全 文 ：86 林业科技开发 2013 年第 27 卷第 5 期
doi:10． 3969 / j． issn． 1000－8101． 2013． 05． 023
桫椤原叶体增殖及幼孢子体形成试验
王辉1，2，秦建蓉1，植爽1，田娜1，肖小君1，2*
(1．内江师范学院生命科学学院，四川 内江 641112;2．四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室)
摘 要:采用正交试验，研究培养基类型、激素配比及浓度、蔗糖浓度对桫椤原叶体增殖及幼孢子体形成的影响。
结果表明: 不同 NAA和蔗糖浓度对原叶体增殖的影响差异极显著，不同 BA浓度对幼孢子体的形成影响极显著;桫
椤原叶体增殖的适宜配方为 MS + 0． 5 mg /L NAA + 0． 01 mg /L BA + 0． 1 mg /L TDZ + 20 g /L 蔗糖，增殖率为
20． 31% ;合适分化培养基为 N6 + 0． 1 mg /L NAA + 0． 5 mg /L BA + 0． 1 mg /L TDZ + 20 g /L蔗糖，分化率为 13． 60%。
试验结果对桫椤孢子再生体系的建立提供技术支撑。
关键词:正交试验;桫椤;原叶体;增殖; 分化
Orthogonal optimized synthesis of prothallus proliferation and young sporophyte formation in Alsophila
spinulosa∥WANG Hui，QIN Jian-rong，ZHI Shuang，TIAN Na，XIAO Xiao-jun
Abstract:Based on orthogonal experiment，the influences of different medium types，the concentration and composition of
plant hormone，and the concentration of sucrose on the prothallus proliferation and young sporophyte formation of Alsophila
spinulosa were investigated． The results indicated that there was very significant difference of prothallus proliferation by dif-
ferent NAA and sucrose concentration，and very significant difference of young sporophyte formation by different BA con-
centration． The optimal proliferation medium was MS + 0． 5 mg /L NAA + 0． 01 mg /L BA + 0． 1 mg /L TDZ + 20 g /L su-
crose，with a proliferation rate of 20． 31% ． The optimal differentiation medium was N6 + 0． 1 mg /L NAA + 0． 5 mg /L BA +
0． 1 mg /L TDZ + 20 g /L sucrose，with a differentiation rate of 13． 60% ． The results of test provided technique support for
the establishment of regeneration system for the spores of A． spinulosa．
Key words:orthogonal experiment;Alsophila spinulosa;prothallus;proliferation;differentiation
First author’s address:College of Life Science in Neijiang Normal University，Neijiang 641112，Sichuan，China
收稿日期:2013－03－21 修回日期:2013－04－26
基金项目:内江师范学院自然科学研究项目(编号:2011NJZ －2) ，内江
师范学院大学生科研项目(编号:11NSD－168)。
作者简介:王辉(1982 －) ，男，助理研究员，主要从事经济植物栽培与
育种方面的研究工作。通讯作者:肖小君，女，助理研究员。E-mail:
qianqianxxj@ 126． com
桫椤［Alsophila spinulosa(Wall． ex Hook)Tryon．］
又名树蕨、龙骨风等，是现存唯一的木本蕨类植物［1］，
其古老性及孑遗性对物种的形成、地质变迁和生物进
化等具有重要的参考价值，有“植物活化石”之称［2］。
桫椤以孢子繁殖为主，由于孢子具有休眠性、萌发周
