全 文 ：第 25卷　第 4期
Vol.25　　No.4
重 庆 理 工 大 学 学 报(自然科学)
JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)
2011年 4月
Apr.2011
　　收稿日期:2011-02-16;修回日期:2011-03-10
作者简介:郑新川(1984—), 男 ,四川自贡人 , 硕士研究生 ,主要从事天然药物物质基础与新药评价研究;通讯作者
郑一敏(1963—), 男 ,四川广安人 , 教授 ,主要从事天然药物研究。
山竹抗细菌内毒素有效成分的研究
郑新川 ,胥秀英 ,傅善权 ,郑一敏
(重庆理工大学 药学与生物工程学院 , 重庆　400054)
摘　　　要:研究山竹 GarciniamangostanaL.果壳中具有拮抗细菌内毒素 (endotoxin/lipopo-
lysaccharide, LPS)作用的化学成分 。以 LPS生物学活性中心 lipidA为靶点导向分离有效成分 ,
根据波谱数据鉴定化合物结构 ,亲和生物传感器测定化合物与 lipidA的亲和力常数 ,鲎试验检
测内毒素对 LPS的体外中和作用 ,酶联免疫吸附法检测内毒素对 LPS诱导 RAW264.7细胞释
放肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)的抑制作用。结果表明:从山竹果壳中分离得到 3个化合物 ,经鉴
定为表儿茶素(Ⅰ )、α-mangostin(Ⅱ)和 γ-mangostin(Ⅲ);化合物 Ⅰ与 lipidA具有直接结合作
用 ,可显著抑制 LPS介导的鲎试剂凝集反应;化合物 Ⅰ ～ Ⅲ均能选择性抑制 LPS诱导
RAW264.7细胞释放 TNF-α,显示出抗 LPS活性;首次发现化合物 Ⅰ体外对 LPS具有拮抗作用 ,
是山竹中一种新的抗 LPS活性物质。
关　键　词:山竹;化学成分;表儿茶素;内毒素
中图分类号:R284.2　　　　文献标识码:A 文章编号:1674-8425(2011)04-0033-07
StudyonAnti-lipopolysaccharideCompoundsfrom
GarciniaMangostanaL
ZHENGXin-chuan, XUXiu-ying, FUShan-quan, ZHENGYi-min
(SchoolofPharmacyandBioengineering, ChongqingUniversityofTechnology, Chongqing400054, China)
Abstract:Tostudytheanti-lipopolysaccharide(LPS)componentsofthepericarpofGarciniaman-
gostanaL.(mangosteen), bytargetinglipidA, thebioactivecenterofLPS, thecompoundswereiso-
latedunderthedirectionofbioactivity.Thestructuresofcompoundswereelucidatedbyspectroscopic
dataanalysis.TheafinityconstantofcompoundbindingtolipidAwasdeterminedbyafinitybiosen-
sor.TheneutralizationofLPSwasassayedbyLimulusAmebocyteLysate(LAL)test.Theinhibition
oftumornecrosisfactor-alpha(TNF-α)releaseinducedbyLPSinRAW264.7celswasasessedby
enzyme-linkedimmunosorbentassay.Threecompoundswereisolatedandidentifiedas(-)-epicate-
chin(Ⅰ), α-mangostin(Ⅱ)andγ-mangostin(Ⅲ).CompoundⅠ coulddirectlybindtolipidA
andneutralizeLPS, andcompoundⅠ ～ Ⅲ couldinhibitTNF-αreleasefromRAW264.7 celsin-
ducedbyLPS.It sthefirsttimetodemonstratethepotentialanti-LPSactivityofcompoundⅠ in
vitro, anditcouldberegardedasanovelanti-LPSingredientinmangosteen.
