全 文 ：中国肿瘤2008年第17卷第6期
毛兰素诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡的实验研究
洪 卫 1,马胜林 1,杜灵彬 2,冯建国 2,凌雨田 2,牟瀚舟 2,郭 勇 3
(1.浙江省肿瘤医院,浙江 杭州 310022;2.浙江省肿瘤研究所,浙江 杭州 310022;3.浙江省中医院,浙江 杭州 310006)
摘 要:[目的]研究毛兰素诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡的机制。[方法]MTT法检测毛兰素对人胃癌
细胞 SGC-7901的增殖抑制作用,Annexin-Ⅴ/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率,PI染色法流式细
胞仪定量检测细胞周期分布变化,同时比色法检测细胞caspase-3活性变化。[结果]毛兰素能明显抑制
胃癌细胞 SGC-7901增殖,且呈浓度依赖关系,48hIC50值为 0.056μg/ml;毛兰素能诱导胃癌细胞 SGC-
7901凋亡且呈时间和浓度依赖性,使细胞周期阻滞于 S期,但未见 caspase-3激活。[结论]毛兰素能诱
导胃癌细胞SGC-7901凋亡,可能与使细胞周期阻滞于S期有关,但未见caspase-3激活。
关键词:毛兰素;胃癌细胞SGC-7901;细胞凋亡;caspase-3
中图分类号:R73-36+1 文献标识码:A 文章编号:1004-0242(2008)06-0499-03
ExperimentalStudyofErianinInducingApotosisinGastricCarcinomaSGC-7901
HONGWei,MASheng-lin,DULing-bin,etal.
毛兰素是从鼓槌石斛中分离得到的联苄类化合
物之一,由于具有类似秋水仙碱的结构,又属于考布
它丁类药物,它们可以竞争性与微管蛋白结合。近年
研究发现该药有抗肿瘤血管生成的作用,是一种比
较有前途的药物[1]。但已有的早期体外研究却发现,
这类药物的细胞毒作用与对微管蛋白聚合的抑制作
用之间并没有明显的关系。毛兰素尚有抗肿瘤多药
耐药,增加化疗药物在肿瘤内的积聚。现有体内研究
发现,以毛兰素10mg/kg剂量口服,毛兰素对小鼠肝
癌抑瘤率为 50.82%,对小鼠艾氏腹水癌抑瘤率为
51.96%。但目前未见毛兰素对实体瘤细胞的抗肿瘤
作用机制研究报道,本研究以胃癌细胞SGC-7901为
对象,对其作用机制进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均
为美国Sigma公司产品,RPMI-1640培养基为 Gibco
公司产品,Annexin-Ⅴ/PI试剂盒和 CycleplusDNA-
kit试剂盒均为美国 BD公司产品,caspase-3活性比
色法定量检测试剂盒为美国 GENMEDSCIEN-
TIFICS公司产品。毛兰素为粉剂,由浙江天皇公司
杨兵勋博士惠赠,纯度达96%,并已通过鉴定。
1.2 实验方法
1.2.1 实验材料和主要仪器
细胞培养瓶及 96孔培养板为美国 BDFAL-
CAN公司产品;超净工作台为上海力申科学仪器有
限公司;5%CO2培养箱为德国Heraeus产品;全自动
酶标仪为上海智华医学精密仪器有限公司;流式细
胞仪为美国BD公司,采用MoDiFit-2.0软件。
1.2.2 细胞株及培养
SGC-7901细胞来自浙江省肿瘤研究所细胞库,
用无支原体含20%灭活小牛血清的RPMI-1640培养
液在5%CO2、37℃饱和湿度的细胞培养箱中培养,细
胞贴壁生长,取处于对数生长期的细胞,用0.25%的胰
蛋白酶和0.02%EDTA(1∶1)消化传代并制备细胞悬液。
1.2.3 MTT法检测毛兰素对胃癌细胞 SGC-7901的
48hIC50
取对数生长期细胞接种于96孔培养板内,每孔
3×103个细胞,8个复孔,加入不同浓度的毛兰素,总
体积 200μl,培养 48h后,每孔加入 1mg/mlMTT工
作液50μl,37℃放置4h,离心2000r/min×8min,弃上
清,每孔加入150μlDMSO,震荡10min溶解结晶,全
自动酶标仪检测450nm波长、参比波长630nm处的
各孔吸光度(OD值),计算出48h半数抑制浓度(IC50)。
收稿日期:2008-03-10;修回日期:2008-05-12
