全 文 ：352
鼓槌石斛毛兰素
诱导人结肠癌 Caco 2 细胞凋亡
崔名扬1，2，康丹丹1，和 磊1，石玉洁2，任建武1，*
(1.北京林业大学生物科学技术学院，北京 100083;
2.北京大学医学部药学院，北京 100191)
收稿日期:2016－03－04
作者简介:崔名扬(1995－) ，女，大学本科，研究方向:天然产物研究与开发，E－mail:18701590313@ 163.com。
* 通讯作者:任建武(1967－) ，男，副教授，研究方向:天然产物研究与开发，E－mail:jianwur@ sina.com。
基金项目:国家自然科学基金项目(31572149) ;国家级大学生创新创业训练计划(201510022029)。
摘 要:目的:研究毛兰素对人结肠癌 Caco－2 细胞增殖的抑制作用及其诱导细胞凋亡的分子机制。方法:采用 SＲB
法检测毛兰素对 Caco－2 细胞增殖的抑制作用，用 Hoechst33342 染色法观察细胞的形态学改变，流式细胞术检测细胞
的凋亡率和细胞周期;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞凋亡相关蛋白 Caspase－3 的表达水平。结果:与对照相
比，毛兰素能抑制结肠癌细胞 Caco－2 的增殖，且抑制率随着药物浓度与时间增加，呈剂量时间效应，48 h 半数抑制浓
度 IC50为 0.845 μg /mL;毛兰素能诱导 Caco－2 细胞凋亡，并诱导细胞周期阻滞于 G2 期;Caspase－3 活性裂解片段表达
增高。结论:毛兰素对肿瘤细胞的增殖具有一定抑制作用且通过线粒体途径诱导 Caco－2 细胞凋亡。
关键词:毛兰素，结肠癌细胞 Caco－2，细胞凋亡，鼓槌石斛
Erianin induces apoptosis of human colorectal cancer Caco－2 cells
CUI Ming－yang1，2，KANG Dan－dan1，HE Lei1，SHI Yu－jie2，ＲEN Jian－wu1，*
(1.Beijing Forestry University，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing 100083，China;
2.Peking University Health Science Center，School of Pharmaceutical Science，Beijing 100191，China)
Abstract:Objective:Growth inhibition effects of erianin on human colorectal cell line Caco－2 cells and its possible
mechanism were studied.Methods:SＲB assay was employed to evaluate the anti－proliferation effect of erianin on
Caco－2 cells.The morphological changes of treated Caco－2 cells were observed with 33342 staining.Cell cycle
distribution and the proportion of apoptotic cells were evaluated using flow cytometry.Western Blotting analysis was
used to detect the expressions of apoptosis related protein Caspase－3.Ｒesults:Erianin inhibited proliferation of
Caco－2 cells in a dose－and time－dependent manner and leaded to cell apoptosis.The IC50 value was 0.845 μg /mL
after 48 h exposure to erianin.Cell cycle was arrested in G2 phase. It was also observed that the expression of
activity fragmentation of Caspase－3 showed a significant increase.Conclusion:Erianin could inhibit the proliferation
of Caco－ 2 cells and the apoptosis of Caco－ 2 cells induced by erianin may be associated with mitochondrial
pathway.