Keywords:garciniamangostanaL;chemicalconstituents;(-)-epicatechin;lipopolysaccharide
　　内毒素 (endotoxin/lipopolysaccharide, LPS)是
革兰阴性菌细胞外膜的主要成分 ,通过活化单核-
吞噬细胞系统 ,引起 TNF-α等炎症介质释放 ,介导
全身性炎症反应综合征(systemicinflammatoryre-
sponsesyndrome, SIRS),即脓毒症(sepsis)等疾病
的发生 。目前 ,临床上对脓毒症的防治仍然缺乏
有效手段 。近年研究表明 ,脓毒症的发生与 LPS
等病原分子被炎症反应细胞膜上或胞内相应模式
识别受体识别 ,进而与活化炎症反应细胞密切相
关 ,因此 ,从源头中和 LPS,对阻断脓毒症的发生 、
发展可能具有重要意义。 LipidA是 LPS的生物
学活性中心 ,因而是理想的抗 LPS药物靶点[ 1] 。
笔者在前期抗 LPS药物筛选中发现 ,山竹果
壳中水溶性成分对 LPS的活性中心 lipidA具有结
合作用 ,提示其中可能含有抗 LPS成分 ,但过去对
于山竹的研究主要集中于氧杂蒽酮类(xanthones)
等难溶性成分 ,对水溶性成分研究不多 ,因此 ,为
从该植物中寻找新的抗 LPS活性物质。笔者对山
竹乙醇提取物进行了研究 ,分离 、鉴定出 3个化合
物 ,分别为表儿茶素(Ⅰ )、α-mangostin(Ⅱ)和 γ-
mangostin(Ⅲ),其中 ,化合物Ⅰ为首次发现具有拮
抗 LPS的活性。
1　材料与方法
1.1　试剂与仪器
IAsysplus亲和生物传感器(美国 Thermo);
Agilent1100制备型高效液相色谱仪 (美国 Agi-
lent);FinniganLCQDeca质谱仪(美国 Thermo);
BruckerAPEX-2型核磁共振仪 (瑞士 Bruker);
ATi321-06细菌内毒素检测仪(英国 Labkinetics);
Model550酶联分析仪(美国 Bio-Rad);AB-8型大
孔吸附树脂(天津海光化工有限公司);薄层硅胶
GF254(青岛海洋化工厂);LPS(美国 Sigma);lipid
A(美国 Sigma);细菌非甲基化 DNA(北京赛百盛
公司);鲎试剂 (湛江安度斯生物工程公司 );
RAW264.7细胞 (美国标准生物品收藏中心);小
鼠 TNF-αELISA试剂盒(美国 eBioscience);无水
乙醇(重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂);
甲醇 (色谱级 , 美国 Honeywel);超纯水由 Aqua-
pro® ARE1-500L-U00纯水系统制备;其余试剂均
为分析纯;山竹采购于重庆水果市场 ,去果肉 ,取
果壳 ,经重庆理工大学天然药物实验室傅善权主
任技师鉴定为山竹 GarciniamangostanaL.的果壳。
1.2　方法
1.2.1　LipidA的包被
按亲和生物传感器有关脂质的包被操作规程 ,
将 lipidA包被于 Non-derivatised样品池上作为固定
相 ,具体步骤为:①以 50μL含 1.25%(m/v)n-octyl
β-D-glucopyranoside的 0.01mol·L-1 PBS溶 液
(PBS/OG)洗 Non-derivatised样品池 3次;②将 lipid
A以 PBS/OG配制成浓度为 2mg·mL-1的溶液 ,取
此溶液 30μL加入样品池中;③待反应曲线平衡后 ,
继续加入 30μLPBS溶液;④待反应曲线再次平衡
后 ,重复步骤③的操作 1次;⑤以 50μLPBS溶液洗
3次 ,包被有 lipidA的 Non-derivatised样品池于 4℃
保存 ,备用。
1.2.2　提取分离
取干燥的山竹果壳 1 kg,粉碎 ,乙醇回流提取
3次 ,合并提取液 ,减压浓缩至 2 g· mL-1 ,加水至
