要含山萘
酚 、花白素 、脂肪油和少量挥发油 , 具有止咳平喘的功能 , 可用
于治疗慢性气管炎 [ 1] 。目前对沙枣花研究较多的是其挥发油成
分 [ 2] 。本研究通过分光光度法测定了沙枣花醇提物中总黄酮的
含量 , 结果测得沙枣花中总黄酮的含量为 27mg/g(即 1g沙枣花
乙醇提取物中含总黄酮 27 mg);通过高效液相色谱法高效液相
测定沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量 ,结果测得沙枣花乙醇提取
物中芦丁的含量为 0.029 mg/g(即 1g沙枣花乙醇提取物中含芦
丁 0.029 mg), 表明沙枣花中含有黄酮类物质。本文还对沙枣花
醇提取物浸膏对 CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用做了初步
研究 , 为进一步开发应用沙枣花提供一些实验依据。
1　材料与仪器
1.1　动物 清洁级健康昆明种小鼠 , 雄性 , 体质量(20 ±2)g, 由
宁夏医科大学动物实验中心提供 , 动物合格证号:SCXK(宁)
2005-0001。
1.2　试剂 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、
超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)测定试
剂盒(南京建成生物工程研究所);甲醇为色谱纯(天津市江天化
工技术有限公司), 水为超纯水 , 其它试剂均为分析纯。 芦丁标
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准品(宁夏医科大学药学院提供)。
1.3　药材 沙枣花采自宁夏医学院旁沙枣林 , 经宁夏区药品检验
所中药研究室主任韩文欣鉴定为胡颓子科植物沙枣树 Elaeagnus
angustifoliaL.的新鲜花序。
1.4　仪器 高效液相色谱仪(日立 MODELL-2100/2130);All-
SPhereODSC18(4.6mm×250 mm)色谱柱;旋转蒸发仪(上海亚
荣);SHB-III型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公
司);KQ-3200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司);Mili-Q超纯水仪(法国);电子天平(梅特勒 -托利多仪器
有限公司);721分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);高速低温
离心机(日立公司 CF16RX);恒温水浴锅(上海精宏实验设备有
限公司)。
2　方法与结果
2.1　分光光度法测定沙枣花总黄酮的含量 [ 3]
2.1.1　对照品溶液的制备 精密称取在 120℃干燥至恒重的芦
丁对照品 50 mg, 置于 25 ml量瓶中 ,加甲醇适量 , 置水浴上微热
使溶解 , 放冷 , 加甲醇至刻度 ,摇匀。精密量取 10 ml, 置 100 ml
量瓶中 , 加水至刻度 ,摇匀 , 即得(每毫升中含无水芦丁 0.2 mg)。
2.1.2　标准曲线的制备 精密吸取标准溶液 1, 2.3, 3, 4, 5, 6 ml
置 25ml量瓶中 ,各加亚硝酸钠溶液 1.00 ml, 混匀 , 放置显色 6
min,加 10%硝酸铝溶液 1 ml, 摇匀 , 放置 6 min, 加氢氧化钠试液
10 ml,再加水至刻度 , 摇匀 , 放置 15 min, 以相应试剂为空白 ,按
照紫外 -可见分光光度法在 500 nm波长处测定吸光度 , 以吸光
度为纵坐标 , 浓度为横坐标 , 绘制标准曲线。其回归方程 Y=
10.31X-0.003 5, 相关系数 r=0.998 5, 线性关系良好。