Key words:erianin;Caco－2;apoptosis;Dendrobium chrysotoxum Lindl
中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2016)16－0352－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 16． 062
结直肠癌(Colorectal cancer，CＲC)为人类高发恶
性肿瘤，近 20 年来其发病率逐渐上升，对人类健康
造成严重威胁［1］。结肠癌患者术后 5 年生存率较低
且目前尚无治疗结肠癌的特效药，因此继续寻找高
效的抗癌药物任重道远［2－3］。众多国内外学者尝试
从天然药物中寻找能有效抑制癌细胞增殖，诱导其
凋亡的药物用于结肠癌的治疗。
石斛属(Dendrobium)是兰科植物中一个较大的
属［4］，在我国分布有 74 种和 2 变种［5］。石斛属植物
含多种化学成分，包括生物碱、酚类［6］、微量元素［7］等
成分。其药理作用广泛，在抗肿瘤、提高人体免疫力
等方面均有良好疗效［8］。鼓槌石斛(Dendrobium
chrysotoxum Lindl)为兰科石斛属草本植物，产于我国
西南部。毛兰素是从鼓槌石斛中分离得到的活性化
合物之一，研究表明此类化合物具有良好的抗肿瘤
活性，崔旭琴［1］等人研究证实了其对结肠癌细胞
SW－480 的生长抑制作用，毛兰素通过下调 XIAP、
Bcl－xL蛋白表达以及激活 Caspase－9、7、3 和 PAＲP
353
活性从而诱导 SW480 细胞凋亡。毛兰素对 HL－60
肿瘤细胞的生长、分化亦具有明显抑制作用，并且
在镜下观察到细胞呈现凋亡形态学特征［9］，毛兰素
能通过调节 Akt激酶活性、下调 Mcl－1 蛋白表达的
方式诱导肝癌细胞 Huh7 凋亡［10］，亦有研究表明毛
兰素对胃癌细胞 SGC－7901 生长分化具有明显抑
制作用［11］。在国外已经有实验就毛兰素和以毛兰
素为底物的衍生物 ZJU－6 的抗肿瘤效果进行比
较［12］，但毛兰素对结肠癌 Caco－2 细胞增殖的作用
尚未有报道，因此本文探讨了鼓槌石斛毛兰素对
Caco－2 细胞的生长抑制作用及凋亡诱导作用，为
深入开展石斛抗肿瘤活性物质基础及其分子机制
研究提供参考，对于石斛属资源的合理开发利用具
有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
Caco－2 人结肠腺癌细胞 由北京大学医学部药
学院张强老师惠赠;毛兰素 纯度大于 99.99%，浙
江天 皇 药 业 有 限 公 司;MEM 培 养 液 Gibco
(C11095500BT) ;TCA(三氯醋酸) 天津市永大化
学试剂有限公司;SＲB(磺酰罗丹明 B) Sigma
(1014409) ;JC－1、Hoechst 33342、Annexin V－ FITC /
PI双染法细胞凋亡检测试剂盒、ＲNA 酶、PI(碘化丙
啶)、Caspase－3 活性检测试剂盒、Triton X－100(聚乙
二醇辛基苯基醚)、Caspase－3、辣根过氧化物酶标记
山羊抗兔 IgG(H + L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗
小鼠 IgG(H + L) 碧云天生物试剂公司;BCA 试剂
盒 南京建成生物科技有限公司;硝酸纤维素膜(NC
膜) 武汉博士德生物工程有限公司。
CO2 细胞培养箱 日本三洋公司;IM200－FL 倒
置荧光显微镜 北京冠普佳科技有限公司;Multiskan
Mks型酶标仪、Multifuge 1L－Ｒ 高速冷冻离心机 美
国 Thermo electron 有限公司;TD25－WS 台式多管低
速离心机 长沙平凡仪器仪表公司;DYY－7C 电泳
仪 北京市六一仪器厂;转膜仪 美国伯乐公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 用含 10%胎牛血清的 MEM 培养
基(100 U /mL青霉素、100 mg /mL链霉素)于 37 ℃、
5% CO2 条件下进行细胞培养，0.25%胰蛋白酶消化，
传代。
1.2.2 SＲB 法测定毛兰素对细胞的抑制率 接种
4 × 103 个对数期的 Caco－2 细胞于 96 孔细胞培养板
上，铺板 24 h后分别加入不同浓度毛兰素(0.01875、
0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 μg /mL)和 1 个空白