含水量达 75%以上 ,静置冷藏 24 h,过滤 ,得上清
液 S和黄色沉淀 X(30.2g)。
34 重 庆 理 工 大 学 学 报
将上清液 S减压回收乙醇至无醇味 ,上 AB-8
型大孔吸附树脂 ,依次用 10%、30%、50%和 70%
乙醇洗脱 ,收集各洗脱液 ,减压浓缩 ,分别得浸膏
A(1.9 g)、浸膏 B(10.3g)、浸膏 C(1.7g)和浸膏
D(0.18 g)。取浸膏 A～ D以 PBS溶液分别溶解
为 1 mg·mL-1的溶液 ,作为流动相依次加入已包
被有 lipidA的亲和生物传感器中进行检测 ,检测
步骤为:①取 5 μL样品溶液加入样品池中(含
45 μLPBS溶液 ),结合反应时间为 3 min;②以
50 mLPBS溶液洗 3次;③待解离曲线平稳后 ,以
50 μL浓度为 0.1 mol· L-1的盐酸洗 1次进行再
生 。将其中与 lipidA结合值最高的浸膏 B分散于
水中 ,调 pH值至 4 ～ 5,加入 5%明胶至沉淀完全 ,
过滤除去沉淀 ,收集上清 ,加入 5倍量乙醇使过量
明胶沉淀 ,过滤后取上清液减压回收乙醇 ,干燥得
浸膏(3.4 g),取此浸膏(100 mg)上制备型高效液
相色谱仪 , 色谱柱为 KF-C18色谱柱 (200 mm×
20 mm, 10 μm), 流动相为 1%冰醋酸 ∶甲醇
(75∶25), 检 测 波 长 为 280 nm, 流 速 为
10 mL· min-1 , 柱温为室温 。收集保留时间为
21.155 min的色谱峰馏分 , 减压回收溶剂 ,干燥 ,
得化合物Ⅰ (37 mg)。其余部分馏分收集后合并 ,
减压回收溶剂 ,干燥 ,得褐色粉末。将化合物 Ⅰ和
该褐色粉末以 PBS溶液分别溶解为 1 mg· mL-1
的溶液 ,加入亲和生物传感器中进行检测 ,结果显
示化合物Ⅰ与 lipidA的结合值高于褐色粉末部
分 ,表明化合物 Ⅰ是与 lipidA结合的主要成分。
取该成分进行核磁共振波谱和质谱检测。
另取黄色沉淀 X(100 mg)上制备薄层色谱 ,
采用硅胶 GF254薄层板 ,以乙酸乙酯 ∶石油醚∶冰
醋酸(50∶50∶1)为展开剂 ,在 254 nm下检视 ,分别
刮取比移值为 0.71和 0.43的 2处条带 ,丙酮洗
脱 ,减压回收溶剂 ,干燥 ,得黄色粉末 A和 B。黄
色粉末 A和 B分别上制备型高效液相色谱仪 ,色
谱柱为 KF-C18色谱柱(200mm×20mm, 10μm),
流动相为水∶甲醇(25∶75),检测波长为 320nm,流
速为 20 mL· min-1 ,柱温为室温 。分别收集保留
时间为 9和 6.5 min的色谱峰馏分 ,减压回收溶
剂 ,干燥 , 得到化合物 Ⅱ(48.02 mg)和化合物 Ⅲ
(6.16 mg),进行核磁共振波谱和质谱检测 。
1.2.3　化合物Ⅰ与 lipidA的亲和力常数测定
将化合物 Ⅰ以 PBS溶液配制成浓度为 0.06×
10
-3 , 0.12 ×10-3 , 0.23 ×10-3 , 0.45 ×10-3和
0.9×10-3 mol·L-1的溶液 ,作为流动相依次加入
已包被有 lipidA的亲和生物传感器中进行检测 ,
检测步骤同本文 1.2.2节下实验方法 。采用 IAsys
FASTfit程序对采集的数据进行处理 ,计算化合物
Ⅰ与 lipidA结合的解离平衡常数(dissociatione-
quilibriumconstant, KD)。
1.2.4　化合物Ⅰ对 LPS的体外中和作用检测
将化合物 Ⅰ以内毒素检查用水(无热原水)配
制成 0.5×10-3 , 1×10-3和 2×10-3 mg· mL-1的
溶液 ,分别与 2×10-6 mg· mL-1的 LPS等体积混
合。同时 ,设立 LPS对照组和阴性对照组。 LPS
对照组为 2×10-6 mg· mL-1的 LPS与等体积内毒
素检查用水混合 ,阴性对照组为内毒素检查用水 。
各组均以 37 ℃水浴孵育 30 min,然后吸取各组溶
