全 文 ：[制　　剂 ]
桫椤叶总黄酮正交提取工艺和大孔树脂吸附分离特性的研究
陈封政 , 　李书华 , 　向清祥
(乐山师范学院 化学与生命科学系 ,四川 乐山 614004)
收稿日期:2007-12-17
基金项目:四川省科技厅应用基础研究资助项目(05JY029)和四川省教育厅自然科学研究基金资助项目(2005A165)。
作者简介:陈封政(1972 -), 男 , 副教授 , 硕士 , 研究方向为天然药物的活性成分的提取分离与鉴定。电话:0833-3836205, E-mail:
fzchen7200@163.com。
关键词:桫椤;总黄酮;正交实验;D104大孔树脂
摘要:目的:研究桫椤叶总黄酮的提取工艺和大孔树脂吸附纯化的工艺参数。方法:采用单因素和正交实验法 , 以总黄酮
的提取率为考察指标和采用树脂静态 、动态吸附脱附实验法 , 以总黄酮吸附率 、解吸率等为考察指标。结果:桫椤叶总黄
酮最佳提取工艺为:提取温度为 80 °C,提取时间为 1 h, 料液比为 1∶12,乙醇浓度为 60%, 提取 2次;树脂 D104对桫椤叶
总黄酮吸附分离的最佳工艺:上柱液质量浓度 1.36 mg/mL, 上柱流速 2 BV/h, 溶液处理量为 5 BV/次 ,洗脱溶剂为 70%
的乙醇 , 脱附流速为 3 BV/h,脱附剂用量为 2 BV/次。结论:该提取精制路线达到富集有效成分的目的。
中图分类号:R284.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)11-1600-04
ExtractionofAlsophilaspinulosa(Hook.)Tryonflavonoidsbyorthogonalex-
perimentandseparationbymacroporousresin
CHENFeng-zheng, 　LIShu-hua, 　XIANGQing-xiang
(DepartmentofChemistryandLifeSciences, LeshanTeachersColege, Leshan, Sichuan614004 , China)
KEYWORDS:Alsophilaspinulosa(Hook.);thetotalflavonoids;orthogonalexperiment;D104 macroporous
resin
ABSTRACT:AIM:TostudytheoptimumextractionprocesoftotalflavonoidsinAlsophilaspinulosa(Hook.)
Tryonandtechnologicalparameterofmacroporousresin.METHODS:Theoptimumparameterswerechosenbyra-
tiooftotalflavonoidsastheasessmentindexsuchasstaticanddynamicadsorptionofmacroporousresin.RE-
SULTS:Theoptimumextractingprocessconditionswereasfolows:solventwasethanol, ratioofsolid-liquidwas1
∶12, extractiontimewas1 h, temperaturewasat80 °C.TheoptimumtechnologicalconditionsoftheD104were:
thesolutionconcentractat1.36mg/mL, thecurentvelocityofadsorption2BV/h, theamountofsaturatedadsorp-
tionat5BV, theelutingreagent70% ethanol, theelutingvelocity3 BV/h, eluentvolumeat2 BV.CONCLU-
SION:TheprocesscanseparateandconcentratethetotalflavoiondsofAlsophilaspinulosa(Hook.)tryon.
