全 文 ：浙江红山茶总 DNA提取及 ISSR-PCR引物筛选
谢 云 1, 2 ,李纪元 1＊ ,范正琪 1 ,朱高浦1 ,周兴文 1
　(1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江富阳 311400;2.浙江农林大学天目学院 ,浙江临安 311300)
摘要　[目的 ]筛选出简易的DNA提取方法及适合于所有浙江红山茶种质材料进行 ISSR分析的有效引物。 [方法 ]采用改良的 CTAB
法提取基因组DNA,参考其他山茶科植物的 50个ISSR引物 ,对来自浙江、福建、江西、安徽 10个居群中共 20份浙江红山茶种质材料进
行了PCR扩增。 [结果]改进的 CTAB法可简单、快速地提取到高纯度 DNA产物;筛选出的 20条引物多态性丰富、条带清晰且可重复性
良好。共扩增出 337条DNA谱带 ,其中 281条为多态性带 ,占总扩增带数的 83.4%,平均每个引物扩增出 16.85条谱带。 [结论]所筛选
的 20条引物可有效应用于浙江红山茶种质资源材料的ISSR分析。
关键词　浙江红山茶;ISSR标记;引物筛选
中图分类号　S132　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2011)25-15210-03
DNAExtractionandISSRPrimerScreeningofCameliachekiangoleosa
XIEYunetal　(ResearchInstituteofSubtropicalForestry, ChineseAcademyofForestry, Fuyang, Zhejiang311400)
Abstract　 [ Objective] TheaimwastoscreenoutsimplemethodsofDNAextractionandefectiveISSRprimerssuitabletoalgermplasmma-
terialsofCamelliachekiangoleosa.[ Method] ThemodifiedCTABmethodwasusedintheextractionofthegenomicDNA, 50ISSRprimersfrom
otherCamelliaplantswereusedintheISSR-PCRamplificationfor20germplasmmaterialsfrom10populationsinFujian, Zhejiang, Jiangxi
andAnhuiProvince.[ Result] PureDNAcouldbeobtainedrapidlybyusingtheimprovedCTABmethod, andthe20selectedeffectiveprimers
hadrichpolymorphism, clearbandsandgoodrepeatability.337DNAbandswereobtained, ofwhich281bandswerepolymorphic, accounting
for83.4%ofthetotalamplifiedbands.And16.85bandscouldbeamplifiedwithaprimer, averagely.[ Conclusion] Theselected20primers
couldbeefectivelyappliedtoISSRanalysisofthegermplasmresourcesofC.chekiangoleosainZhejiang.
Keywords　 Cameliachekiangoleosa;ISSRmarker;Primerscreening
基金项目　浙江省科技厅项目(2010C32043)。
作者简介　谢云(1968-),女 ,湖南衡阳人 ,副教授 ,博士研究生 ,从事
园林植物教学和科研工作 , E-mial:xieyun@zafu.edu.cu。
＊通讯作者 ,研究员 ,博士 ,博士生导师 , 从事茶花分子育种
研究 , E-mail:jiyuan-li@126.com。
收稿日期　 2011-05-13
　　ISSR(Inter-simpleSequenceRepeats)分子标记是在 SSR
基础上发展起来的一项新标记技术 ,已在多种动植物的种质
鉴定 、遗传作图 、基因定位 、遗传多样性分析等研究方面得到
应用。ISSR检测的多态性很高 ,其产物多态性较 RFLP、
SSR、RAPD更丰富;同时由于其引物序列较长 ,所以 ISSR具
有很好的重复性 。ISSR在山茶科植物如茶花 [ 1] 、茶树 [ 2-3] 、
金花茶 [ 4] 、油茶 [ 5] 、杜鹃红山茶 [ 6]上的应用已有报道 ,但在浙
