全 文 ：2011-10-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00662
应用与环境生物学报 2011，17 ( 5 ): 662~665Chin J
Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）位居全球癌
症发病率第五，死亡率第三，每年约有一百万人死于该病. 原
发性肝癌也是我国常见恶性肿瘤之一，位居我国癌症发病率
第二，其死亡率占全部恶性肿瘤死亡的近五分之一，而我国
每年肝癌死亡人数占全世界肝癌死亡总数的近二分之一，严
重威胁人类健康 . 目前治疗方法包括手术切除、移植、经皮
消融术以及其它综合治疗. 然而，不同药物的全身化疗方案
虽然对于某些肝癌病人具有一定疗效，但其毒性反应严重且
不能提高生存率，而大多数抗癌药物如他莫昔芬等对肝癌病
人则几乎完全无效. 尽管目前全世界第一个用于晚期肝癌病
人治疗的药物——多激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）已经
成功上市，但其低于3%的有效率以及仅有限延长病人3个月
左右生存期的残酷现实再次表明急需研发高效低毒副作用
的抗肝癌药物[1~2].
基于天然产物的抗肿瘤药物研发近年来一直方兴未艾，
而临床上常用的抗癌药物如紫杉醇、高三尖杉酯碱、长春新
碱及其衍生物均来自天然产物. 石斛是常用名贵中药材，为兰
科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium Sw.）多种植物的新鲜
或干燥茎的统称. 现代药理研究发现，石斛属植物所含化学
成分结构多，药理作用广泛，具 有抗肿瘤、抗衰老、增强机
体免疫力、扩张血管以及抗血小板凝集等作用，尤因其具有
抗肿瘤和增强机体免疫力作用而备受国内外广大学者关注，
而目前临床上石斛的使用主要为复方制剂或单味药粗提取
物中的某些成分，其成分与活性之间构效关系则很少深入研
究. 因此深入开展石斛抗肿瘤活性的物质基础及其分子机制
研究，对于合理利用石斛属植物资源具有重要的理论和现实
意义 [3~ 4].
毛兰素（2-甲氧基 -5-[2-(3,4,5-三甲氧基 -苯基 )-乙基 ]-
苯酚）（图1）是一种从鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum
Lindl.）中分离得到的低分 子量天然产物，属于联苄类化合
物，研究表明此类化合物具 有抗菌、抗病 毒以及抗肿瘤活
性，但其抗肿瘤详细分子机制以及靶标还知之甚少，尤其毛
兰素对人肝癌细胞的抗癌活性鲜有报道 [5~8]. 因此，本文通过
体外研究毛兰素对肝癌细胞凋亡与细胞周期的影响，探讨其
毛兰素对人肝癌Huh7细胞的抑制作用*
苏 鹏 王 晶 安君霞 朱启彧 卢晓霞** 唐亚雄**
（中国科学院成都生物研究所 成都 610041）
Inhibitory Effect of Erianin on Hepatocellular Carcinoma (HCC) Huh7 Cells*
SU Peng, WANG Jing, AN Junxia, ZHU Qiyu, LU Xiaoxia** & TANG Yaxiong**
(Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China)
Abstract Erianin, a low molecular-weight natural product isolated from Dendrobium chrysotoxum Lind., is often used
as an anti-pyretic and an analgesic in traditional Chinese medicine. Herein, this study evaluated the erianin’s effect on cell
proliferation, apoptosis and cell cycle progression of hepatocellular carcinoma (HCC) Huh7 cancer cells especially. The results
in vitro demonstrated that erianin signifi cantly suppressed proliferation of Huh7 cancer cells in a dose- and time-dependent
manner which was associated with induced apoptosis and cell cycle G2-M arrest, and the IC50 value was 37.4 nmol/L after 48 h
exposure to erianin. Mechanistically, erianin could inhibit Akt activation, down-regulate the expression of Mcl-1 protein, and
activate the cleavage of PARP in a dose- and time-dependent manner, leading to marked inhibitory effect of Huh7 cells. These