　　桫椤 Alsophilaspinulosa(Hook.)Tryon是著名的
孑遗植物 ,在地球上存活了上亿年 [ 1] ,对物种的形
成和植物地理区系 、古生物学 、古气候 、古环境变迁
的研究具有重要价值 ,被科学界称为研究古生物和
地球演变的 “活化石 ”[ 2] 。桫椤的茎干在中药里称
为龙骨风[ 3] ,具有祛风除湿 、活血化瘀 、清热止咳的
功效 ,还可用于治人 、畜瘟症和痢疾等;髓心还可入
药 ,有驱风湿 ,强筋骨 ,清热止咳等功效 [ 4] 。桫椤叶
的黄酮具有抗肿瘤活性 ,与化疗药物联用时具有明
显的增效减毒作用[ 5] 。本试验以桫椤叶的活性物
质基础总黄酮为目的物 ,对其总黄酮进行了正交提
取工艺研究 ,并对最佳提取工艺得到的提取液进行
了大孔吸附树脂吸附分离特性研究 ,以期为桫椤叶
总黄酮的开发利用提供依据 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
　　桫椤叶采自四川省乐山市五通桥桫椤沟风景
区;大孔树脂 D101, D102(对应型号 DA201), D103
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(对应型号 DM301), D104(对应型号 AB-8),购自天
津市大钧科技开发有限公司;芦丁标准品 , 购自
Fluke公司。
KD723可见分光光度计 ,恒温振荡箱。
1.2　实验方法
1.2.1　总黄酮的含量测定
1.2.1.1　标准曲线的制备
精确称取干燥至恒重的芦丁标准品 21.26 mg,
用 50%的乙醇定容为 100 mL。准确吸取标准溶液
0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置于 50 mL量瓶
中 ,分别加入 1.4mL5%的 NaNO2 ,摇匀放置 6min,
然后加入 10%的 Al(NO3 )3 1.4 mL,摇匀放置 6
min,然后加入 4%的 NaOH10 mL,用 50%的乙醇定
容 ,在 510 nm波长处测定不同浓度的芦丁吸光度 。
得总黄酮的标准曲线:C=84.287A-0.443 3(r=
0.999 5),线形范围:4 ～ 20 μg/mL。
1.2.1.2　样品的测定
按照标准曲线制备的方法 ,以芦丁为对照品测
定样品的含量。
1.2.2　桫椤叶提取工艺效果的因素实验
1.2.2.1　单因素实验
准确称取 0.30 g桫椤叶粉末置于微型回流装
置中 ,在不同条件下提取以确定提取因素变化范围
以及各因素的较佳值 。通过测定提取液中总黄酮含
量 ,计算总黄酮的提取率 ,以判断最佳条件 。
1.2.2.2　工艺优化实验
以乙醇浓度 、浸提温度 、料液比和浸提时间四种
因素作为参考对象 ,采用正交 L9(34),以获取最佳
工艺参数。
1.2.3　桫椤叶总黄酮上柱液的制备
按照最优工艺条件提取桫椤叶中的总黄酮 ,浓
缩至无醇然后用蒸馏水稀释成总黄酮含量分别为
2.72 mg/mL, 1.36 mg/mL和 0.68 mg/mL的溶液 ,
做为桫椤叶总黄酮上柱液 。
1.2.4　大孔树脂静态吸附实验
1.2.4.1　饱和吸附量的测定
准确称取经预处理的用滤纸吸干表面水分的树
脂 0.50 g于 50 mL三角瓶中 ,精密加入 2.72 mg/
mL的桫椤叶总黄酮溶液 10.0 mL,在 18°C, 180 r/
min的条件下振荡吸附 24 h。测定吸附后溶液中黄
酮的量 ,并按下式计算树脂的饱和吸附量:
Q=(W0 -We)/W (1)
式中:Q—饱和吸附量 , mg/g;W0—加入总黄酮量量 ,
mg;We—未吸附的总黄酮量 , mg;W—树脂的量 , g。
1.2.4.2　树脂脱附率的测定
将上述经过 24 h静态吸附总黄酮的树脂分离
