全 文 ：第 36卷　第 2期
2000年 3月 　　　
南京大学学报(自然科学)
JO URNAL OF NANJING UNIVERSITY
(NATURAL SCIENCES)
　　　　Vol.36 , No.2
M ar., 2000
文章编号:0469-5097(2000)02-0197-05
榄仁树叶提取物(LR-98)对实验性肝损伤的防护作用
徐力致1 ,高　静1 ,朱　俐2 ,徐　曼1 ,卢是月3 ,赵晓宁1 ,张祖暄1
(1.南京大学医学院 ,江苏 南京 , 210093;2.南通医学院 , 江苏 南通 , 226001;
3.南京军医学院 ,江苏 南京 , 210099)
摘　要:　采用生化检测并结合形态学观察 , 研究了榄仁叶提取物(LR-98)对小鼠实验性化学
肝损伤的防护作用.发现在急性肝损伤实验中 , LR-98 能对抗四氯化碳(CCl4)引起的肝细胞核
膜皱缩 、周边异染色质增加 、核固缩及髓鞘样变化等亚微结构的病理学改变.LR-98 不仅显著
剂量依赖性抑制 CCl4 所致小鼠血清谷丙转氨酶(sGPT)活性的升高 ,完全阻抑 CCl4所致小鼠肝
组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性的下降 , 且可完全逆转 D-氨基半乳糖(D-GalN)诱发的
sGPT活性的升高.在慢性肝损伤(肝硬化)实验中 , 高剂量 LR-98 可完全逆转由 CCl4 所致 sGPT
活性 、肝羟脯氨酸含量的显著增高 , 以及 SOD 活性的下降.结果表明 , LR-98 对急慢性肝损伤
有良好的防护作用 ,其机理可能与抗脂质过氧化有关.
关键词:　血清谷丙转氨酶;超氧化物歧化酶;羟脯氨酸;四氯化碳;D-氨基半乳糖;肝损伤
中图分类号:　Q42 文献标识码:　A
肝病是一种严重危害人类健康的传染病 ,我国每年由于患肝炎转化成肝硬化最终死于
肝癌的人数明显增加 ,控制肝病已成为当务之急.近年来治疗肝病的药物不断涌现 ,肝炎疫
苗的研究亦有进展 ,但至今仍缺乏安全 、专一 、毒副作用低 、价廉的特效药.据调查 ,东南亚民
间 ,尤其在菲律宾 ,常用榄仁树叶防治肝病 ,因此该地区的肝病发病率甚低.榄仁树为诃子属
(Terminalia)植物 ,对其护肝作用的研究已经开始[ 1] ,而其生物活性成分尚未进行系统研究.
本文观察榄仁树叶提取物(LR-98)对小鼠实验性急 、慢性化学性肝损伤的防护作用.
1　材料和方法
1.1　试验动物　昆明种小白鼠(雄性),体重(20±2)g ,购自南京铁道医学院实验动物中
心.动物质量号:97003.
1.2　实验材料　谷丙转氨酶(GPT)试剂盒 、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒 、羟脯氨酸试剂
盒均购自南京建成生物工程研究所;D-氨基半乳糖(D-GalN)购自 Sigma 公司;四氯化碳
(CCl4)为上海长江化学试剂厂产品 ,用植物油配成 1%;LR-98由南京大学医学院药物研
究所提供.
1.3　方法　实验分为急性和慢性肝损伤两组
急性组:对照组生理盐水灌胃 0.2mL/d ,连续 7 d ,第 8 d腹腔注射植物油每只 0.3mL;
CCl4 组等量生理盐水连续灌胃 7 d ,第 8 d腹腔注射 0.1%CCl4 每只 0.3 mL;给药组不同剂
基金项目:江苏省自然科学基金(No:BK99051)资助项目收稿日期:1999-06-21作者简介:徐力致 ,女 , 1972年生 ,助理工程师 , 1996年毕业于南京大学生物化学系生物化学专业 ,曾发表“ IM-94增强小鼠免疫功能的实验研究”等论文.