fi ndings suggest that erianin may be a promising antitumor drug for prevention and treatment of HCC. Fig 5, Ref 17
Keywords erianin; hepatocellular carcinoma (HCC) Huh7; proliferation; apoptosis; cell cycle
CLC R965 : Q949.718.430.6
摘 要 研究了从鼓槌石斛中分离得到的低分子量天然化合物毛兰素在体外对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用，并
探讨其诱导细胞凋亡的分子机制. 实验结果显示：毛兰素能显著抑制肝癌Huh7细胞的增殖，且随着药物浓度与时间增
加其抑制率呈明显的剂量时间效应，其48 h半数抑制浓度IC50为37.4 nmol/L；毛兰素能诱导人肝癌Huh7细胞凋亡并使
其细胞周期阻滞于G2-M期；分子机制研究显示毛兰素可抑制Akt激酶活性、下调Mcl-1蛋白表达以及激活PARP活性从
而导致其对Huh7癌细胞的增殖抑制作用. 以上结果初步表明毛兰素对肝癌防治具有潜在药用价值. 图5 参17
关键词 毛兰素；人肝癌细胞Huh7；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期
CLC R965 : Q949.718.430.6
收稿日期：2011-04-29 接受日期：2011-05-12
∗中国 科 学 院 知 识创 新工 程 领域 前 沿项目( No. KSCX2-EW-J-22)、
四川省国际合 作计 划（No. 2011HH0012）、国家自然 科 学基 金项目
（No. 81072662）和中国科学院“西部之光”人 才 培养计 划重 点项目
资助 Supported by the Frontier Field Project of Scientific Research of the
Knowledge Innovation Engineering of the Chinese Academy of Sciences (No.
KSCX2-EW-J-22), the International Cooperation Program of Sichuan, China
(No. 2011HH0012), the National Natural Science Foundation of China (No.
81072662) and the West Light Foundation of the Chinese Academy of Sciences
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: tangyx@cib.ac.cn)
6635 期 苏 鹏等：毛兰素对人肝癌Huh7细胞的抑制作用
可能的抗癌分子机制.
1 材料与方法
1.1 细胞株、药材与试剂
人肝癌细胞株Huh7、人正常肝细胞L02由中国科学院成
都生物研究所肿瘤信号转导与分子药理实验室引进与保藏，
用含10%胎牛血清的DMEM培养基（100 U/mL青霉素、100
mg/mL链霉素）于37 ℃、5% CO2条件下进行常规细胞培养.
细胞培养所用主要试剂购自Invitrogen公司，PARP、Phospho-
Akt、Mcl-1、ß -actin及HRP偶联的羊抗兔 /鼠IgG等抗体购自
Cell Signaling Technology公司，MTT以及DAPI购自Sigma公
司，其余试剂均为国产分析纯.
1.2 MTT法测定细胞活性
MTT测定参照文献 [9]进行. 首先，分别接种人 肝癌细
胞 Huh7、L02对 数 生长期 2×104个 细胞于24孔 细胞 培 养 板
上，3个复孔，细胞贴壁后加入不同浓度毛兰素，共设8个药
物浓度梯度，分别为0.1% DMSO、9.8 nmol/L、19.6 nmol/L、
39.3 nmol/L、78.5 nmol/L、157.1 nmol/L、392.6 nmol/L与785.3
nmol/L，药物处理48 h后加入新鲜配制终浓度为1 mg/mL 的
MTT [3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]溶液并
于37 ℃温育3 h，全波长酶标仪检测570 nm波长吸光度，0.1%
DMSO作为阴性对照，计算毛兰素对细胞生长的抑制率与半
数抑制浓度IC50；然后，用不同浓度梯度的毛兰素分别处理
人肝癌Huh7细胞1 d、3 d、5 d后，进而绘制毛兰素对Huh7细
胞的生长曲线. 每一样品重复试验3次.
1.3 倒置显微镜观察细胞形态
参照文献[10]进行. 培养Huh7细胞至饱和度为70%，分别
用0.1% DMSO与39.3 nmol/L毛兰素处理48 h后，吸去培养基，
经1xPBS洗涤3次后于倒置显微镜下观察.
1.4 DAPI染色
参照文献[11]进行. 将培养至饱和度为50%~80%的Huh7
细胞，分别用0.1% DMSO与39.3 nmol/L毛兰素处理细胞48
h，然后加入4%多聚甲醛固定细胞30 min后，1xPBS洗涤一次
后，加入终浓度为1 μg/mL DAPI染色液染色5 min，PBS润洗，
细胞涂片经风干固定后于正置荧光显微镜下检测，荧光激发
波长为350 nm，发射波长为460 nm.
