全 文 ：收稿日期:2009-02-08;　修订日期:2009-07-14
基金项目:教育部国际合作项目 “春晖计划 ”(No.Z2006-1-83003)
作者简介:李　红(1980-),女(汉族),山东漕县人 ,现任石河子大学讲师 ,
主要从事天然产物化学研究工作.
＊通讯作者简介:李炳奇(1951-), 男(汉族),山东宁津人 , 现任石河子大
学教授 ,硕士研究生导师 ,学士学位 ,主要从事天然产物研究与开发工作.
沙枣黄酮的提取及其抗氧化作用的研究
李　红 , 郅　洁 , 马彦梅 , 李炳奇＊ , 刘　红 , 龚晓武
(石河子大学 ,新疆 石河子　832003)
摘要:目的 对沙枣黄酮的抗氧化作用进行研究。方法 以 70%乙醇为溶剂 ,超声辅助法提取沙枣中的黄酮 , 用比色法测
定其含量为 0.928%;采用比色法测定沙枣黄酮对· OH、O-2·和 DPPH· 等 3种自由基的清除作用。结果 沙枣黄酮对 3
种自由基都有明显的清除作用 ,清除能力为 DPPH· >O-2· >· OH。结论 清除率与浓度存在明显的量效关系 , 当浓度
为 0.4 mg· ml-1时 ,其清除率· OH为 76.07%, O-
2
·为 79.53%, DPPH·为 93.91%。
关键词:沙枣;　黄酮;　抗氧化性
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)01-0035-02
　　沙枣 ElaeagnusangustifoliaL.T属胡颓子科(Elaeagnaceae)
胡颓子属(ElaeagltL.), 耐盐碱 、生长快 、易繁殖 , 药用价值高 ,
在新疆的塔克拉玛干沙漠及各河流沿岸(且末 、若羌 、民丰 、英吉
沙 、阿克苏)和伊犁 、托克逊等地广泛分布 [ 1] 。
黄酮类化合物具有抗癌 、抗肿瘤 、抗心脑血管疾病 、抗炎镇
痛 、免疫调节 、降血糖 、治疗骨质疏松 、抑菌抗病毒 、抗氧化 、抗衰
老 、抗辐射等作用 [ 2 , 3] 。近年来 , 世界上掀起了植物药开发的热
潮 , 植物药以其天然低毒的特点倍受青睐 , 而黄酮类化合物以其
广谱的药理作用引人瞩目。但是关于沙枣黄酮抗氧化方面的研
究尚未见报道。本研究将沙枣黄酮对 3种不同自由基的清除能
力进行了一个较为全面 、系统的研究 , 从而探讨沙枣黄酮的抗氧
化作用 , 为进一步筛选天然植物抗氧化剂奠定了一定的基础。
1　材料
1.1　试剂 乙醇(A.R), 氢氧化钠(A.R),亚硝酸钠(A.R),硝酸
铝(A.R), pH 8.2 Tris-HCl缓冲液(A.R), 0.02%双氧水(A.