组，3 个时间点(24、48、72 h) ，至 24、48、72 h 药物处
理时间点后弃去培养液，每孔加入 200 μL 4 ℃
(10%)TCA(三氯醋酸)固定细胞，4 ℃，固定 1 h;固
定结束后用去离子水冲洗 5 次，室温晾干，每孔加入
100 μL SＲB染液，染色 30 min后弃去，用 1%乙酸冲
洗 5 次，室温干燥，用 100 μL 非缓冲 Tris－base 碱液
(10 mmol /L，pH =10.5)溶解未与细胞蛋白结合的染
料，水平摇床上振荡 30 min，采用酶标仪在 540 nm处
测定其 OD值并计算 IC50，计算细胞抑制率:
抑制率(%)=( (空白对照组 OD值－实验组 OD
值)/(空白对照组 OD值) )× 100
1.2.3 观察细胞形态 接种 5 × 105 个对数生长期的
Caco－2 细胞于 12 孔板中，铺板 24 h 后，加入不同浓
度的毛兰素，设置 0.6、1.2 μg /mL 2 个浓度的毛兰素
加药组和 1 个空白组，给药 48 h 后弃去培养液，用
PBS洗 2 次，显微镜下观察，拍照(放大 200 倍)。
1.2.4 共聚焦荧光显微镜观察线粒体膜电位 接种
5 × 105 个对数生长期的 Caco－2 细胞于 35 mm 的共
聚焦小皿上，铺板 24 h 后，加入不同浓度的毛兰素，
设 0.6、1.2 μg /mL 2 个浓度和 1 个空白组，给药 48 h
后弃去培养液，用 PBS 洗 2 次，每次 2 min，然后加入
冷的 4%多聚甲醛 1 mL，室温固定 15～20 min，之后
用 PBS 洗 2 次，加入 5 μg /mL 的 JC－1 37 ℃染色
15 min，PBS洗 2 次，加 500 μL PBS观察拍照检测。
1.2.5 共聚焦荧光显微镜观察细胞核形态 接种
5 × 105 个对数生长期的 Caco－2 细胞于 35 mm 的共
聚焦小皿上，铺板 24 h 后，加入不同浓度的毛兰素，
设 0.6、1.2 μg /mL 2 个浓度和 1 个空白组，给药 48 h
后弃去培养液，用 PBS 洗 2 次，每次 2 min，然后加入
冷的 4%多聚甲醛 1 mL，室温固定 15～20 min，PBS洗
两次，加入 2 μg /mL 的 Hoechst 33342 染色 30 min，
37 ℃，染色后 PBS洗 2 次，加 500 μL PBS上机检测。
1.2.6 Annexin－V /PI法检测细胞凋亡 在 6 孔细胞
培养板上接种 5 × 105 个对数生长期的 Caco－2 细胞，
铺板 24 h后，分别加入不同浓度的毛兰素，设 0.15、
0.3、0.6、1.2 μg /mL 4 个浓度和 1 个空白组，48 h后收
集细胞，将细胞培养液吸出弃去，用 1 × PBS 洗涤一
次，胰酶消解贴壁细胞，1000 r /min 离心 5 min，弃上
清。用预冷的 PBS 重悬细胞 2 次，加入 400 μL ×
Binding Buffer轻轻重悬细胞。加入 5 μL 的 Annexin
V－ FITC 轻轻混匀，室温下避光孵育 15 min。加入
10 μL PI(碘化丙啶)染色液，混匀，避光染色 5 min，
1 h内上流式细胞仪检测。
1.2.7 流式细胞术测定细胞周期分布 接种 1 × 106
个对数生长期的 Caco－2 细胞于 6 孔细胞培养板上，
铺板 24 h 后，加入不同浓度的毛兰素，设 0.15、0.3、
0.6、1.2 μg /mL 4 个浓度和 1 个空白组，48 h 后收集
细胞，经 75%冰乙醇－20 ℃过夜固定后，用 PBS 洗涤
2 次，加入 ＲNA 酶，终浓度为 100 μg /mL，37 ℃酶解
30 min，移入流式管，然后加 300 μL PI(含 0.1%的
Triton X－ 100(聚乙二醇辛基苯基醚) ) ，避光染色
5 min，上机检测毛兰素对细胞周期分布的影响。
1.2.8 Western Blot检测毛兰素对 Caspase－3 蛋白表
达的影响 采用 PMSF 裂解法提取药物处理后的细
胞总蛋白［13］。简而言之，在 50～80 μg 总蛋白中加入
适量 4 × SDS－PAGE 上样缓冲液，并于 95 ℃条件下
变性 5 min，5% ～15% SDS－PAGE电泳分离后转移到
NC膜上，经 5%脱脂奶粉封闭后，用于抗 Caspase－3
一抗抗体孵育过夜以及辣根过氧化物酶(HＲP)偶联
的二抗抗体孵育，采用 ECL法通过 X－光片曝光显影
从而检测 Caspase－3 蛋白表达，免疫印迹最后经洗涤