1.5 细胞周期分布的测定
细胞流式分析检测方法参见文献[12]，先将0.1% DMSO
和浓度依次为19.6 nmol/L、39.3 nmol/L以及78.5 nmol/L的毛
兰素分别加入到Huh7细胞中，24 h后收集细胞，经70%冰乙
醇－20 ℃过夜固定后，用PBS洗涤3次，50 μg/mLPI避光染色
30 min后上机检测毛兰素对细胞周期分布的影响.
1.6 蛋白提取与Western blot
采用RIPA裂解法提取药物处理后细胞总蛋白，Western
blot参见文献[13~14]. 简言之，在50~80 μg总蛋白中加入 适
量4xSDS-PAGE上样缓冲液并于100 ℃条件下变性5 min，8%
SDS-PAGE电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶
粉封闭后，先后用于抗PARP、Mcl-1、Phospho-Akt等一抗抗
体孵育过夜以及辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗抗体孵
育，采用ECL法通过X-光片曝光显影从而检测相应蛋白表达，
免疫印迹最后经洗涤后用ß-actin作为内参确定其蛋白上样.
1.7 统计学分析　
采用T检验与随机区间实验方差统计分析所有实验数
据，P<0.05被认为具有显著差异性.
2 结果与分析
2.1 毛兰素对人肝癌细胞生长的抑制作用
为了测定毛兰素对人肝癌细胞的增殖影响，通过不同浓
图1 毛兰素的化学结构
Fig. 1 Chemical structure of erianin
图2　毛兰素对肝癌细胞的增殖抑制作用
Fig. 2 The inhibitory effects of erianin on Huh7
图3 毛兰素诱导Huh7细胞凋亡（放大倍数×400）
Fig. 3 Erianin induces apotosis of Huh7 cells
A：活细胞形态学观察；B：DAPI染色
A: Live cell morphology under phase-contrast light microscope; B: DAPI
staining of nuclear morphology under fl uorescence microscope
664 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
度毛兰素对人肝癌细胞Huh7以及正常肝细胞L02进行药物处
理，培养48 h后，MTT法测定其细胞活性. 图2-A清楚表明，毛
兰素对Huh7细胞具有显著的抑制作用，处理48 h的IC50为37.4
nmol/L（P<0.05），但对正常肝细胞L02则明显没有抑制作用.
因此接下来重点考察毛兰素对Huh7细胞的抗癌活性及相关
分 子机制研究，图2-B表明不同浓度毛兰素处理Huh7细胞1
d、3 d、5 d后对其细胞增值的抑制作用具有明显的时间与浓
度效应关系.
2.2 毛兰素诱导Huh7细胞的凋亡
细胞形态学研究表明，经毛兰素处理24 h后的人肝癌
Huh7细胞生长明显受到抑制，贴壁数目大为减少，出现细胞
典型的凋亡形态学特征变化，如细胞体积缩小，连接消失，
与周围的细胞脱离，细胞质密度增加以及细胞核固缩直至碎
裂等（图3）.
2.3 毛兰素对细胞周期分布的影响
为探明毛兰素是否会干扰细胞周期的进程，流式细胞
仪分析Huh7细胞在0.1% DMSO对照以及19.6 nmol/L、39.3
nmol/L和78.5 nmol/L毛兰素处理后的细胞周期分布状况. 图
4表明不同浓度毛兰素处理24 h后G2-M期细胞百分比例随着
毛兰素剂量增加而增加，表明毛兰素能诱导G2-M期阻滞从
而抑制肿瘤细胞生长.
2.4 Western blot检测毛兰素对PARP、Mcl-1、Phospho-
Akt蛋白的表达
为进一步阐明毛兰素诱导肝癌细胞凋亡的分子机制，
通 过 采用 不同浓 度毛 兰 素处 理 Huh7细胞 24 h以及在 39.3
nmol/L同一浓度下处理Huh7细胞4 h、8 h、16 h及24 h并提取
相应细胞总蛋白，通过Western Blot检测其对PARP、Mcl-1及
Phospho-Akt表达的影响. 图5表明，78.5 nmol/L毛兰素显著诱
导Huh7细胞poly(ADP-ribose)polymerase（PARP）经Caspase切
割为Mr 89×103的降解产物，且毛兰素诱导的PARP切割活性
以剂量依赖方式促进细胞凋亡；与此同时，Huh7 细胞在39.3
nmol/L毛兰素处理24 h后更为明显，表明毛兰素诱导细胞凋
亡亦具 有明显的时间依赖效应，这与之前MTT法所测结果
相吻合；此外，78.5 nmol/L毛兰素能以明显的剂量及时间依
赖方式抑制Akt激酶的活性并且下调抗凋亡蛋白Mcl-1的蛋白
表达. 总之，毛兰素可通过抑制Akt激酶活性、下调Mcl-1表达
以及激活PARP活性等从而实现其抗癌活性.