江红山茶中的应用尚未见报道。
浙江红山茶 (CameliachekiangoleosaHu)是山茶科
(Theaceae)山茶属常绿木本观花和油料植物 ,又名浙江红花油
茶 ,花大色艳 ,具有重要的观赏价值和经济价值。浙江红山茶
是中国特有种 ,分布于浙江 、江西 、福建 、安徽等地 ,目前对浙江
红山茶的研究较少 [ 7] ,主要限于脂肪酸分析 [ 8] 、引种 [ 9] 、抗逆
性 [ 10]以及主要表型性状变异规律等方面的研究 [ 11] ,其种的划
分还存在争议 [ 12] 。目前 ,对于浙江红山茶种质资源遗传多样
性以及 ISSR分子标记等方面的研究尚未见报道。为了寻找理
想的 ISSR引物 ,笔者从每个供试居群中任选 2份种质材料(10
个居群 ,共 20份种质材料)用于引物筛选 ,旨在为进一步研究
其遗传多样性提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料　取分布在 4个省 10个县的 10个居群的浙江红
山茶 ,每个居群取 2份个体材料 ,共 20份材料用于 ISSR引物
筛选(表 1)。引物 Y1到 Y50主要参考其他山茶科植物 ISSR
研究中筛选出的引物 [ 1-6] ,由通用引物和自行设计引物两部
分组成(表 2),由上海生工生物工程技术有限公司合成。
dNTP和 Taq酶 、DNAmarker购自南京 TaKaRa公司 。
表 1　用于 ISSR分析的 20份浙江红山茶种质材料及其来源
Table1　40germplasmmaterialsofC.chekiangoleosausedforISSRa-
longwiththeirorigins
采集号 采集地点 采集号 采集地点
ZTT1-ZTT2 浙江天台县华顶山 AYX1-AYX2 安徽省岳西县大别山区来榜镇横河村
ZQY1-ZQY2 浙江庆元百县山祖自然保护区 FJN-FJN2 福建省建宁县闽江源自然保护区樱桃岭
ZKH1-ZKH2 浙江开化县古田山自然保护区 FXP1-FXP2 霞浦水门乡八斗丘村
ZJN1-ZJN2 浙江景宁县景南乡上标林场 JDX1-JDX2 江西德兴新钢山镇十八亩段村
ZJY1-ZJY2 浙江缙云县大洋山林场 JJX1-JJX2 江西永新县三湾乡九垅村下九垅组
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取和检测。以浙江红山茶冰冻的嫩
叶为材料 ,采用改进的 CTAB法提取基因组 DNA。取适量冰
冻嫩叶 ,放入预冷的研钵中 ,加入适量 PVP,于液氮中研磨成
细粉 ,放入加有 2 ml2 ×CTAB提取液(2% CTAB, 100.00
mmol/LTris-HCl, 20.0 mmol/LEDTA 1.4 mo1/LNaCl, pH
8.0, 2%β-琉基乙醇 , 65℃预热)的 5.0 ml离心管中 ,轻轻混
匀 ,在 65 ℃水浴中保温 1 h,每隔 15min颠倒混匀 1次 ,取出
冷至室温 ,加 2.0 ml氯仿∶异戊醇(24∶1),轻轻颠倒混匀 ,
8 000 r/min离心 15 min;小心将上清液转移至另一支新 5.0
ml离心管中 ,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1), 8 000r/min
离心 15 min;小心将上清液分 2次取 0.5 ml转移至 2支 1.5
ml离心管中 ,各加入 2倍体积经 -20 ℃预冷的无水乙醇 ,在
-20℃下放置 2h,以沉淀基因组 DNA, 12 000r/min离心 10
min,弃上清液;将获得的 DNA用 75%乙醇冲洗 2次 ,用无水
乙醇冲洗 1次 , 10 000 r/min离心 5 min,弃上清液 ,干燥后加
责任编辑　乔利利　责任校对　况玲玲安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2011, 39(25):15210-15212
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.25.211
适量 TE缓冲液 ,待 DNA溶解后置于 -20℃冰箱保存 。
用 0.8%琼脂糖电泳检测 DNA质量完整性 。取 5
μlDNA溶液 ,再加入 2.0 μl0.25%溴酚蓝 ,对照为已知浓度
的 DNA样品 ,上样于 0.8%琼脂糖凝胶在 1×TBE的电泳缓
冲液中进行水平板电泳(电泳仪为 DYY-80型 ,电泳槽为 DY-
CP-33A水平),电泳电压为 100 V,时间 30 min左右 ,电泳结
束后用溴化乙锭(EB)染色 ,然后在 JS-380自动凝胶图像分
析仪(上海培清科技有限公司)观测分析并照相 ,根据检测的
结果稀释 DNA浓度为 30 ng/μl,用于后续试验 。