出来 ,吸干表面水分 ,然后加入 70%的乙醇 5.0mL,
在在 18°C, 180 r/min的条件下振荡脱附 2 h。测定
脱附液中总黄酮的量 ,按下式计算脱附率:
D=Wd(W0 -We)×100% (2)
式中:D—脱附率 , %;Wd—洗脱出的总黄酮 , mg;W0
和 We见式(1)。
1.2.5　树脂动态吸附———脱附条件的研究
准确称取静态实验所筛选出的最佳树脂 ,湿法
装 13 mm×72 mm的色谱柱 ,用蒸馏水洗涤平衡 ,以
不同浓度的总黄酮以不同的流速上柱 ,收集每一倍
量的树脂体积的流出液(BV),通过测定流出液总黄
酮的量来计算树脂的吸附率 ,从而考察上柱液的浓
度和流速等因素对树脂吸附性能的影响 ,确定最佳
工艺 。
对已吸附样品的树脂(13 mm×72 mm)进行脱
附实验。先用蒸馏水洗涤树脂 ,然后用不同浓度的
乙醇以不同的流速洗脱 ,收集每一倍量的树脂体积
洗脱液(BV),通过测定洗脱液总黄酮的量来计算树
脂的脱附率 ,从而考察洗脱液的浓度和流速对树脂
脱附性能的影响 ,以确定最佳工艺 。
2　结果与讨论
2.1　单因素实验
2.1.1　乙醇浓度对提取率的影响
黄酮易溶于丙酮 、乙醇和甲醇等有机溶剂。其
中乙醇价格便宜 ,无毒 ,能较好的穿透药材细胞 ,对
多种成分溶解性能好且能抑制药材中酶的活性。因
此本研究选用乙醇做提取溶剂 。不同浓度的乙醇具
有不同的提取率。在 40°C下 , 料液比 1 ∶12,提取
1.5h,浸提 1次时 ,乙醇浓度对总黄酮提取率见图 1。
图 1　乙醇浓度对提取率的影响
　　从图 1可以看出 60%的乙醇提取率最高 ,超过
此浓度的乙醇提取率略有下降 ,且提取液中叶绿素
显著增加 。故选择浓度为 60%左右的乙醇做提取
溶剂 。
2.1.2　温度对提取率的影响
固定乙醇浓度为 60%,料液比为 1 ∶12,提取 1
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次 ,提取时间为 1.5 h,变化提取温度。温度对总黄
酮提取率见图 2。
图 2　温度对提取率的影响
　　从图 2可以看出随温度升高 ,总黄酮的提取率
增加 ,但温度达到 80 ～ 90°C时提取率差异不大 ,从
成本和黄酮的热稳定性考虑 ,选择 80°C左右的温度
较佳。
2.1.3　料液比对提取率的影响
固定乙醇浓度为 60%,提取温度为 80 °C,提取
时间 1.5 h,提取 1次 ,改变料液比。不同料液比对
总黄酮提取率见图 3。
图 3　料液比对提取率的影响
　　从图 3可以看出料液比为 1∶16时总黄酮提取
率最高 ,但与料液比 1∶12时差别很小 ,考虑后续工
艺处理成本 ,优选 1∶12的料液比。
2.1.4　提取时间对对提取率的影响
固定乙醇浓度为 60%,提取温度为 80 °C,料液
比为 1∶12,提取 1次 ,改变提取时间 。不同提取时
间对总黄酮提取率见图 4。
图 4　提取时间对提取率的影响
　　时间对生产成本的影响很大 。从图 4可以看出
随提取时间的延长 ,提取率增加 ,但在 1 h后提取率
增加不大 ,提取时间的延长会延长生产周期 ,增加生
产成本 ,故提取时间可以控制在 1 h内 。
2.1.5　提取次数对提取率的影响
固定乙醇浓度为 60%,提取温度为 80 °C,料液
比为 1∶12,提取时间为 1h,改变提取次数 。不同提
取次数对总黄酮提取率见图 5。
图 5　提取次数对提取率的影响
　　从图 5可以看出浸提 1次的效果明显不如浸提
2次的效果好 ,但浸提 3次的效果与浸提 2次则提
取率增加效果不明显 ,且提取次数增加会显著延长
生产周期 ,增加生产成本 。因此 ,以浸提 2次为宜 。
2.2　总黄酮醇提优化工艺
　　从上面的单因素实验可以看出总黄酮的提取率