3 讨 论
分子靶向药物是近年来肝癌等恶性肿瘤研究中的热点
与前沿. 研究表明细胞癌变的本质是细胞信号转导的失调，
大量细胞信号途径的活化加速肿瘤细胞无限增殖、浸润与
转移最终导致患者死亡，而阐明这些信号事件的网络调控机
制可为癌症的预防与治疗提供更有效的分子靶向策略. 实践
业已证明分子靶向治疗理论的可行性，而新型分子靶向药物
在临床实践中也取得了显著疗效，目前肝癌病因学的研究正
在解析导致慢性肝病的物质如何引起基因损伤最终导致癌
变的作用机制. 因此作为新型分子靶向抗肿瘤药物先导化合
物重要来源之一的我国传统中药应予以重要关注. 本研究首
次报道我国特色名贵中药材石斛中活性化合物毛兰素对人
肝癌细具有显著的增殖抑制作用，并对其分子机制进行了初
步研究，结果表明毛兰素能通过诱导激活细胞凋亡、诱导细
胞周期G2-M期阻滞从而抑制肿瘤细胞生长. 但是，我们对毛
兰素化学结构与抗癌活性之间的构效关系（SAR）还知之甚
少，尚需进一步对其结构修饰后从而评价其构效关系. 尽管
已有研究表明毛兰素这类骨架化合物可以通过抑制肿瘤血
管发生从而具有抗肿瘤活性 [6~7]，但其详细精确的分子机制
和靶标研究却相当匮乏.
以细胞周期、细胞凋亡信号通路调控分 子为靶点可提
供新的肿瘤预防与治疗方法，针对细胞周期检验点、恢复p53
的活性、激活p53下游的细胞凋亡途径以及抑制PI3K-Akt信
号通路的化学药物日益成为抗肿瘤分子靶向药物研发的重
点. 多功能核酶PARP在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着
图4 毛兰素诱导细胞周期G2-M阻滞
Fig. 4 Erianin induces G2-M arrest of Huh7 cells
图5 毛兰素激活PARP活性、下调Mcl-1以及抑制Akt活性
Fig. 5 Erianin activates the cleavage of PARP, down-regulates the expression of Mcl-1 and inhibits the Akt activity on Huh7 cells
6655 期 苏 鹏等：毛兰素对人肝癌Huh7细胞的抑制作用
重要作用，激活的PARP不仅参与环境胁迫下基因组修复、
DNA复制与转录调节等修复过程，而且作为细胞凋亡核心成
员Caspase的切割底物在DNA大量受损时经切割后阻止其修
复，其过度活化使细胞能量储存耗竭以及促使线粒体释放凋
亡诱导因子AIF与细胞色素C从而导致细胞凋亡. PARP的切
割已成为细胞发生凋亡的明显标志事件 [15]；Bcl家族在细胞
凋亡的调控作用至关重要，研究表明Bcl家族成员Mcl-1在肝
癌中过量表达，其有效抑制肝癌细胞凋亡事件已得到证实，
目前针对该蛋白的靶向药物研究也十分活跃 [16]；此外，PI3K-
Akt信号通路与人类多种肿瘤的发生发展密切相关，Akt可以
调控Mcl-1/Bax复合物的形成从而控制细胞的凋亡、增殖及
细胞骨架的变化 [17]. 总之，我们研究发现，毛兰素能显著抑制
肝癌Huh7细胞增殖，且这种生长抑制效应呈明显的时间量
效关系，同时，毛兰素不仅能诱导细胞凋亡，而且也能诱导
细胞周期阻滞于G2-M期，此外，毛兰素通过抑制Akt激酶活
性、下调Mcl-1蛋白表达从而激活细胞凋亡途径可能是其抗
癌活性的初步分子机制之一，但其详细调控机制尚需深入研
究，从而为最大化合理开发利用我国特色野生濒临灭绝中药
材石斛属植物资源奠定坚实基础.
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