通讯作者:马胜林
499
中国肿瘤2008年第17卷第6期
表2 FCM检测不同时间各组细胞周期分布(n=3)
组 别
对照组
G0/G1期
S期
G2/M期
毛兰素组
G0/G1期
S期
G2/M期
8h 24h 48h 72h
88.73±1.62☆
9.17±1.31☆
2.10±1.67
84.17±2.14☆
12.47±1.50☆
3.37±0.76
84.13±2.60△
13.77±2.35△
2.10±1.95
72.60±2.36△
24.90±3.05△
2.50±1.80
83.16±4.81△
14.80±3.54△
2.37±2.14
50.30±4.47△
47.43±3.42△
2.27±1.92
82.03±3.18☆
15.30±2.44☆
2.37±2.14
64.20±6.68☆
33.17±7.31☆
2.87±2.34
△:与对照组比较,P<0.01;☆:与对照组比较,P<0.05。
表1 不同浓度毛兰素作用胃癌细胞SGC-7901
48h后的抑制作用
毛兰素浓度(μg/ml)
0
0.0039
0.0078
0.0156
0.0312
0.0625
0.1250
OD值(x±s)
1.14±0.08
1.03±0.05
1.01±0.07
0.95±0.05
0.72±0.08
0.43±0.05
0.41±0.07
抑制率(%)
0
9.8
11.3
17.0
36.8
62.6
64.5
1.2.4 透射电子显微镜观察细胞凋亡形态
取对数生长期的培养细胞,贴壁24h,设对照
组、48hIC50毛兰素组两组,分别继续培养48h。胰酶
过消化,离心收集细胞,细胞悬浮于 2.5%戊二醛中
固定30min,1%锇酸中固定 1h,4%醋酸铀水溶液染
色30min,常规乙醇梯度脱水,将细胞置于无水丙酮∶
包埋剂(1∶1)中置换 30min,并震荡 2h,包埋剂纯浸
2h,纯包埋剂包埋,并置烘箱内聚合,37℃24h,45℃
24h,60℃48h。超薄切片(约120nm),4%醋酸铀染色
20min,枸橼酸铅染色5min。在高压80KV透射电子
显微镜下观察、照相。
1.2.5 其 它
PI染色法流式细胞仪测定细胞周期分布,An-
nexin-Ⅴ/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率,
caspase-3活性比色法定量检测,操作步骤均按说明
书进行。
1.3 统计学处理
实验中所有数据均采用x±s表示,组间分析采
用t检验。分析软件采用SPSS13.0。
2 结 果
2.1 MTT法检测毛兰素对SGC-7901抑制率
毛兰素单药对胃癌细胞 SGC-7901的生长具有
明显的抑制作用,在0~0.1250μg/ml的范围内,与浓
度呈正相关,具有浓度依赖性(见表1)。LOGIT法计
算得 48hIC50为 0.056μg/ml,而对照药物 DDP的
48hIC50为0.9μg/ml。
2.2 透射电子显微镜观察细胞凋亡形态
从透射电子显微镜摄片观察各组细胞超微结
构:对照组细胞形态大小正常,胞核大且完整,染色
质无浓缩、边聚,细胞质无浓缩,细胞器增多,胞膜表
面皱褶较多。毛兰素组细胞呈现典型凋亡形态学改
变,细胞体积缩小,胞质浓缩,细胞器减少,核固缩、
碎裂,染色质边聚,核膜成新月状,胞浆有空泡化,胞
膜表面皱褶减少,但未见到凋亡小体形成。见图1。
2.3 PI染色法流式细胞仪测定细胞周期分布
以毛兰素 0.02μg/ml处理胃癌细胞 SGC-7901,
观察不同时间点毛兰素对细胞周期分布的影响。毛
兰素组细胞周期被阻滞于S期明显。在8h时,即可
见G0/G1期细胞比例下降和 S期比例上升,差异均
有统计学意义(P值分别为0.042和0.045)。G2/M期
比例变化不大(P=0.30)。24h和48h时,毛兰素组与
对照组比较,差异更明显(P<0.01)。G2/M期比例变
化不大(分别为P=0.80、P=0.95)。72h时差异仍有统
计学意义(P值分别为0.014和0.016)。G2/M期比例
变化不大(P=0.88)。见表2。
2.4 Annexin-Ⅴ/PI双染检测细胞凋亡率
分别以毛兰素低浓度 (0.03μg/ml)和高浓度
(0.06μg/ml)作用于胃癌SGC-7901细胞,观察不同时
间点细胞凋亡率的变化,结果显示不同浓度毛兰素
作用后的凋亡率,自作用 24h开始,与对照组比较,