与乙醇浓度 、提取温度 、料液比和提取时间等因素均
有关 。为了对总黄酮提取工艺条件进行优化 ,选择
了 L9(34)正交实验 ,其因素水平见表 1。正交实验
结果和极差分析见表 2。
表 1　 总黄酮提取实验因素水平表
水平
因　　素
乙醇浓
度 A/%
提取温度
B/°C
料液比
C
提取时间
D/h
1 50 60 1∶8 0.5
2 60 70 1∶ 12 1
3 70 80 1∶ 16 1.5
表 2　 正交实验结果与极差分析
实验
序号
乙醇浓
度(A)/%
提取温
度(B)/°C
料液比
(C)
提取时
间(D)/h
总黄酮提
取率%
1 50 60 1∶8 0.5 3.06
2 50 70 1∶12 1 3.50
3 50 80 1∶16 1.5 3.65
4 60 60 1∶12 1.5 3.56
5 60 70 1∶16 0.5 3.16
6 60 80 1∶8 1 3.78
7 70 60 1∶16 1 3.45
8 70 70 1∶8 1.5 3.36
9 70 80 1∶12 0.5 3.58
K1 3.403 3.357 3.400 3.267
K2 3.500 3.340 3.547 3.577
K3 3.463 3.670 3.420 3.523
R 0.097 0.330 0.147 0.310
　　从表 2可以看出 ,各因素对浸提效果影响大小
的顺序为:B>D>C>A,即提取温度对浸提效果的
影响最大 ,其次为提取时间和料液比 ,乙醇浓度影响
最小 ,最优提取工艺为 B3D2C2A2 ,即总黄酮最佳提
取工艺为:提取温度为 80°C,提取时间为 1 h,料液
比为 1∶12,乙醇浓度为 60%,提取 2次 。
2.3　大孔树脂静态吸附脱附实验
　　非极性吸附树脂 D101具有疏水性表面结构 ,
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所以最适于从极性溶剂中吸附非极性溶质;极性树
脂 D102适用于从非极性溶液中吸附极性溶质;中
极性吸附树脂 D103和 D104,它们具有一定的亲水
性结构 ,可用于从极性溶剂中吸附非极性溶质 ,也可
用于从非极性溶剂中吸附一定极性溶质。桫椤叶中
黄酮种类多 ,根据黄酮母体结构上取代基羟基和糖
的数量不同而极性有差异 。我们选择了这四种从非
极性到极性的四种树脂进行实验。在相同的实验条
件下 ,测定各树脂的静态吸附 -洗脱性能结果如表
3。由表 3可以看出这四种树脂对桫椤叶总黄酮的
吸附量都大于 35 mg/g,且吸附量差异不大 ,但其洗
脱率以 D104最高 ,故优选 D104树脂分离纯化桫椤
叶总黄酮。
表 3　 4种树脂静态饱和吸附-脱附性能测定结果
树脂 加入的总黄酮量 /mg
吸附的总黄
酮量 /mg
饱和吸附
量 /(mg/g)
洗脱下的总
黄酮量 /mg
脱附率
/%
D101 27.2 18.12 36.24 16.20 89.40
D102 27.2 18.46 36.92 16.30 88.59
D103 27.2 18.96 37.92 17.04 89.87
D104 27.2 17.53 35.06 16.41 95.46
2.4　大孔树脂动态吸附与脱附实验结果
2.4.1　流速的影响
分别以 1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h的流速在同一
实验条件下进行动态吸附考察 ,结果见图 6。实验
结果表明溶液流速越慢吸附效果越好 。流速为 1
BV/h,流出液体积为 5BV时 ,吸附率依然为 79.4%,
而流速为 2BV/h时 ,在流出液为 4BV时 ,吸附率就
降到 78.4%,当流速为 3BV/h时 ,在流出液为 3BV
时 ,吸附率就降到 74.9%。其中 1 BV/h的流速吸