1.2.2　PCR反应体系及扩增程序。总体积为 20 μl的 PCR
反应体系中包含 10 ×bufer、30 ngDNA模板 、2.0 mmol/L
Mg2+、300.0 μmol/LdNTP、0.8 μmol/L引物和 2.5 UTaq
DNA聚合酶。 PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94℃变
性 45 s,温度梯度下退火 50 s, 72 ℃延伸 90 s, 40个循环;72
℃延伸 7 min, 4℃保存。扩增反应在 GeneAmpPCRSystem
9700 (AppliedBiosystems, USA)PCR仪上进行 。取 10 μl扩
增产物 ,在质量浓度为 1.2mg/L、并加有溴化乙锭(EB)的琼
脂糖凝胶中电泳分离 , 2 000 bpDNAladder作为对照分子量
标准 , 100V电压下电泳 2 h,电泳结果用 AlphaImager成像
系统(美国 AlphaInnotechCorporation)观测分析并拍照。
1.2.3　引物筛选及退火温度梯度试验。根据每个 ISSR引
物的 Tm值设计 4个温度梯度进行 PCR扩增 ,理论解链温度
(Tm)值相近的引物在同一个退火温度梯度内扩增 ,退火温
度梯度的范围根据引物的 Tm值加减 5℃左右形成。选择条
带清晰 、结果稳定 、多态性强 、背景浅的引物;淘汰掉虽然有
条带 ,但经退火温度试验后仍不能获得较好效果的引物。然
后对筛选出的引物在 12个温度梯度下用任意模板进行退火
温度梯度试验。
表 2　试验用引物及其序列
Table2　Primersandtheirsequencesinthetest
引物编号 引物序列 引物编号 引物序列 引物编号 引物序列
UBC-808 (AG)8C UBC-835 (AG)8YC UBC-873 (GACA)4UBC-810 (GA)8T UBC-836 (AG)8YG UBC-881 (GGGTG)3UBC-811 (GA)8C UBC-840 (GA)8YT IR1 G(AC)8UBC-812 (GA)8A UBC-841 (GA)8YC IR2 (GGAGA)3UBC-813 (CT)8T UBC-843 (CT)8RA IR3 (GA)8CTUBC-814 (CT)8A UBC-844 (CT)8RC IR4 (CAA)6UBC-815 (CT)8G UBC-845 (CT)8RG IR5 (CAG)8TUBC-816 (CA)8T UBC-846 (CA)8RT IR6 (CAA)8GUBC-817 (CA)8A UBC-847 (CA)8RC IR7 (GT)8GGUBC-818 (CA)8G UBC-848 (CA)8RG IR8 (AC)8TGUBC-820 (GT)8C UBC-851 (GT)8YG IR9 (AC)8CGUBC-821 (GT)8T UBC-853 (TC)8RT IR10 (CT)8GGUBC-823 (TC)8C UBC-854 (TC)8RG IR11 (CAG)6TUBC-825 (AC)8T UBC-855 (AC)8YT IR12 (CAA)6GUBC-826 (AC)8C UBC-860 (TG)8RA IR13 (GACA)4TUBC-827 (AC)8G UBC-866 (CTC)6 IR14 (CT)8CUBC-834 (AG)8YT UBC-868 (GAA)6
　注:加粗的引物为筛选出的引物。
　Note:Theboldareselectedprimers.
2　结果与分析
2.1　DNA质量检测　提取的浙江红山茶基因组 DNA呈米
白色絮状或无色透明沉淀 ,电泳结果呈均 1条带 ,说明提取
的 DNA较纯 ,完整性好 ,蛋白质 、多糖和酚类等杂质基本去
除。采用紫外分光光度法测定其浓度 ,结果表明提取的 DNA
的 OD260 /OD280均在 1.80左右 ,符合 ISSR-PCR的要求 。
注:M.DL2000DNAMarker;1～ 4.引物为 IR13;5～ 8.引物为UBC-835;9～ 12.引物为 UBC-841;13 ～ 16.引物为 UBC-873;17～ 20.引物为 UBC-
815。各引物的退火温度均分别为 58.4、54.9、51.0和 47.8℃。
Note:M.DL2000DNAMarker;lanes1-4wereIR13;lanes5-8wereUBC835;lanes9-12wereUBC841;lanes13-16wereUBC873;lanes17-
20wereUBC815.Annealingtemperatureofeachprimerwere58.4, 54.9, 51.0和 47.8℃, respectively.