2.1.3　测定法 取本品粗粉 1g, 精密称定 , 置索氏提取器中 , 加
石油醚适量 , 加热回流至提取液无色 , 放冷 ,弃去乙醚液。再加甲
醇 90 ml, 加热回流至提取液无色 ,转移至 100ml量瓶中 , 用甲醇
少量洗涤容器 , 洗液并入同一量瓶 , 加甲醇至刻度 ,摇匀。精密量
取 10ml, 至 100 ml量瓶中 , 加水至刻度 ,摇匀。精密量取 3 ml,置
25 ml量瓶中 , 照标准曲线制备项下的方法 ,自 “加亚硝酸钠 ”起
依法测定吸光度 , 测得吸光度值为 0.030, 从标准曲线上算得供
试品溶液中总黄酮的浓度为 0.003 24mg/ml, 即算得沙枣花中总
黄酮的含量为 27mg/g(即每克沙枣花中含有总黄酮 27 mg)。
2.2　RP-HPLC色谱法测定芦丁的含量 [ 3]
2.2.1　标准曲线的制备 取芦丁对照品溶液(0.1 mg/ml)分别
进样 , 进样体积分别为 1, 2, 4, 6, 8, 10, 35, 40 μl, 测定峰面积 , 以
进样量为横坐标 , 峰面积 A为纵坐标 , 得回归方程为 A=6.9 ×
109C+191 498, 相关系数为 r=0.999 8,芦丁在 0.38 ～ 6.08 μg
范围内成良好的线性关系。见图 1。
2.2.2　色谱条件 色谱柱为 ODSC18(4.6 mm×250 mm), 检测
波长 360 nm,柱温为室温(30℃),流速 1.0 ml/min, 流动相为甲
醇 -水 -冰醋酸(35∶62.4∶2.6)。
2.2.3　供试品溶液制备及芦丁的含量测定 取沙枣花粗粉 1 g,
精密称定 , 置具塞锥形瓶中 ,精密加入甲醇 50 ml,称定重量 , 超声
处理(功率 250 W,频率 25 kHz)30 min, 放冷 , 再称定重量 , 用甲
醇补足减失的重量 , 滤过。精密量取滤液 5 ml, 置 25 ml量瓶中 ,
加甲醇稀释至刻度 , 摇匀 ,即得供试品溶液。用 0.45μm微孔滤
膜过滤 , 进样 10 μl按 “ 2.1.1”项下色谱条件注入色谱仪 , 测峰
面积。结果测得沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量为 0.029 mg/g
(即每克沙枣花乙醇提取物中含芦丁 0.029 mg)。见图 2。
2.2.4　沙枣花醇提物浸膏的制备 1.0kg沙枣花切碎后 , 加 3倍
量 80%乙醇加热回流提取(1 h×3), 合并滤液 , 减压浓缩 , 得
121.3g沙枣花浸膏。
2.2.5　沙枣花浸膏最大给药剂量的测定 [ 4] 健康昆明种小鼠 40
只 , 18 ～ 22 g, 雌雄各半 ,分两组 , 沙枣花醇提物灌胃 , 0.4 ml/只
(最大容积 ,最大耐受量), 给药前禁食 10 h, 正常饲水。 观察 14
d,记录小鼠一般状况改变及死亡数。结果发现 , 给药后 10 ～ 20
min呼吸加快 , 1 h后呼吸平稳。 观察 1周未见小鼠外观及行为
有任何变化 ,未见小鼠死亡。因此灌胃最大耐受量为 16.0 g/kg。
图 1　芦丁标准品高效液相色谱图
图 2　沙枣花高效液相色谱图
2.2.6　CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型的建立 [ 4] 昆明种小鼠
60只 , 雌雄各半 ,将小鼠随机分成 6组 , 每组 10只。分别为正常
对照组 , CCl4模型组 , 阳性药(联苯双酯滴丸)对照组(0.2 g·
kg-1)、沙枣花浸膏高(16 g· kg-1), 中(8 g· kg-1), 低(4 g·
kg-1)剂量组 , 灌胃给药 21 d, 同时模型组和正常对照组分别给
予同体积生理盐水。于第 21天给药 2h后 ,每鼠 ip10ml· kg-1 ,
0.1% CCl4橄榄油溶液 ,正常对照组给等量的橄榄油溶液 , 禁食 ,
不禁水。造模 16 h后 , 眼球取血 , 血液 3 000 r· min-1离心 10