附效果最好 ,但生产效率不如 2 BV/h的流速 ,因此
选用 D104树脂吸附桫椤总黄酮的最佳流速为 2
BV/h。
图 6　不同流速下树脂对总黄酮的吸附率
2.4.2　上柱液质量浓度的影响
固定上柱液的流速为 1 BV/h,考察了 3种不同
浓度(2.72 mg/mL, 1.36 mg/mL, 0.68mg/mL)的总
黄酮上柱液对 D104树脂吸附性能的影响 ,见表 4。
　　从表 4可以看出 ,上柱液质量浓度为 0.68mg/
mL时 ,在流出液为 5 BV时树脂对流出液中总黄酮
的吸附率仍为81.2%,但考虑到工艺成本不宜选用 ,
而浓度为 2.72 mg/mL的浓度略显过大 ,在溶液中出
现了少量的析出物 ,故选用质量浓度为 1.36 mg/mL
的溶液上柱。
表 4　D104树脂对不同质量浓度的上柱液总黄酮吸附性率
上柱液质量浓度
/(mg/mL) 1 BV 2BV 3BV 4BV 5BV
2.72 87.2% 86.4% 85.4% 83.4% 79.4%
1.36 90.5% 88.6% 86.4% 84.0% 80.2%
0.68 91.1% 89.2% 87.4% 84.9% 81.2%
2.4.3　脱附剂浓度的影响
考察了 50%、 70%和 90%的乙醇洗脱剂对
D104树脂吸附的总黄酮脱附性能的影响 ,固定洗脱
流速为 2 BV/h。实验结果如表 5。
表 5　 不同浓度乙醇洗脱剂对总黄酮脱附性能影响
乙醇浓度 /% 洗脱剂为 1BV 洗脱剂为 2BV 洗脱剂为 3BV
50 79.2% 17.0% 3.8%
70 89.2% 10.1% 0.7%
90 90.4% 9.1% 0.5%
　　从表 5可以看出 ,选用 70%的乙醇 ,洗脱剂用
量为 2 BV就能达到 99.3%的脱附率 。
2.4.4　脱附剂流速的影响
以 70%的乙醇为洗脱剂 ,分别采用 1 BV/h、2
BV/h、3 BV/h的流速对吸附了桫椤总黄酮的 D104
树脂进行脱附处理 ,其结果见表 6。
表 6　 不同洗脱流速在不同洗脱体积的脱附率
洗脱流速
BV/h
脱附率 /%
洗脱剂为 1BV 洗脱剂为 2BV 洗脱剂为 3BV
1 90.6 9.35
2 89.2 10.1 0.7
3 89.5 9.12 0.38
　　从表 6可以看出 , 3种流速经过 2 BV洗脱剂的
洗脱 ,其脱附率均能达到 99%以上 ,显示了该树脂
的优良脱附性能 ,并且 3种流速的脱附率差异不大 ,
考虑工艺成选用脱附剂流速为 3BV/h。
2.4.5　上柱液 pH值的影响
桫椤总黄酮提取液的 pH约为 4.5,在此条件下
总黄酮呈游离态 ,有利于树脂的吸附 ,本项研究未就
不同 pH值对树脂吸附的影响进行深一步的研究。
3　结论
3.1　采用单因素实验考察不同条件下桫椤总黄酮
的提取率 ,然后结合正交提取工艺确定最佳工艺路
线 ,具有直观和准确的优点。
3.2　采用静态树脂饱和吸附和脱附性能的研究 ,再
结合动态研究 ,能快速的筛选出合适的树脂和最佳
的工艺路线。
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3.3　通过单因素实验和正交优化工艺得出桫椤叶
总黄酮最佳提取工艺为:提取温度为 80℃,提取时
间为 1 h,料液比为 1∶12,乙醇浓度为 60%,提取 2
次 。
3.4　通过树脂的静态 、动态吸附和洗脱等实验得出
树脂 D104对桫椤叶总黄酮吸附分离的最佳工艺:
上柱液质量浓度 1.36mg/mL,上柱流速 2 BV/h,溶
液处理量为 5BV/次 ,洗脱溶剂为 70%的乙醇 ,脱附
流速为 3 BV/h,脱附剂用量为 2BV/次 。
参考文献:
[ 1] 　廖富林.阴那山的几种珍稀濒危植物 [ J] .嘉应大学学报 ,
1994, 2:106-110.