量(50 、200 、500 mg/kg)LR-98灌胃连续 7 d ,第 8 d腹腔注射0.1%CCl4 每只 0.3mL 或D
-GalN(800 mg/kg)[ 2] .于末次给药后 24 h眼眶取血 ,离心分离血清 ,按赖氏法测定 sGPT .
然后断颈处死小鼠 ,生理盐水心脏灌流 ,取出肝脏 ,滤纸吸干 ,称重 ,制备肝匀浆 ,3 500 r/min
离心 10 min ,取上清 ,按羟胺法测定 SOD活力.
形态学观察按常规方法制备肝组织超薄切片[ 3] ,透射电镜观察.
慢性组:对照组生理盐水灌胃 0.2 mL/d ,每周 2次腹腔注射植物油每只 0.2 mL;CCl4
组每周两次腹腔注射 0.1%CCl4 每只 0.2mL ,其余同对照组;给药组不同剂量(50 、200 、500
mg/kg)LR-98每日灌胃一次 ,其余同 CCl4 组.5周后 ,取血清测定 sGPT 活力 ,取肝匀浆测
SOD活性 ,将肝组织脱水脱脂 ,制成肝粉 ,水解.根据羟脯氨酸的氧化产物与二甲氨基苯甲
醛作用的呈色反应 ,在 550 nm处比色 ,测定羟脯氨酸含量.
2　结果
A.Nuclear membrane shrinking , condensed heterochromatin increasing
(A1) and medullary sheath-like structure(A2) obser ved in CCl4-in-
duced liver damage;B.Preteatment of 0.5 g/ kg LR-98 for 1 week
before the injection of CCl4;C.Normal liver cell
图 1　LR-98对抗 CCl4 所致的急性肝损伤的细胞超微结构的变化
Fig.1　Hepatoprotective activities of LR-98 on CCl4 induced ultra-
structural changes in acute liver injury
2.1　LR-98对小鼠急性肝损
伤的防护作用
2.1.1　形态学观察　由图 1
可看出 ,CCl4 急性肝损伤组 ,肝
细胞核固缩 ,细胞核膜起皱 ,周
边异染色质增加(A1), 细胞内
出现髓鞘样病理变化(A2).预
先给予 LR-98(500 mg/kg)的
动物(B),能对抗 CCl4 所致的
上述病理学变化 , 与正常对照
组(C)基本一致.
2.1.2　LR-98 对 CCl4 致小
鼠急性肝损伤的防护作用　由
表 1可看出 ,小鼠腹腔注射 1%
CCl4后 , sG TP 水平显著增高 ,
约为正常对照组的 8 倍 , SOD
明显下降 ,降幅为 43%,均有显
著差异(P <0.01).预先灌胃
LR-98 后 ,各剂量 LR-98 均
可完全对抗上述 SOD 活性的
降低 ,而对 sGPT 活性的影响则
呈剂量依赖关系.500 mg/kg
LR-98可完全对抗 CCl4 诱发
的 sGPT 的显著升高.另外 , LR
-98本身不影响小鼠 SOD 及
sGPT 的活性.
·198· 南京大学学报(自然科学) 第 36 卷
表 1　LR-98对 CCl4 诱导的急性肝损伤的保护作用
Table 1　Protective effects of LR-98 on CCl4-induced acute liver damage(x-±s)
Groups
animals
(n)
SOD activity
(enzyme unit/ g liver)
sGPT activity
(enzyme unit/ 100 mL serum)
Control 10 1 970.1±52.6 20.98±8.67
CCl4 9 1 143.4±49.7a 161.57±26.64b
CCl4+LR-98(50 mg/ kg) 8 1 961.9±90.6b 53.47±24.47b
CCl4+LR-98(200 mg/ kg) 8 1 996.9±34.2b 39.70±17.07b
CCl4+LR-98(500 mg/ kg) 8 2 124.4±35.4ab 19.01±10.40b
LR-98(50 mg/ kg) 8 2 019.6±51.5b 12.03±7.24b
LR-98(200 mg/ kg) 11 2 114.1±29.3ab 11.37±3.88b
LR-98(500 mg/ kg) 9 2 128.0±33.8ab 15.15±4.63b
　　aP<0.01 vs control , bP<0.01 vs CCl4 group
2.1.3　LR-98对 D-GalN 致小鼠肝损伤的保护作用 　由表 2 可看出 , 小鼠腹腔注射
800 mg/kg D-GalN后 , sGPT 水平显著增高 ,为正常对照组的 3.35倍(P <0.01).小鼠预
先灌胃 LR-98后 ,各剂量组 LR-98均可显著降低 D-GalN 所致 sGPT 水平增高 ,效果与
联苯双酯相似.