期长，雌雄配子结合对环境要求较为苛刻，大大限制
了孢子的自然繁殖。并且由于人类活动频繁，生态环
境正朝着不利于桫椤配子体发育的方向发展，致使该
物种处于濒危状态［3］。因此，挽救和保护桫椤并扩
大其个体数量迫在眉睫。
近年来，研究者试图利用无菌繁殖技术解决桫椤
繁殖困难的问题，Goller 等［4］对桫椤科 16 个属的孢
子和配子进行了体外组织培养的繁殖研究;Douglas
等［5］对一系列蕨类植物配子培养进行了研究。国内
也从人工自然繁殖［6－7］和无菌繁殖［8－9］两条途径对桫
椤孢子繁殖进行了相关研究，但其结果并不理想，目
前尚无一套可用于工厂化培育幼孢子体植株的无菌
繁殖技术体系。特别是在桫椤原叶体的增殖与分化
2 个关键环节上，高效繁殖体系的建立无相关报道。
试验以预试验获得的桫椤无菌原叶体为材料，尝试用
正交试验法优化原叶体增殖及幼孢子体形成，建立高
效稳定的再生体系，为桫椤的克隆繁殖与规模化育苗
奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验材料为 2011 年 8 月采自四川荣县的成熟桫
椤孢子，带回经无菌消毒后接种于 1 /10 MS培养基上
萌发，待形成约 0． 5 ～ 1． 0 cm 的原叶体后，取无菌原
叶体为本次试验材料(图 1a)。
1． 2 试验方法
在超净工作台上，取出无菌的原叶体，转入增殖
技术开发 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
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培养基上。增殖培养基配方设计采用 L16(4
5)正交表
(表 1) ，考虑培养基类型(A)、NAA 浓度(B)、BA 浓
度(C)、激素配比(D)、蔗糖浓度(E)5 个因素，每一
因素 4 水平，每处理接种原叶体数 300 枚。培养基附
加琼脂条 6 g /L，pH 5． 8。接种后置于培养室，温度
(23 ± 1)℃，光照 2 000 lx。定期观察并记录原叶体
增殖及分化情况，45 d 后，统计原叶体增殖率及分化
率，增值率或分化率 =(增殖数或分化数 /接种数)×
100%，并对其作方差分析与多重比较(LSD 法)。健
壮度以观察增殖原叶体及分化的幼孢子体的大小、颜
色和生长情况为主。
表 1 L16(4
5)正交试验设计
水平
试验因素
A
B /
(mg·L －1)
C /
(mg·L －1)
D
E /
(g·L －1)
1 MS(大)+ N6(微) 0 0 BA 20
2 MS 0． 10 0． 10 TDZ + NAA 40
3 N6 0． 01 0． 01 TDZ + NAA + BA 60
4 White 0． 50 0． 50 BA + NAA 80
2 结果与分析
试验结果表明，16 个处理原叶体均有不同程度的
增殖(表2) ，增殖率最高为处理8:A2B4C3D2E1，增殖率
为20． 31%，其次为处理 10:A3B2C4D3E1(图 1b)。最差
为处理 13:A4B1C4D2E3，仅 1． 30%，但有 6． 28%的分化
率(图 1c)。对于原叶体的分化，最优试验配方为处理
10:A3B2C4D3E1，分化率达 13． 60%。不加入细胞分
裂素 BA时，分化率为 0(图 1d)。
试验观察发现，以 N6 为基本培养基的处理，原叶
体和幼孢子体颜色均为黄绿色，可能是培养基母液中
氮素不足所致。
表 2 增殖及分化的正交试验结果
试验号 处理 增殖率 /% 分化率 /% 健壮度
1 A1B1C1D1E1 6． 75 0 +++++
2 A1B2C2D2E2 14． 67 1． 56 +++
3 A1B3C3D3E3 3． 24 4． 75 +++
4 A1B4C4D4E4 10． 28 3． 00 ++
5 A2B1C2D3E4 9． 36 6． 24 ++
6 A2B2C1D4E3 13． 50 0 +++
7 A2B3C4D1E2 12． 67 4． 60 ++++
8 A2B4C3D2E1 20． 31 3． 36 ++++++
9 A3B1C3D4E2 9． 86 1． 32 ++++
10 A3B2C4D3E1 17． 86 13． 60 ++++++
11 A3B3C1D2E4 8． 47 0 ++
12 A3B4C2D1E3 10． 67 2． 64 +++
13 A4B1C4D2E3 1． 30 6． 28 +
14 A4B2C3D1E4 14． 56 2． 40 +++
15 A4B3C2D4E1 9． 85 3． 32 +++++
16 A4B4C1D3E2 10． 28 0 ++
注:健壮度 ++++++ ＞ +++++ ＞ ++++ ＞ +++ ＞ ++ ＞ +。
a．待转接的原叶体;b．接种 45 d时增殖和分化较好的原叶体丛，可见幼孢子体产生;
c．接种 45 d时增殖较差，但有分化的原叶体丛;d．未见分化的原叶体丛
图 1 桫椤原叶体增殖及幼孢子体形成