液加入鲎试剂中 ,按照 ATi321-06细菌内毒素检
测仪的操作方法 ,采用鲎试验(动态浊度法)检测
各组 LPS的含量 ,每组设立 2个平行检测管。
1.2.5　化合物 Ⅰ ～ Ⅲ对 LPS和细菌非甲基化
DNA(CpGDNA)诱导 RAW264.7细胞释放 TNF-
α的影响
用含 10%(v/v)胎牛血清的 DMEM培养液将
RAW264.7细胞稀释至 5×105个 /mL,加入 96孔板
中 ,每孔 200μL,于 37℃、5% CO2条件下培养 4h。
更换新鲜培 养液 , 然 后分别加入 终浓度为
1×10-4mg·mL-1的 LPS,终浓度为 0.01mg·mL-1
的 CpG DNA, 以 及 终 浓 度 为 0.025 0.05和
0.1mg·mL-1的化合物Ⅰ,终浓度为 0.002 5、0.005和
0.01mg·mL-1的化合物Ⅱ和Ⅲ。同时 ,设立 LPS对照
组 、CpGDNA对照组和空白对照组。LPS对照组加
35郑新川 ,等:山竹抗细菌内毒素有效成分的研究
入终浓度为 1×10-4 mg·mL-1的 LPS, CpGDNA对
照组加入终浓度为 0.01mg· mL-1的 CpGDNA。每
组设立 3个平行检测孔。加样后于 37℃、5%CO2条
件下继续培养 4 h,取上清 ,按照小鼠 TNF-αELISA
试剂盒操作方法检测 TNF-α的浓度。
1.2.6　化合物 Ⅰ ～ Ⅲ对 RAW264.7细胞活力的
影响
采用四氮噻唑蓝(MTT)法 ,用含 10%(v/v)
胎牛血清的 DMEM培养液将 RAW264.7细胞稀
释至 5×105个 /mL,加入 96孔板中 ,每孔 200 μL,
于 37 ℃、5% CO2条件下培养 4 h,然后分别加入
终浓度为 0.025、0.05、0.1和 0.2 mg· mL-1的化
合物Ⅰ , 0.002 5、0.005、0.01和 0.02mg· mL-1的
化合物 Ⅱ和 Ⅲ ,同时设立空白对照组 ,每组设立 5
个平行检测孔。于 37 ℃、5% CO2条件下继续培
养 4 h, 弃上清 , 每孔加入培养液 180 μL和
5 mg· mL-1的 MTT溶液 20 μL,再继续培养 4 h,
弃上清 ,每孔加入二甲基亚砜 150 μL,振荡 10min
使结晶充分溶解 ,于 490 nm处测定各孔吸光度 ,
以吸光度值代表相对细胞存活率。
1.2.7　统计学处理
采用单因素方差分析 ,结果以均数 ±标准差
表示。其中:＊:p<0.05;＊＊:p<0.01表示具有
统计学意义 。
2　结果
2.1　化合物结构鉴定
2.1.1　化合物Ⅰ
为淡黄色粉末 ,溶于水和甲醇 ,难溶于氯仿和
石油醚。 FeCl3反应:阳性。 UV(MeOH)λmaxnm:
230, 280;ESI-MSm/z(%):289.16([ M-H] -,
100%);1 H-NMR(DMSO-d6 , 400 MHz):δ9.12
(1H, s, 5-OH), 8.91(1H, s, 7-OH), 8.79(1H, s,
4 -OH), 6.89(1H, s, H-2 ), 6.67(1H, d, J=8.4
Hz, H-6 ), 6.65(1H, d, J=11.6Hz, H-5 ), 5.89
(1H, d, J= 2.0 Hz, H-8), 5.72(1H, d, J= 2.0
Hz, H-6), 4.73(1H, s, 3-OH), 4.67(1H, d, J=
3.2 Hz, H-2), 4.00(1H, brs, H-3), 2.68(1H, dd,
J=4.4, 4.4 Hz, H-4a), 2.47(1H, dd, J=2.8, 2.8
Hz, H-4b);13 CNMR(DMSO-d6 , 400 MHz):δ
156.80(C-5), 156.49(C-7), 156.05(C-9), 144.76
(C-3 ), 144.71(C-4 ), 130.87(C-1 ), 118.20
(C-6 ), 115.14(C-2 ), 115.00(C-5 ), 98.72(C-