R);7mmol· L-1邻苯三酚 (A.R);pH 7.4磷酸盐缓冲溶液
(PBS, A.R);1.5mmol· L-1邻二氮菲(A.R);2 ×10-4mol· L-1
的 DPPH(二苯基苦基苯肼 , Sigma公司生产)。
1.2　仪器 TDL-5型低速台式离心机(上海隆拓仪器设备有限
公司);赛多利斯电子天平(德国 Sartorius);岛津 UV-2401PC型
紫外分光光度计(日本岛津公司生产);R-200型旋转薄膜蒸发
器(瑞士 BUCHI);eppendorf手动可调程单道移液器(德国艾本
德股份公司);DL-360A型超声波清洗器(上海之信仪器有限公
司);SHZ-C型循环水真空泵(河南豫华仪器有限公司);HH-S
型恒温水浴锅(陕西太康生物科技有限公司)。
2　方法
2.1　黄酮的含量测定方法
2.1.1　对照品溶液的制备 精密称取芦丁标准品适量 , 用甲醇溶
解 , 定容于 50 ml容量瓶中 , 制得浓度为 0.2 mg· ml-1的对照品
溶液。
2.1.2　最大吸收峰的确定 精确吸取芦丁对照品溶液 2 ml, 加
5%亚硝酸钠溶液 0.3 ml, 摇匀后静置 6 min, 加 10%硝酸铝溶液
0.3ml, 摇匀后静置 6 min, 加 10%氢氧化钠溶液 4.0 ml, 用蒸馏
水定容至 10ml, 摇匀 ,放置 15min,于 400 ～ 600 nm波长处扫描 ,
结果在 510 nm处有最大吸收。
2.1.3　标准曲线的绘制 精确吸取 0.20mg· ml-1芦丁对照品溶
液 0.0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ml, 分别加入 5%亚硝酸钠溶液 0.3
ml摇匀 ,放置 6 min, 再加入 10%硝酸铝溶液 0.3 ml摇匀 , 放置 6
min,最后加入 10%氢氧化钠溶液 4.0 ml,用蒸馏水定容至 10ml,
摇匀 , 放置 15 min, 在 510 nm处测定其吸光度值。以吸收度为纵
坐标 , 对照品溶液的浓度(mg· ml-1)为横坐标 , 得线性回归方
程:Y=9.735X-0.011 5, r=0.999 9。
2.1.4　黄酮的提取 准确称取粉末 30.00 g, 按料液比 1∶10加
入 70%乙醇浸泡 30 min, 超声提取 1 h, 过滤后得滤液和滤渣。
滤渣再按上述方法提取 2次 , 浓缩 ,定溶至 50 ml容量瓶 ,作为试
样液。
2.1.5　黄酮的含量测定 取试样液 2 ml于 10 ml容量瓶中 , 加入
5%亚硝酸钠溶液 0.3 ml,摇匀 , 放置 6min;再加入 10%硝酸铝溶
液 0.3ml, 摇匀 ,放置 6min;最后加入 10%氢氧化钠溶液 4.0ml,
用蒸馏水定容至 10 ml,摇匀 ,放置 15 min;在 510 nm处测定其吸
光度值 。根据标准曲线计算得沙枣果肉黄酮含量为 0.928%。
2.2　自由基的生成及清除率的测定
2.2.1　羟自由基的生成及清除率的测定 [ 4] 精密量取 2.0 ml
PBS磷酸盐缓冲溶液 (pH=7.4, 下同)和 4.0 ml蒸馏水于试管
中 , 混匀作空白参比管;精密量取 2.0 mlPBS, 1.0 ml邻二氮菲
(1.5 mmol· L-1 , 下同)、 1.0 mlFeSO4(1.5 mmol· L-1 , 下同)
和 2.0 ml蒸馏水于试管中 , 混匀作未损伤管;精密量取 2.0 ml
PBS, 1.0 ml邻二氮菲 , 1.0 mlFeSO4 , 1.0 ml蒸馏水和 1.0 ml
H2O2(0.02%)于试管中 , 混匀作损伤管;精密量取 2.0 mlPBS,
1.0 ml样品液和 3.0ml蒸馏水于试管中 ,混匀作样品参比管;精
密量取 2.0 mlPBS、1.0ml邻二氮菲 , 1.0 mlFeSO4 , 1.0 ml黄酮
试样液和 1.0 mlH2O2于试管中 ,混匀作样品管。 将上述试管置
于恒温水锅中 , 37℃保温 60 min, 于波长 536 nm处测吸光度(A)
值 , 每种处理重复 5次 ,用其平均值按下式计算羟自由基清除率。
以 VitC作对照。
羟自由基清除率(%)=[ (A样品 -A样参)-(A损伤 -A空参 )] /
(A未损 -A损伤)×100%