差异均有统计学意义(P<0.01)。但在8h时,高、低浓
度毛兰素组与对照组相比,凋亡率未见明显差异
(P>0.05)。在24h和48h,高浓度毛兰素较低浓度毛
兰素促使细胞产生很高的凋亡率,差异有统计学意
义(P<0.05),而在 72h,两组均产生更高凋亡的倾
向,但未见统计学差异(P=0.15)。在低浓度组,8h、
500
中国肿瘤2008年第17卷第6期
表3 Annexin-Ⅴ/PI双染法检测不同药物浓度
作用各时间点凋亡率(%)
组 别
对照组
低浓度毛兰素组
高浓度毛兰素组
8h
1.81±0.38
2.03±0.34★
1.93±0.18*
24h
2.30±0.15△
5.67±1.08★△▲
9.84±1.24*△▲
48h
2.55±0.05△
7.61±0.45★△▲
10.80±1.29*△▲
72h
2.36±0.30△
9.82±0.94★△
11.04±0.74*△
△:与对照组比较,P<0.01;★:低浓度组内比较,P<0.05;
*:高浓度组内,与8h比较,P<0.01;▲:高低浓度组间比较,P<0.05。
24h、48h和72h凋亡率持续增加,差异均有显著性
(P<0.05)。高浓度组24h较8h凋亡率增加,差异有
显著性(P<0.01),而在 24h、48h、72h之间均未见统
计学差异。见表3。
2.5 caspase-3活性比色法定量检测
分别以毛兰素低浓度 (0.03μg/ml)和高浓度
(0.06μg/ml)作用于胃癌SGC-7901细胞,观察毛兰素在
不同时间点对caspase-3活性的影响。波长405nm处的
吸光度值A405代表caspase-3活性的高低。见表4。
3 讨 论
本研究表明,毛兰素能明显抑制胃癌细胞SGC-
7901增殖,表现为浓度依赖性,其半数抑制浓度仅为
0.056μg/ml。毛兰素能诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡,
电镜下可见明显的凋亡特征改变,而且定量分析其
诱导细胞凋亡作用表现为时间和浓度依赖性,这表
明毛兰素对胃癌细胞 SGC-7901抗增殖作用是通过
诱导细胞凋亡实现的。
许多抗肿瘤药物能使肿瘤细胞周期阻滞于某一
时期,从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂[3]。我们的实验
研究发现,毛兰素作用胃癌细胞SGC-79018h使得
G0/G1期比例明显降低,S期细胞比例增高。由于此
时未见细胞凋亡率明显增加,因此推测,毛兰素诱导
胃癌细胞 SGC-7901发生凋亡的机制可能与细胞增
殖被阻滞于S期有关。
caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族,是细胞凋
亡的主要执行者。caspase-3被认为是多种细胞凋亡
途径的共同作用因子。已经发现某些植物中的提取
物能诱导肿瘤细胞凋亡,如韩国槲寄生中凝集素能
诱导肝癌细胞凋亡[4],桔梗属 grandiflorum的水提取
物能诱导A549细胞凋亡[5],姜黄素能诱导白血病细
胞株HL-60细胞[6]和卵巢癌K562[7]细胞凋亡,凋亡
途径都与激活caspase-3密切相关。
我们的研究结果提示,伴随毛兰素诱导的细胞
凋亡同时并未检测到caspase-3的激活。学者Cui
等[8]的报道也证实,冬凌草甲素可以诱导人乳腺癌
MCF-7细胞凋亡,表现为caspase-9依赖性,而非
caspase-3依赖性。另外,白藜芦醇诱导乳腺癌MCF-
7细胞凋亡与caspase-8和caspase-3的激活无关,但
与bcl-2、NF-kappaB下调有关[9];曲古抑菌素A也能诱
导胃癌细胞凋亡,可能与p53和bax蛋白表达增加,
bcl-2蛋白和survivin蛋白表达减少有关,并独立于
caspase途径[10]。说明有些药物诱导肿瘤细胞凋亡可以
在没有caspase参与的条件下发生,存在不依赖cas-
pase的凋亡通路。
由于细胞凋亡是一个多系统、多阶段参与的复
杂网络过程,毛兰素诱导胃癌细胞 SGC-7901凋亡的
确切机制有待进一步研究。
参考文献:
[1] GongYQ,FanY,WuDZ,etal.Invivoandinvitroevalu-
ationoferianin,anovelanti-angiogenicagent[J].EurJ
Cancer,2004,40(10):1554-1565.