[ 2] 　程治英 ,陶国达 ,许再富.桫椤濒危原因的探讨 [ J] .云南植物
研究 , 1990, 12(2):186-190.
[ 3] 　江苏新乡医学院编.中药大辞典 [ M] .上海:上海科技出版社 ,
2001:2402.
[ 4] 　敖光辉.桫椤的研究进展 [ J].内江师范学院学报 , 2004, 19
(6):79-82.
[ 5] 　唐　栩.黄酮类化合物 D01抗肿瘤的药理作用研究 [ D] .广
东:中山大学 , 2003.
β-环糊精包合对小儿腹泻外敷凝胶透皮吸收的影响
袁红宇 1 , 　王　静 2 , 　张宏文1 , 　欧　宁 1
(1.南京医科大学第一附属医院 ,江苏 南京 210029;2.南京中医药大学 ,江苏 南京 210046)
收稿日期:2007-10-13
基金项目:南京医科大学科技发展基金项目(NY03034)。
作者简介:袁红宇(1973-),男 ,副主任药师 ,硕士,研究方向:中药制剂开发。电话:025-83718836-6976, E-mail:hyyuan2002@sohu.com。
关键词:小儿腹泻外敷凝胶;β-环糊精包合;丁香酚;透皮吸收
摘要:目的:考察 β-环糊精包合对小儿腹泻外敷凝胶中挥发油透皮吸收的影响。 方法:以丁香酚单位面积累积渗透量为
指标 , 采用 Franz扩散池分别对挥发油直接入药和 β -环糊精包合后入药的两种小儿腹泻外敷凝胶进行小鼠离体皮肤体
外渗透实验。结果:丁香酚在两种凝胶中均以零级释放过程透过皮肤 , 其透皮吸收速率分别为(16.212 ±4.128)、
(11.344±1.929)μg/(cm2· h),二者具有显著性差异(P<0.01)。结论:挥发油经 β-环糊精包合后入药的凝胶具有缓
释效应。
中图分类号:R927.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)11-1604-04
Transdermalabsorptionefectofβ-cyclodextrininclusiononlilac-cassiabarkGel
YUANHong-yu1 , 　WANGJing2 , 　ZHANGHong-wen1 , 　OUNing1
(1.TheFirstHospitalAfiliatedtoNanjingMedicalUniversity, Nanjing, 210029 China;2.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine, Nanjing,
210046 China)
KEYWORDS:lilac-cassiabarkGel;β-cyclodextrininclusion;eugenol;transdermalabsorption;mouse
ABSTRACT:AIM:Toinvestigatetheefectofβ-cyclodextrininclusionontransdermalabsorptionofvolatileoilin
lilac-cassiabarkGel.METHODS:Thereleasetestoftwokindsoflilac-cassiabarkGel(gelAwithoutβ-cyclodex-
trininclusionandgelBwithβ-cyclodextrininclusion)wasassayedwithFranzdifusioncelwiththehelpofthecu-
mulativeamountofeugenolinunitareainvitro.RESULTS:Thepercutaneousabsorptionprocesofeugenolin
twokindsofgelswereconformedtozero-orderreleasingmodel, andthetransdermalrateswere16.212±4.128and
11.344±1.929 μg/(cm2· h)respectively.ComparedwithgelA, thetransdermalrateofeugenolwasslowerin
gelB(P<0.01).CONCLUSION:Thevolatileoilincludedbyβ-cyclodextrininlilac-cassiabarkgelisreleased
withasustainedmanner.
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