10), 95.26(C-6), 94.33(C-8), 78.30(C-2), 65.16
(C-3), 28.51(C-4)。与文献报道基本一致[ 2-3] ,故
鉴定为表儿茶素。
2.1.2　化合物Ⅱ
为黄色粉末 ,溶于氯仿 、丙酮 、甲醇和乙醇 ,难
溶于水 。 FeCl3 反应:阳性 。 UV(MeOH)λmaxnm:
206, 243, 316;1H-NMR (CDCl3 , 400 MHz):δ
13.80(1H, s, 1-OH), 6.84 (1H, s, H-5), 6.31
(1H, s, H-4), 5.29(1H ×2, brt, J=7.2 Hz, H-
2 , H-2 ), 4.10(2H, d, J=6.0 Hz, H-1”), 3.82
(3H, s, 7-OMe), 3.47(2H, d, J=6.8 Hz, H-1 ),
1.86(3H, s, H-4 ), 1.85(3H, s, H-4”), 1.79(3H,
s, H-5 ), 1.71(3H, s, H-5”)。与文献报道基本一
致[ 3-4] ,故鉴定为 α-mangostin。
2.1.3　化合物Ⅲ
为黄色粉末 ,溶于氯仿 、丙酮 、甲醇和乙醇 ,难
溶于水 。 FeCl3 反应:阳性 。 UV(MeOH)λmaxnm:
207, 243, 260, 317;ESI-MSm/z(%):395.22([ M-
H] -, 100%);1H-NMR(CDCl3 , 400 MHz):δ13.80
(1H, s, 1-OH), 6.82 (1H, s, H-5), 6.29(1H, s, H-
4), 5.30(1H×2, brt, J=6.8Hz, H-2 , H-2 ),
4.34(2H, d, J=6.8Hz, H-1”), 3.46(2H, d, J=
6.8Hz, H-1 ), 1.89(3H, s, H-4 ), 1.85(3H, s, H-
4”), 1.79(3H, s, H-5 ), 1.77(3H, s, H-5”)。与
文献报道基本一致 [ 3-4] ,故鉴定为 γ-mangostin。
2.2　化合物Ⅰ与 lipidA的亲和力常数
化合物Ⅰ对 lipidA具有直接结合作用 ,结合速率
常数(kass)为 0.04 ±0.1(mol·L-1)-1·s-1 ,解离速
36 重 庆 理 工 大 学 学 报
率常数(kdiss)为 77.71 ±4.7s-1 ,解离平衡常数(KD)
为 0.53 ×10-3mol·L-1 ,结果如图 1所示。
图 1　化合物Ⅰ与 lipidA结合的反应曲线
2.3　化合物 Ⅰ在体外对 LPS的中和作用
化合物 Ⅰ能够显著抑制 LPS介导的鲎试剂凝
集反应 ,表明其在体外对 LPS具有中和作用 ,结果
如表 1所示 。
表 1　化合物Ⅰ对 LPS的体外中和作用
组别 化合物浓度 /(mg· mL-1)
LPS/
(EU· mL-1)
阴性对照组 — <0.000 2
LPS对照组 — 1.96 ± 0.08
0.5×10-3 0.77 ±0.02＊＊
LPS+化合物Ⅰ组 1×10-3 0.68 ±0.03＊＊
2×10-3 0.63 ±0.12＊＊
　　＊:p<0.05, ＊＊:p<0.01, 与 LPS对照组比较
2.4　化合物 Ⅰ ～ Ⅲ对 LPS和 CpGDNA诱导
RAW264.7细胞释放 TNF-α的抑制作用
LPS或 CpGDNA刺激 RAW264.7细胞后 ,
TNF-α分泌量明显增加 ,化合物 Ⅰ ～ Ⅲ处理后 ,
LPS诱导 RAW264.7细胞释放 TNF-α受到不同程
度的抑制 ,其中 ,化合物Ⅱ和 Ⅲ的有效剂量低于化
合物Ⅰ ,而在与化合物 Ⅱ和 Ⅲ同等剂量下 ,化合物
Ⅰ几乎没有拮抗 LPS作用(实验结果未予显示)。
此外 ,该 3个化合物对另一刺激因子 CpGDNA诱
导 RAW264.7细胞释放 TNF-α并无抑制作用 ,结
果如表 2所示。
表 2　化合物Ⅰ ～ Ⅲ对 LPS和 CpGDNA诱导