表 2　LR-98 对 D-GlaN诱导的急性肝损伤的保护作用
Table 2　Protective effects of LR-98 on D-GlaN- induced acute hepatic injury(x-±s)
Groups
animals
(n)
sGPT activity
(enzyme unit/100 mL serum)
Control 9 31.24±3.16
D-GalN 9 104.83±39.98a
D-GalN+diphenyl diester 7 37.80±7.21b
D-GalN+LR-98(50 mg/kg) 10 31.43±6.51b
D-GalN+LR-98(200 mg/ kg) 9 36.51±10.60b
D-GalN+LR-98(500 mg/ kg) 9 36.91±9.15b
　　aP<0.01 vs control , bP<0.01 vs CCl4 group
2.2　LR-98对 CCl4 致小鼠慢性肝损伤(肝硬化)的防护作用　由表 3 可看出 ,CCl4 所致
小鼠慢性肝损伤引起 sGPT 水平显著增高 ,约为正常对照组的 3.78倍 ,羟脯氨酸含量约为
正常对照组的 1.79倍 ,SOD明显下降 ,降幅为 12%,差异显著(P <0.01).其中高剂量 LR
-98(500 mg/kg)可完全逆转 CCl4所致上述 sGPT 、羟脯氨酸和 SOD的变化 ,而 500 mg/kg
LR-98连续 5周灌胃对正常小鼠各指标无明显影响.
·199·　第 2 期 徐力致 ,等:榄仁树叶提取物(LR-98)对实验性肝损伤的防护作用
表 3　LR-98 对 CCl4诱导的慢性肝损伤(实验性肝硬化)的保护作用
Table 3　Protective effects of LR-98 on CCl4-induced chronic liver
damage(experimental hepatocirrhosis , x-±s)
g roups
animals
(n)
SOD activity (en-
zyme unit/ g liver)
sGPT 活 性 (en-
zyme unit/100 mL
serum)
liver hydroxypro-
line(enzyme unit/
100 mL serum)
Control 8 1 976.1±36.4 12.8±3.7 0.024±0.005
CCl4 9 1 746.3±77.3a 48.4±12.6a 0.042±0.004a
CCl4+LR-98(50 mg/kg) 8 1 828.7±95.4 26.9±4.7c 0.030±0.013b
CCl4+LR-98(200 mg/ kg) 7 1 870.0±90.3b 29.0±4.4c 0.041±0.015
CCl4+LR-98(500 mg/ kg) 10 1 957.4±46.8c 11.2±1.6c 0.023±0.004c
LR-98(500 mg/ kg) 8 1 991.6±46.8c 11.2±1.6c 0.023±0.004c
　　aP<0.01 vs control , bP<0.05 vs CCl4 group , cP<0.01 vs CCl4 group
3　讨论　
CCl4 诱发的急慢性化学性肝损伤实验模型被广泛应用于护肝药物的研究中.脂质过氧
化是 CCl4 造成肝损伤的主要机制 , CCl4 经肝微粒体细胞色素 P-450 酶激活后生成
·CCl3 ,·CCl3可致肝细胞膜磷脂分子产生脂质过氧化[ 4] .脂质过氧化破坏了细胞结构和功能
的完整 ,表现为膜的流动性降低 ,对 Ca2+的通透性增加.细胞内 Ca2+浓度升高加速黄嘌呤
氧化酶合成 ,激活磷脂酶 ,并促进 ATP 降解而造成次黄嘌呤堆积 ,致超氧阴离子自由基
O2·-及脂质过氧化物 LPO增高 ,引起肝细胞膜结构和功能的损伤 ,从而使 sGPT 升高.本实
验结果表明 ,在急慢性肝损伤实验中 , CCl4均可引起 sGPT 活性的显著升高和 SOD活性的
明显降低.在慢性肝损伤实验中还观察到羟脯氨酸含量的明显升高.羟脯氨酸为胶原所特
有 ,测定肝羟脯氨酸含量可反应肝硬化程度[ 5] .D-GalN 是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰
剂.D-GalN 诱发急性肝损伤病理学表现为肝细胞弥漫性变性 、坏死 、大量炎性细胞浸润 ,
与临床病毒性肝炎病理变化极为相似[ 6] .对 LR-98的观察研究证明 ,各剂量 LR-98单独
服用(可长达 5周)均不影响正常小鼠的 sGPT 活性 、SOD活性等各项指标.而预服 LR-98
可预防CCl4 和D-GalN诱发的各种肝损伤.提示 , LR-98可能成为防护急性肝损伤 、病毒
性肝炎及肝硬化的有效药物.详细机制及其有效成分的分析 、鉴定正在作进一步研究.