[2] MaGX,XuGJ,XuLS,etal.InhibitoryefectsofDendro-
biumchrysotoxumanditsconstituentsontheHePAand
ESC[J].JChinPharmUniv,1994,25(3):188-189.
[3] CarneroA.Targetingthecelcycleforcancertherapy[J].
BrJCancer,2002,87(2):129-133.
[4] LyuSY,ChoiSH,ParkWB.Koreanmistletoelectin-in-
ducedapoptosisinhepatocarcinomacelsisassociated
withinhibitionoftelomeraseviamitochondrialcontroled
pathwayindependentofp53[J].ArchPharmRes,2002,25
(1):93-101.
[5] ParkDI,LeeJH,MoonSK,etal.Inductionofapoptosis
andinhibitionoftelomeraseactivitybyaqueousextract
fromPlatycodongrandifloruminhumanlungcarcinoma
cels[J].PharmacolRes,2005,51(5):437-443.
[6] MukherjeeNeeChakrabortyS,GhoshU,Bhatacharyya
NP,etal.Curcumin-inducedapoptosisinhumanleukemia
celHL-60isassociatedwithinhibitionoftelomeraseac-
tivity[J].MolCelBiochem,2007,297(1-2):31-39.
[7] ChakrabortyS,GhoshU,BhatacharyyaNP,etal.Inhibi-
tionoftelomeraseactivityandinductionofapoptosisby
curcumininK-562cels[J].MutaRes,2006,596(1-2):81-90.
[8] CuiQ,YuJH,WuJN,etal.p53-mediatedcelcyclear-
restandapoptosisthroughacaspase-3-independent,but
caspase-9-dependentpathwayinoridonin-treatedMCF-7
humanbreastcancercels[J].ActaPharmacolSin,2007,
28(7):1057-1066.
[9] Pozo-GuisadoE,MerinoJM,Mulero-NavaroS,etal.
Resveratrol-inducedapoptosisinMCF-7humanbreast
cancercelsinvolvesacaspase-independentmechanism
withdownregulationofBcl-2andNF-kappaB[J].IntJ
Cancer,2005,115(1):74-84.
[10]WuZQ,ZhangR,ChaoC,etal.Histonedeacetylasein-
hibitortrichostatinAinducedcaspaseindependentapop-
tosisinhumangastriccancercel[J].ClinMedJ(Engl),
2007,120(23):2112-2118.
表4 不同浓度毛兰素作用后各时间点caspase-3的A405nm值
组 别
对照组
低浓度毛兰素组
高浓度毛兰素组
8h 24h 48h 72h
0.087±0.03
0.085±0.03
0.091±0.04
0.08±0.02
0.09±0.03
0.08±0.02
0.08±0.03
0.07±0.02
0.07±0.01
0.07±0.02
0.06±0.01
0.06±0.01
注:不论是与对应时间点的对照组相比,或是同浓度组的不同时间点比较,
或高低浓度组间,A405值均未见统计学差异(P>0.05)。
501