RAW264.7细胞释放 TNF-α的影响
组别 化合物质量浓度 /(mg· mL-1)
TNF-α/
(pg· mL-1)
空白对照组 — 14.98 ±7.47
LPS对照组 — 5 136.57 ± 57.53
CpGDNA
对照组 — 3 304.94 ± 32.89
LPS+化合
物Ⅰ组
0.025 2 545.96 ± 421.92＊＊
0.05 1 603.42 ± 884.86＊＊
0.10 1 473.31 ± 461.83＊＊
LPS+化合
物Ⅱ组
0.002 5 2 847.23 ± 749.76＊＊
0.005 1 658.41 ± 824.36＊＊
0.01 463.40 ± 170.84＊＊
LPS+化合
物Ⅲ组
0.002 5 4 098.00 ± 812.04
0.005 1 893.08 ± 261.62＊＊
0.01 380.53 ± 91.80＊＊
CpGDNA+
化合物Ⅰ组
0.025 3 169.41 ± 85.76
0.05 3 141.53 ± 88.48
0.1 3 068.73 ± 15.24
CpGDNA+
化合物Ⅱ组
0.002 5 3 667.40 ± 173.95
0.005 3 375.42 ± 20.26
0.01 3 342.12 ± 39.73
CpGDNA+
化合物Ⅲ组
0.002 5 3 589.17 ± 92.68
0.005 3 457.51 ± 158.15
0.01 3 486.17 ± 45.07
　　＊:p<0.05, ＊＊:p<0.01,与 LPS对照组比较
2.5　化合物 Ⅰ ～ Ⅲ对 RAW264.7细胞活力的
影响
化合物Ⅰ ～ Ⅲ在本实验体系中对 RAW264.7
细胞活力没有明显影响 ,表明化合物Ⅰ ～ Ⅲ对 LPS
诱导 RAW264.7细胞释放 TNF-α的抑制作用并非
37郑新川 ,等:山竹抗细菌内毒素有效成分的研究
因影响细胞活力而产生 ,结果如表 3所示 。
表 3　化合物Ⅰ ～ Ⅲ对 RAW264.7细胞活力的影响
组别 化合物质量浓度 /(mg· mL-1) OD(490nm)值
空白对照组 — 1.17 ±0.04
化合物Ⅰ组
0.025 1.16 ±0.07
0.05 1.10 ±0.03
0.1 1.11 ±0.06
0.2 1.11 ±0.07
化合物Ⅱ组
0.002 5 1.09 ±0.10
0.005 1.04 ±0.07
0.01 1.07 ±0.08
0.02 1.12 ±0.06
化合物Ⅲ组
0.002 5 1.11 ±0.06
0.005 1.14 ±0.05
0.01 1.20 ±0.07
0.02 1.09 ±0.04
3　讨论
山竹 GarciniamangostanaL.为藤黄科(Gutif-
erae)藤黄属(Garcinia)植物 ,原产于马来半岛和马
来群岛 ,我国南方大部已有引种。山竹以果实入
药 ,在东南亚地区广泛用于治疗创伤 、痢疾 、皮肤
感染 、溃疡等 [ 4-5] 。山竹果壳中主要含有 α-, β -和
γ-mangostin等氧杂蒽酮类化合物 [ 6] ,此外还含有
原花青素类成分 [ 7] 、3-已烯-1-醇等挥发性成分[ 8] ,
以及磷 、硫 、镁 、钙 、锌等微量元素[ 9] 。目前 ,对山
竹非氧杂蒽酮类成分 ,特别是水溶性成分的研究
较少。以 lipidA为靶点 ,利用亲和生物传感器技
术从中药中筛选和定向分离抗 LPS有效成分具有
技术可靠 、效率高 、导向性强的优点 [ 10] 。本试验
正是基于此技术从山竹果壳水溶性部位中定向分
离出与 LPS具有直接结合与中和作用的化合物表
儿茶素(化合物Ⅰ ),同时 ,还从难溶性部位分离出
α-mangostin(化合物 Ⅱ)和 γ-mangostin(化合物
Ⅲ),并将三者抗 LPS活性进行了对比研究。现已
知表儿茶素具有抗肿瘤 、抗突变 、降压 、降糖 、降血
脂 、抗动脉粥样硬化及抗辐射等功效 [ 11] ,而 α-和