对于桫椤原叶体增殖，分析结果表明，影响桫椤 原叶体增殖的因素主次关系为 B ＞ E ＞ A ＞ C ＞ D，5
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 技术开发
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个因素中 D 因素的极差最小，DPS 方差分析将其作
误差项，分析其余 4 个因素各水平间的差异对增殖率
的影响(表 3)。不同浓度 NAA和蔗糖对原叶体增殖
影响差异极显著，其次为培养基类型，BA浓度对原叶
体增殖无显著影响。由 F 值确定它们的主次关系为
NAA浓度 ＞蔗糖浓度 ＞培养基类型 ＞ BA 浓度 ＞激
素配比。因此，由表 3 分析结果得出，理论最优组合
为 A2B2C3D2E1，即 MS +0． 1 mg /L NAA + 0． 01 mg /L
BA +0． 1 mg /L TDZ +20 g /L蔗糖。该配方与试验最
佳配方(A2B4C3D2E1)不一致。根据差异显著性大小
排序，该结果与处理 10 的配方较为接近，但仍需按理
论适宜配方进一步试验。
对于桫椤幼孢子体形成，分析结果表明，影响桫
椤幼孢子体形成的因素主次关系为 C ＞ D ＞ E ＞ B ＞
A，5 个因素中 A因素极差最小，将其作为误差项，分
析其余 4 个因素各水平间的差异对其增殖率的影响
(表 3)。结果显示，不同水平 BA 对幼孢子体形成的
影响达显著水平，其余因素各水平间对桫椤幼孢子体
形成均无显著影响。由此，考虑主因素和直观分析结
果认为，理论最优组合为 A3B2C4D3E1，该结果与处理
10 完全吻合，表明处理 10 是桫椤幼孢子体形成的合
适配方。
表 3 桫椤原叶体增殖及分化试验结果
处理 因素和 A B C D E 平均值 A B C D E
K1 34． 94 27． 27 39． 00 44． 65 54． 77 X1 8． 74 6． 82 9． 75 11． 16 13． 69
K2 55． 84 60． 59 44． 55 44． 75 47． 48 X2 13． 96 15． 15 11． 14 11． 19 11． 87
增殖 K3 46． 86 34． 23 47． 97 40． 74 28． 71 X3 11． 72 8． 56 11． 99 10． 19 7． 18
K4 35． 99 51． 54 42． 11 43． 49 42． 67 X4 9． 00 12． 89 10． 53 10． 87 10． 67
Ｒ 20． 90 33． 32 8． 97 4． 01 26． 06 Ｒ 5． 23 8． 33 2． 24 1． 00 6． 52
K1 9． 31 13． 84 0． 00 9． 64 20． 28 X1 2． 33 3． 46 0 2． 41 5． 07
K2 14． 20 17． 56 13． 76 11． 20 7． 48 X2 3． 55 4． 39 3． 44 2． 80 1． 87
分化 K3 17． 56 12． 67 11． 83 24． 59 13． 67 X3 4． 39 3． 17 2． 96 6． 15 3． 42
K4 12． 00 9． 00 27． 48 7． 64 11． 64 X4 3． 00 2． 25 6． 87 1． 91 2． 91
Ｒ 8． 25 8． 56 27． 48 16． 95 12． 80 Ｒ 2． 06 2． 14 6． 87 4． 24 3． 20
3 结论与讨论
试验结果表明，不同浓度 NAA 和蔗糖对原叶体
增殖的影响差异极显著，其次为培养基类型;不同浓
度 BA对幼孢子体形成的影响极显著。桫椤原叶体
增殖的适宜配方为 MS +0． 5 mg /L NAA + 0． 01 mg /L
BA + 0． 1 mg /L TDZ + 20 g /L 蔗糖，增殖率为
20． 31%;适宜的分化培养基为 N6 + 0． 1 mg /L NAA +
0． 5 mg /L BA +0． 1 mg /L TDZ + 20 g /L蔗糖，分化率
为 13． 60%。
原叶体的增殖与分化是桫椤孢子无菌克隆繁殖
及工厂化育苗体系的 2 个关键环节。在这 2 个环节
上研究资料较少。本试验基本确定了适宜桫椤幼孢
子体形成的培养基配方，但对原叶体增殖的配方，鉴
于理论配方与试验配方不一致，仍需进一步试验。徐
艳等［10］认为，原叶体在 1 /5 MS和 1 /10 MS培养基上
生长良好，90 ～ 100 d 后可分化出现幼孢子体。本试
验原叶体的增殖率和分化率均较低，可能是由于统计
时间过早(45 d)。
本试验观察发现，以 N6 为基本培养基的处理，增
殖的原叶体和幼孢子体颜色均为黄绿色，这与张银丽
等［8］观察的现象一致，其原因可能是培养基母液中
氮素不足所致，仍有待进一步研究。
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( 责任编辑 史 洁)
技术开发 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