2.2.2　超氧阴离子自由基的生成及清除率的测定 [ 5] 采用邻苯
三酚自氧化法 ,精密量取 Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol· L-1 ,
pH8.2)4.5 ml和 0.1 ml药液于试管中 ,混匀后在室温下平衡 4
min,然后于 325 nm处测定吸光值 Aj;精密量取 Tris-HCl缓冲
溶液 4.5 ml向其中加入 3 ml邻苯三酚(7 mmol· L-1), 反应平
衡 4 min, 于 325 nm处测得反应体系的吸光值 A
0
。 按照上述方
法 , 精密量取 4.5 mlTris-HCl缓冲溶液和 0.1 ml药液 , 混匀后
在室温下放置 4 min, 立即加入 3 ml邻苯三酚并开始计时 , 以 10
mmol· L-1 HCl为参比 , 于 325 nm处每隔 30 s测定反应体系的
吸光值 A,共记录前 6 min;实验重复 5次 , 求其平均值。按下式
计算超氧阴离子自由基清除率(I)。以 VitC作对照。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.1 时珍国医国药 2010年第 21卷第 1期
I(%)=[ (A0 -A-Aj)/A0 ] ×100%
2.2.3　DPPH·自由基的生成及清除率的测定 [ 6, 7] 取上述黄酮
试样液 2 ml及浓度为 2 ×10-4 mol· L-1的 DPPH溶液 2ml先后
加入同一具塞试管中 , 30 min后以样品提取溶剂为空白调零测定
其吸光度 Ai;测定 2 ml浓度为 2×10-4 mol· L-1的 DPPH溶液与
2 ml70%乙醇混合液的吸光度 Ac;再测定 2 ml黄酮提取液与 2
ml无水乙醇混合液的吸光度 Aj,重复 5次 , 求其平均值。根据下
列公式计算沙枣黄酮提取液对 DPPH的抑制率 , 即:抑制率(%)
=[ 1-(Ai-Aj)/Ac] ×100﹪ 。
3　结果
3.1　沙枣黄酮对羟自由基的清除作用 沙枣黄酮对羟自由基的
清除效果见图 1。
图 1　沙枣黄酮对羟自由基的清除作用
由图 1可知 , 沙枣黄酮对· OH自由基的清除作用始终表现
为浓度依赖性的清除作用 ,而且清除作用很强 , 远高于同浓度的
VitC。
3.2　沙枣黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用 沙枣黄酮对超
氧阴离子自由基的清除效果见图 2。
图 2表现的是反应开始 1 min时沙枣黄酮对 O-2·的清除作
用。由图 2可知 , 沙枣黄酮对 O-2·有较强的清除能力 , 与同等条
件下的 VitC相比 , 效果显著。当样品溶液浓度为 0.6 mg· ml-1
时 , 清除率已达到 87.62%。
图 2　沙枣黄酮对超氧阴离子的清除作用
3.3　沙枣黄酮对 DPPH· 自由基的清除作用 沙枣黄酮对
DPPH·自由基的清除效果见图 3。
以脂溶性抗氧化剂 VitE作对照 , 研究了沙枣黄酮对 DPPH·
的清除作用。结果如图 3。 由图 3可知 , 沙枣黄酮对 DPPH· 具
有很明显的清除作用 ,且清除效果随着浓度的增加而增大 , 且远
远高于同浓度的VitE。在浓度为 0.025mg· ml-1时 , 沙枣黄酮对
DPPH·的清除率已经远超过 60%。
图 3　沙枣黄酮对 DPPH·的清除作用
4　结论
本研究表明 ,沙枣黄酮对· OH、O-2·和 DPPH·均具有明显
的清除作用 , 而且对自由基的清除作用随着黄酮液浓度的增加而
增强。当浓度为 0.4 mg· ml-1时 , 其清除率 · OH为 76.07%,
O-
2
·为 79.53%, DPPH·为 93.91%。沙枣黄酮有很强的抗氧化
活性 , 对自由基的清除能力总体强弱趋势是:DPPH· >O-2· >
· OH。
沙枣在新疆蕴藏量大 , 是一种纯天然绿色野生植物。因此 ,
可以开发沙枣作为日常生活中常用的饮品 ,这对预防和治疗衰老
性疾病有一定的作用 ,而沙枣黄酮提取液对多种自由基均具有较
强的清除能力 , 因此沙枣作为一种有效的自由基清除剂 , 是我们
理想的天然抗氧化剂之一 ,具有很好的开发应用前景。
参考文献:
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