后用 β－actin作为内参确定蛋白上样量。
1.2.9 统计学分析 结果以均数 ± 标准差表示，
354
SPSS 13.0 统计分析软件进行数据分析，p ＜ 0.05 差异
有显著性意义，p ＜ 0.01 差异有非常显著性意义。
2 结果与分析
2.1 SＲB法检测毛兰素对细胞抑制作用
图 1 所示表明，药物作用时间相同时，给药 24 h
后，随着毛兰素浓度的增加，毛兰素对 Caco－2 细胞
的抑制率由 6.67%上升至 38.21%;给药 48 h 后，抑
制率由 16.5% 上升至 65.69%，并求得 48 h IC50为
0.845 μg /mL;给药 72 h后，抑制率由 22.38%上升至
82.16%，表明毛兰素对 Caco－2 细胞的抑制率随着药
物浓度的增加而升高。同样，当药物浓度相同时，随
着作用时间的延长，毛兰素对 Caco－2 细胞的抑制率
也呈现明显的升高趋势。表明毛兰素对细胞的增殖
抑制作用具有剂量时间效应。
图 1 毛兰素对 Caco－2 细胞的抑制作用
Fig.1 The inhibition of erianin on Caco－2
2.2 毛兰素对细胞形态的影响
如图 2 所示，显微镜可以看到对照组细胞密度
大、细胞边缘光滑且贴壁性好。给药组细胞随给药
浓度增大细胞生长缓滞，细胞数量比对照组少，连接
消失、细胞间隙增大，皱缩成团，随着药物浓度增加
漂浮细胞较多，死亡数量增加，并且细胞贴壁紧实程
度下降出现细胞典型的凋亡形态特征。
2.3 共聚焦荧光显微镜检测细胞膜电位水平
JC－1 是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料，可
跨膜进入活细胞内定位于线粒体膜上，特异性地与
线粒体内膜结合，只在细胞发生凋亡线粒体膜电位
崩解时才释放出来，呈绿色荧光［14］，见图 3。由图 3
可知，对照组细胞呈明显的橙色，随着给药浓度增
加，给药组细胞线粒体膜的绿色荧光信号逐渐增强，
线粒体膜电位崩解，表明药物对细胞的凋亡诱导作
用随给药浓度增大逐渐增强。
2.4 毛兰素对细胞核形态的影响
细胞核形态变化如图 4 所示，经毛兰素处理
48 h后，Caco－2 细胞的生长增殖状态明显受到药物
影响而产生抑制作用，由图中可以看出 Caco－2 细胞
已经出现了凋亡细胞会产生的典型形态学特征变
化，如细胞的体积减小，细胞质的密度增加以及细胞
核固缩直至碎裂等状态，图中箭头指的是破裂的细
胞核，随着药物浓度增加，可以看出破碎细胞核量
增加。
2.5 毛兰素对细胞凋亡率的影响
分别以不同浓度的毛兰素作用于 Caco－ 2 细
图 2 毛兰素对细胞形态影响(400 ×)
Fig.2 The effect of erianin on cell morphology(400 ×)
图 3 毛兰素对线粒体膜电位的影响
Fig.3 Impact of erianin on mitochondrial membrane potential
图 4 毛兰素对细胞核形态影响
Fig.4 The effect of erianin on nuclear morphometry
胞，给药 48 h后，观察药物作用后细胞凋亡率的变
化与对照组比较(图 5) ，毛兰素浓度为 0.15、0.3、
0.60、1.20 μg /mL 时，总凋亡率分别为 14.08%、
29.26%、37.48%、53.02%，凋亡率依次增加，由表 1
355
可知，早期凋亡率和晚期凋亡率也随浓度增加而
升高。
图 5 毛兰素对细胞凋亡的影响
Fig.5 Effect of erianin on apoptosis rate of Caco－2 cells
注:Q1 代表早期凋亡，Q2 代表晚期凋亡。
表 1 人结肠癌细胞 Caco－2 凋亡率
Table 1 Apoptosis rate of Caco－2 cells
毛兰素浓度
(μg /mL)
早期凋亡率
(48 h)
晚期凋亡率
(48 h)
0 3.94 ± 0.64 1.31 ± 0.23
0.15 7.06 ± 0.74 5.7 ± 0.96＊＊
0.3 12.8 ± 1.04＊＊ 16.7 ± 1.73＊＊
0.6 13.84 ± 2.04＊＊ 22.1 ± 1.71＊＊
1.2 23.7 ± 2.47＊＊ 29.4 ± 1.58*
注:* p ＜ 0.05，＊＊ p ＜ 0.01，与 0 μg /mL 毛兰素空白对照组
比较。
2.6 毛兰素对细胞周期分布的影响
为探明毛兰素对细胞周期的影响，利用流式细