min,取血清超低温冰箱 -80°冻存以备下一步检测所需。采血
后 , 快速断头处死 ,取肝右叶组织 0.5 g, 在冰生理盐水中漂洗 , 滤
纸拭干 ,用生理盐水制成 10%肝组织匀浆 , 离心 , 取上清液待测。
同时取左叶肝脏 , 4%多聚甲醛固定作病理切片。
测定指标:血清 ALT、AST, 按试剂盒要求进行测定;肝组织
匀浆 SOD、MDA和 GSH, 按试剂盒要求进行测定;取肝左叶同一
部位组织 ,用常规石蜡包埋 , 切片 , HE染色 , 光镜下观察肝组织的
形态学变化。
统计学处理:采用 SPSS12.0统计软件 , 数据以 x±s表示。
组间采用 t检验 , P<0.05为差异有统计学意义。
2.3　血清生化指标检测 结果表明 , 皮下注射 CCl4可引起小鼠
急性肝损伤 , 表现在血清中 ALT, AST活性明显升高。 AE-EAB
各剂量组均可使其升高的 ALT, AST活性显著降低(P<0.05或
P<0.01),提示 AE-EAB对 CCl4引起的小鼠急性肝损伤有很好
的保护作用。见表 1。
表 1　AE-EAB对急性肝损伤小鼠血清 ALT, AST的影响( x±s)
组别 剂量 C/g· kg-1 ALT/U· L-1 AST/U· L-1
正常 - 16.7±4.0 37.9±4.6
模型 - 157.3±7.8＊＊ 189.4±8.7BDD 0.2 35.1±6.8＊＊■■ 47.0±8.5＊＊■■
AE-EAB(高) 16 43.0±9.3＊＊■■ 57.9±6.0＊＊■■AE-EAB(中) 8 59.9±3.4■■ 80.2±11.7■■AE-EAB(低) 4 89.2±6.7■■ 151.2±8.5■■
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01;与模型对照组比较 , ■P<0.05,
■■P<0.01;n=10
2.4　肝组织匀浆生化指标检测 从实验结果可见 , 模型组小鼠肝
组织中 MDA含量明显升高(P<0.01), SOD与 GSH活性显著下
降(P<0.01), 提示肝脏出现脂质过氧化。而 AE-EAB各剂量
组均可显著抑制肝组织中 MDA的升高 , 而 SOD, GSH活性明显
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升高(P<0.01或 P<0.05), 提示 AE-EAB有较强的抗氧化及 清除氧自由基的作用。结果见表 2。
表 2　AE-EAB对急性肝损伤小鼠肝组织SOD, MDA和 GSH的影响( x±s)
组别 剂量 C/g· kg-1 SOD/U· mg(prot)-1 MDA/nmol· mg(prot)-1 GSH/U· mg(prot)-1
正常 - 358.6±6.2 0.84±0.08 40.6±2.8
对照 - 248.2±14.5＊＊ 3.71±0.14＊＊ 20.8±1.7＊＊
BDD 0.2 348.7±7.5＊＊■■ 1.01±0.08＊＊■■ 35.8±6.6＊＊■■
AE-EAB(高) 16 349.3±10.3＊＊■■ 1.16±0.14＊＊■■ 36.1±1.8＊＊■■
AE-EAB(中) 8 305.2±7.0■■ 1.85±0.16■■ 28.9±2.6■■
AE-EAB(低) 4 263.2±11.5■■ 3.03±0.18■■ 23.1±1.7■■
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与模型对照组比较 , ■P<0.05, ■■P<0.01
2.5　肝脏组织病理学观察 正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色 ,
质地软而富有弹性;在光镜下可以观察到肝小叶结构完整 , 细胞
排列整齐 , 大小均匀 ,分界清楚 ,无炎细胞浸润(图 3 -A)。 模型