图 1　引物及其相应的退火温度筛选
Fig.1　Primersandtheircorrespondingannealingtemperature
2.2　不同引物退火温度的确定及其筛选　共筛选出 20条
多态性丰富 、条带清晰的引物 ,图 1显示的为 IR13、UBC-835、
UBC-841、UBC-873、UBC-815这 5种引物在 ZKH1模板上的
扩增结果。引物 IR13,退火温度在 51.0和 47.8 ℃时条带
多 ,但退火温度较低时背景较深 ,所以 51 ℃较好;引物 UBC-
835,退火温度在 47.8和 54.9 ℃时产生的杂带多 ,背景很亮 ,
说明温度太低非特异性条带多 ,故以 58.4 ℃左右为佳;引物
UBC-841、UBC-873和 UBC-815均在温度高时扩增条带数少 ,
产物模糊 ,随着温度的降低 ,扩增条带增多且清晰 ,以 47.8
℃为最佳。由此筛选出 20条引物 ,并进一步进行 12个温度
梯度的退火温度试验 ,筛选出退火温度后以 JYX1-25号材料
为模板进行 ISSR-PCR扩增 ,结果见表 3。
2.3　ISSR标记数据统计及扩增结果　从 ISSR扩增条带统
计结果可知(表 3),每条引物可扩增出 13 ～ 22条多态性带 ,
平均每个引物扩增的带数为 16.85条。 20条 ISSR引物共产
生 337条扩增带 ,其中多态性条带 281条 ,占总扩增条带数的
1521139卷 25期　　　　　　　　　　　　　　　　谢云等　浙江红山茶总 DNA提取及 ISSR-PCR引物筛选
83.4%,均能扩增出清晰可辨的 DNA指纹图谱 ,片段长度在
100 ～2 000bp,扩增产物多态性较高 。图 2为引物 UBC-846
对 JYX1-25号种质材料的 ISSR-PCR扩增图谱。
表 3　引物序列及其多态性
Table3　Thesequenceofprimersandtheirpolymorphism
引物
Primers
序列
Sequences
退火温度
Annealingtemperature∥℃
扩增带数
Amplifiedbands∥条
多态性带
Polymorphicbands∥条
多态性百分率
Percentageofpolymorphism∥%
UBC-811 (GA)8C 48.7 13 10 76.9UBC-816 (CA)8T 50.0 17 14 82.4UBC-817 (CA)8A 55.0 16 13 81.3UBC-825 (AC)8T 53.2 20 17 85.0UBC-827 (AC)8G 51.6 21 18 85.7UBC-834 (AG)8YT 49.7 17 14 82.4UBC-835 (AG)8YC 53.2 15 13 86.7UBC-844 (CT)8RC 50.2 13 11 84.6UBC-845 (CT)8RG 51.6 14 12 85.7UBC-846 (CA)8RT 49.4 15 12 80.0UBC-855 (AC)8YT 53.2 15 13 86.7UBC-868 (GAA)6 49.4 16 13 81.3UBC-873 (GACA)4 51.0 14 12 85.7UBC-881 (GGGTG)3 52.0 18 15 83.3IR2 (GGAGA)3 53.2 18 16 88.9IR3 (GA)8CT 50.2 20 17 85.0IR4 (CAA)6 49.4 22 18 81.8IR8 (AC)8TG 52.0 22 17 77.3IR9 (AC)8CG 49.4 15 12 80.0IR13 (GACA)4T 52.0 16 14 87.5
注:M.DL2000DNAMarker;1～ 25.分别代表江西永新的 25份浙江红山茶种质材料的ISSR-PCR扩增图谱。
Note:M.DL2000DNAMarker;1-25.ISSR-PCRamplifiedmapof33germplasmmaterialsofC.chekiangoleosa.
图 2　引物 UBC-846的ISSR-PCR扩增结果
Fig.2　TheamplifiedresultsofprimerUBC-846
3　结论
成功筛选出了 20条适合浙江红山茶 ISSR标记技术的
引物。 20条引物共扩增出 286条 DNA谱带 ,其中 80.77%为
多态性带。为应用 ISSR标记技术快速 、准确地分析浙江红
山茶的遗传多样性奠定了基础。
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