胞仪分析 Caco－2 细胞在对照组以及 0.15、0.3、0.60、
1.20 μg /mL毛兰素处理后的细胞周期分布的状况。
由图 6 可知，不同浓度的毛兰素处理 Caco－2 细胞
48 h后，细胞周期被阻滞于 G2 期，随着毛兰素浓度
的增加，可见 G1 期细胞比例下降以及 G2 期比例上
升，表明毛兰素能诱导 G2 期阻滞从而抑制 Caco－2
细胞生长。
2.7 Western Blot检测 Caspase－3 的表达
为进一步探明毛兰素诱导结肠癌细胞 Caco－2
凋亡的分子机制，用 0(空白对照组)、0.6、1.2 μg /mL
图 6 毛兰素对细胞周期的影响
Fig.6 Influences of erianin on on cell cycle
毛兰素处理 Caco－2 细胞并提取细胞总蛋白，通过
Western Blot 检测其对 Caspase－3 蛋白表达的影响。
由图 7 可知，0.6、1.2 μg /mL 毛兰素处理细胞后发现
Caspase－3 被剪切的 17 ku 小分子活性片段，表明
Caspase－3 被激活，而未加药组未见被剪切的 17 ku
小分子活性片段。正常情况下细胞中的 Caspase－3
无活性，以酶原(Procaspase－3)的形式存在，当细胞
接受凋亡刺激时，它被系列反应激活被剪切为 17 ku
(Cleaved caspase－3)的活性小分子片段，进而诱导细
胞发生凋亡［15－16］，由结果可见药物处理细胞后
caspase－3 被剪切为 17 ku 的小分子片段，表明毛兰
素可能是通过线粒体途径诱导细胞凋亡的，但其具
体的分子调控机制则尚需近一步研究。
图 7 毛兰素对 caspase－3 活性影响
Fig.7 Effect of erianin on caspase－3 activity
注:条带由左至右依次为 0 μg /mL对照组、
毛兰素浓度 0.6、1.2 μg /mL。
3 讨论与结论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是一个非常复
杂的调控过程［1］，近年来成为肿瘤治疗的研究热点，
细胞在多种调控因子的共同作用下引起凋亡，在这
个过程中细胞发生紧缩、膜上起泡、核染色质固缩于
边缘、DNA片段化等。很多的抗肿瘤药物，例如化疗
药物、激素都能够引起肿瘤细胞发生凋亡［17］。肿瘤
细胞的死亡大部分是通过凋亡发生的，凋亡对肿瘤
的抑制起到重要作用。研究表明，哺乳细胞中有三
条信号通路导致凋亡的发生［18］，分为内源信号通路、
外源信号通路与内质网通路，内源信号通路是通过
线粒体调控，因此也叫做线粒体通路。参与内源信
号通路的蛋白包含 Bcl－2 家族蛋白、Caspase 家族蛋
白等［19］，其中 Caspase－3 是线粒体通路重要的执行蛋
白，是调控细胞凋亡的重要因子，Caspase－3 被剪切
活化后大致通过以下 3 种机制诱导细胞凋亡［20］:酶
解凋亡抑制物，如 Bcl－2 蛋白家族中的抗凋亡蛋白
Bcl－2 等;酶解细胞外基质，如细胞周期素依赖性激
酶抑制因 P21 等;剪切失活 DNA 修复因子，如 PAＲP
(多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)。在细胞受到药物刺
356
激后线粒体跨膜电位崩解、线粒体基质内渗透压升
高、内膜肿胀［21］，诱使位于线粒体膜间隙的细胞色素
C释放到胞浆中，而释放到胞浆中的细胞色素 C 结
合凋亡蛋白酶活化因子 Apaf－1 形成复合体，激活
Caspase连级反应激活下游的 Caspase－3，从而诱导
细胞凋亡［22－24］，实验中经毛兰素处理的细胞中检测到
Caspase－3 被剪切激活的 17 ku(Cleaved caspase－3)
小分子片段，同时也检测到细胞线粒体膜电位的改
变，表明毛兰素可能是通过影响线粒体功能，引起线
粒体跨膜电位改变激活 caspase－3 活性进而诱导细
胞凋亡的。
综上所述，本研究证明毛兰素在一定程度上能
抑制 Caco－2 细胞的增殖，呈时间剂量效应，能诱导
Caco－2 细胞凋亡，诱导胞内线粒体膜电位的改变及
诱导细胞周期阻滞于 G2 期，同时 Western Blot 检测
到 Caspase－3 被激活活性片段，表明毛兰素可能是通
过线粒体途径诱导细胞凋亡的，但其诱导细胞凋亡
是否有其他通路的参与尚需进一步实验证明，同时
毛兰素化学结构与抗癌活性之间的相互关系尚需深
入研究。
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