参　考　文　献
[ 1] 　Lin C C , Hsu Y F , Lin T C , et al.Antiox idant and heptoprotective activity of punicalagin and punicalin
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[ 2] 　党月兰.红毛五加多糖对实验性肝损伤的保护作用 [ J] .中国中药杂志 , 1997 , 22(3):176.
[ 3] 　汪谦.现代医学实验方法 [ M] .北京:人民卫生出版社 , 1997.1.
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[ J] .中国中医药科技 , 1998 , 5(2):93.
PROTECTIVE EFFECTS OF LR-98 ON HEPATOTOXICITY
INDUCED BY CARBON TETRACHLORIDE AND
D-GALACTOSAMINE IN MICE
XU Li-zhi 1 , GAO Jing1 , ZHU Li 2 , XU Man1 ,
Lu Shi-yue3 , ZHAO Xiao-ning1 , ZHANG Zu-xuan1
(1.Schoo l of Medicine , Nanjing University , Nanjing , 210093 , China;2.Nantong Medical College ,
Nantong , 226001 , China;3.Nanjing M ilitary Medical Co llege , Nanjing , 210099 , China)
Abstract:　In the present paper , seurm g lutamic-pyruvic transaminase(sGPT), superox ide disma tase(SOD)
and liver hydroxypro line were determined to investiga te the inhibitory effects of LR-98(extract from Termina-
lia catappa L .)on carbon tetrachloride(CCl4)or D-GalN-induced acute o r chronic hepatic injury in mice.Ultra-
structural Morpholo gical changes w ere also observed under transmission electron microscope(TEM).
In acute hepatic injury trial , ①it w as found that LR-98 could prevent CCl4-induced nuclear membrane
shrinkage , condensed heterochromatin increase , kary opykno sis and medullary sheath-like structure occurrence.
②sGPT activity was significantly increased(P <0.01), and liver SOD activity was significantly reduced(P<
0.01)after intraperitoneal injection of 1% CCl4.With oral pretreatment of LR-98 for 1 w eek , changes in
sGPT could be blocked(P<0.01)in a dose-dependent manner.Furthermore , changes in SOD activity could be
comple tly inhibited by all different doses of LR-98 (P <0.01).③LR-98 could also reverse the increase in
sGPT activity induced by intraperitoneal treatment of D-GalN(800 mg/kg).
In chronic liver damages(experimental hepatocirrhosis)induced by CCl4 , both sGPT activity and liv er hy-
droxyproline content w ere significantly increased(P <0.01), w hile SOD activity was significantly reduced com-
pared to control values(P<0.01).With the oral pretreatment of LR-98 , all the above changes induced by
CCl4 could be par tly(lower dose)or completely(higher dose)blocked.But the treatment of LR-98(500 mg/
kg)alone didn t affect any parameters detected.
The above data indicate that LR-98 has hepatoprotective activity.The mechanisms underlying its pro tec-
tiv e effects may be related to antioxidant activity.
Key words:　serum g lutamic-pyruvic transaminase(sGPT);superoxide dismatase(SOD);hydroxyproline;car-
bon tetrachloride(CCl4);D-galactosamine(D-GalN);hepatic injury;Terminalia catappa L.
·201·　第 2 期 徐力致 ,等:榄仁树叶提取物(LR-98)对实验性肝损伤的防护作用