γ-mangostin对 LPS介导的炎症反应具有抑制作
用[ 12-14] 。在本试验中 ,首次发现表儿茶素在体外
对 LPS具有直接结合作用 ,并且能够中和 LPS,对
LPS具有拮抗作用 。本试验还验证了 α-和 γ-man-
gostin对 LPS的拮抗活性 ,但是发现其不具有结合
与中和 LPS的作用 , 且对另一种病原分子 CpG
DNA介导的炎症反应无抑制作用 。
本试验显示 ,表儿茶素能结合 LPS的生物学
活性中心 lipidA,并且中和 LPS,但其属于黄酮类
成分 ,不同于已知的对 LPS具有结合与中和作用
的多肽类化合物多粘菌素 B(PolymixinB)。多粘
菌素 B是通过其结构上的正电荷基团与 lipidA上
带负电荷的磷酸基团发生结合作用 ,而表儿茶素
对 lipidA的这种结合作用机制值得进一步研究 。
已有研究表明 , TNF-α是脓毒症病程中最早
释放且具有关键作用的炎症介质 [ 15] 。本试验显
示 ,表儿茶素 、α-mangostin和 γ-mangostin均对 LPS
诱导 RAW264.7细胞释放 TNF-α具有抑制作用 。
同表儿茶素相比 , α-和 γ-mangostin的有效剂量更
低 ,表明其活性更强 ,而同等剂量下表儿茶素则没
有拮抗 LPS作用 。但是 , α-和 γ-mangostin对 LPS
没有直接的结合与中和作用(实验结果未予显
示),且提高剂量后其对细胞活力具有明显影响 ,
而表儿茶素则能结合 lipidA,对 LPS具有显著的
中和作用 ,可能是其发挥拮抗 LPS作用的重要原
因。 CpGDNA是一种与 LPS具有类似作用的病原
分子 ,也能够与单核 /巨噬细胞膜上的 TLR9受体
结合 ,活化 p38和 IκB-α等细胞炎性活化效应相
关信号分子 ,上调各种炎症介质的表达 [ 16] 。本试
验显示 ,表儿茶素 、α-mangostin和 γ-mangostin对
CpGDNA诱导 RAW264.7细胞释放 TNF-α均无
抑制作用 ,表明三者对 LPS的拮抗可能具有选择
38 重 庆 理 工 大 学 学 报
性 。虽然已经证实 α-和 γ-mangostin对 LPS介导
的炎症反应具有拮抗作用 [ 4] ,但其作用靶点与机
制实际仍未完全阐明 ,结合本试验结果 ,认为表儿
茶素 、α-mangostin和 γ-mangostin对 LPS的拮抗作
用机制值得进一步分别探讨。
对 RAW264.7细胞活力的检测显示 ,表儿茶
素 、α-mangostin和 γ-mangostin在本试验相应剂量
和培养时间下对细胞活力没有影响 ,表明其对 LPS
诱导 RAW264.7细胞释放 TNF-α的抑制作用不是
通过影响细胞活力而产生。但是 ,试验中发现 ,当
化合物与细胞的培养时间达到 24 h, 0.01 mg·
mL-1或更高剂量的 α-mangostin和 γ-mangostin将
显著影响 RAW264.7细胞活力(p<0.01),而表儿
茶素则无影响(实验结果未予显示)。
虽然在对 LPS诱导 RAW264.7细胞释放
TNF-α的抑制作用实验中 ,表儿茶素的有效剂量
高于 α-mangostin和 γ-mangostin,表明同等剂量下
前者活性弱于后者 ,但是表儿茶素水溶性好 ,对细
胞活力没有明显影响 ,更重要的是其拮抗 LPS的
作用靶点相对明确 ,即其通过直接结合与中和 LPS
发挥拮抗作用 ,不同于 α-mangostin和 γ-mangostin
等氧杂蒽酮类成分。在此基础上 ,表儿茶素在体
内是否也具有拮抗 LPS活性值得进一步研究 。对
表儿茶素的深入研究可能为脓毒症的防治提供新
的手段 。
致谢:感谢四川大学华西药学院药物化学教研室代测
核磁共振波谱和质谱 。
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(责任编辑　刘　舸)
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