组小鼠肝脏体积增大 ,质脆 ,边缘钝而厚 ,表面呈黄褐色 , 有暗红
色出血点;镜下见肝小叶结构破坏 ,肝细胞核消失 ,出现以中央静
脉为中心的局灶性肝细胞变性 、坏死和大量炎细胞浸润(图 3-
B)。联苯双酯组(图 3-F)和 AE-EAB(图 3-E)高剂量组肝脏
略有水肿 , 质地柔软;镜下见肝小叶结构基本完整 ,细胞排列较整
齐 , 只有少量的炎细胞浸润 , 较模型组有明显改善。 AE-EAB
(图 3-D)中剂量与低剂量组(图 3 -C)与模型组相比变化不明
显(图 1)。
　　　A.正常对照组;　　　　　　　　　B.模型对照组;　　　　　　　　　
　　C.AE-EAB(4g· kg-1);　　　　　D.AE-EAB(8 g· kg-1);　　　
E.AE-EAB(16mg· kg-1);　　　　F.阳性对照组(0.2g· kg-1)
图 3　各组小鼠肝组织病理学观察(HE, 400×)
3　讨论
肝炎是一种发病率高 ,难以根治的疾病 , 对人类健康危害极
大 , 而且不良的饮食习惯 、外界环境等均能导致肝脏疾病 , 损害肝
细胞。在肝细胞病变过程中 , 自由基 、酶及脂质过氧化等均发挥
重要作用 [ 5] , CCl4是诱导化学性肝损伤的常用药物 ,在体内经肝
脏细胞色素 P450激活生成三氯甲基自由基(· CCl3)二氯甲烷自
由基(· CCl2)等 ,引起膜的脂质过氧化 ,使肝细胞膜通透性增加 ,
引起肝细胞严重受损 , 细胞内转氨酶易穿过细胞膜而释放入血
液 [ 6] 。 MDA是脂质过氧化降解的主要产物 , 其含量反映了组织
脂质过氧化损伤程度的大小。 SOD和 GSH是细胞内主要的抗氧
化酶类 , 可清除机体内过多的自由基 , 激活或调动机体中的内源
性抗氧化系统 , 预防或减轻自由基损伤。 MDA的测定常常与
SOD的测定相互配合 , SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自
由基的能力 , 而 MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻
击的严重程度 [ 7 , 8] , GSH广泛存在于人体的各种组织中 , GSH水
平降低意味着机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应 ,
产生大量的自由基。在肝脏化学性损伤时 , 氧化应激消耗 GSH
引起肝组织中 GSH含量下降 , 机体抗氧化能力下降并引发机体
的氧化应激反应 [ 9] 。大量实验表明 [ 10]:各种黄酮类化合物如黄
酮类 、黄酮醇类 、二氢黄酮类 、异黄酮类 、黄烷酮类等对化学性肝
损伤 、药物性肝损伤 、免疫性肝损伤 、酒精性肝损伤 、缺血 /再灌注
性肝损伤等实验性肝损伤均有不同程度的保护作用 , 这种保护作
用与黄酮化合物清除自由基 、抗氧化 、抗脂质过氧化反应 、调节免
疫功能等有关 ,本实验结果表明 ,沙枣花醇提物能降低 CCl4诱导
的急性肝损伤小鼠血清中 ALT和 AST的水平 , 减轻肝细胞的炎
性浸润和变性坏死等病理改变 , 同时还明显降低肝组织中 MDA
的含量 , 并提高 SOD和 GSH的活力。降低机体内自由基的含量 ,
提高机体的抗氧化能力。 我们也对沙枣花醇提物做了总黄酮的
测定 ,并用高效液相色谱法分析了沙枣花醇提物中芦丁的含量 ,
发现沙枣花中含有黄酮类化合物。综上所述 , 沙枣花醇提物能够
抑制自由基诱导的肝脏脂质过氧化损伤作用 , 提高机体清除氧自
由基能力 , 维持细胞膜结构和功能的完整性 , 从而对 CCl4诱导
的化学性肝损伤起一定的保护作用 , 但到底是不是沙枣花中的黄
酮类物质对实验性肝损伤起保护作用以及其作用机制还有待进
一步研究。
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