全 文 ：CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENES IS
Vol.19 No.1O7 Jan.
收稿日期:2005-12-07;修订日期:2006-3-31
基金项目:福建省科技三项费用资助(No.K02086)
作者简介:洪振丰(1953-),男 ,福建省永春县人,教授 ,研究方向:中草药药
理学及抗突变抗肿瘤中医药研究。 Tel:0591-22861131;E-mail:
zfhong1953@163.com
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论 著
癌变 畸变 突变
【摘要】背景与目的:研究蓍草提取物对大鼠实验性慢性肝损伤 、肝纤维化的预防作用 , 并探讨其作用机制 。 材料与方法:采用
40% CCl 4皮下注射制备肝纤维化大鼠模型 ,分别用 3种不同浓度的蓍草提取物进行干预 ,观察检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨
酶(AST)和肝组织病理学变化 。 结果:蓍草提取物预防给药能降低 CCl 4所致大鼠血清中异常增高的 ALT 、AST含量 ,光镜下观察肝纤
维化模型组大鼠肝细胞严重变性 、坏死 ,胶原纤维明显增加 ,蓍草预防各组大鼠肝细胞病理损伤得到明显改善 。 结论:蓍草提取物对
大鼠实验性肝损伤具有一定程度的预防作用和抗肝纤维化作用 。
【关键词】蓍草;肝纤维化;谷丙转氨酶;谷草转氨酶
中图分类号:R657.32 文献标识码:A 文章编号:1004-616X(2007)01-0016-03
【ABSTRACT】 BACKGROUND ＆ AIM:To study the anti_hepatofibrotic effect of the Achillea millefolium L.(Aml)extract
on experimental hepatic fibrosis and its partial mechanism.MATERIALS AND METHODS:The hepatic fibrosis rat model was
developed by subcutaneous injection of 40%CCl 4 (5 ml/kg) and rats were treated with extract of Aml at 3 ml/kg ,
6 ml/kg or 12 ml/kg.Alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST)levels were measured and liver
tissue examined for pathological changes after HE staining.RESULTS: The extract of Aml could reduce the abnormally
high levels of ALT and AST.Examined by light microscope , the degeneration and necrosis level of hepatocytes and the
distribution of collagen fibrosis were markedly increased in the model group.The pathological changes and the c ollagen
fibrosis associated with hepatic fibrosis decreased significantly in the prophylactically treated groups.CONCLUSION:Extract
of Aml could protect hepatocytes from injury and prevent the progression of hepatic fibrosis in rats.
【KEY WORDS】 Achillea millefolium L.;hepatic fibrosis;alanine aminotransferase;aspartate aminotransferase
蓍草为菊科植物 Achillea millefolium L.蓍草的地
上部分 , 辛苦 、微温 , 入心 、肝 、肺三经 , 具有活血 , 祛
风 , 止痛 , 解毒的功效 [ 1 ]。在福建大田 、永春等地有栽
培 , 用于治疗各型肝炎 , 疗效显著 , 是民间常用的保肝
治肝的药物 。为研究蓍草对大鼠实验性慢性肝损伤 、
肝纤维化的预防作用 , 我们观察了蓍草提取物对 CCl 4
诱发大鼠实验性慢性肝损伤 、肝纤维化的影响 。现报
道如下:
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠 60只 ,清洁级 , 雌雄
各半 , 体重 (180±20)g , 购自中科院上海实验动物中
心 ,合格证书:医动字第 23-016号。
1.2 主要试剂和药品
四氯化碳(CCl 4),广东西陇化工厂生产 ,化学纯。临
用前以花生油调和按体积比配成 40% CCl 4溶液。蓍草
(Achillea millefolium L.Aml)原药材购自闽南永春(农民
蓍草提取物预防
慢性肝损伤 、肝纤
维化的实验研究
洪振丰/陈艳华/周建衡/李天骄
(福建中医学院中西医结合系 ,福建 福州
350003)
Experimental Study of Achillea
Millefolium L .Extract
on Hepatic Injury and Chronic
Hepatic Fibrosis
HONG Zhen_feng ,CHEN Yan_hua ,ZHOU Jian_heng , LI Tian_jiao
(Department of Traditional and Western Medicines , Fujian College
of TCM , Fuzhou ,350003 ,Fujian , China)
第 19卷 第 1期
CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENES IS
O7 1月
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论 著
癌变 畸变 突变
种植), 经福建中医学院中药系专家鉴定为菊科植物蓍
草 。药物蓍草按水煎剂制备法得浓缩药液 ,滤过 ,滤液中
加 3倍量 95%乙醇 ,边加边搅拌 ,使药液含醇量达 70%
左右 ,冷藏 24 h ,过滤 ,弃含粘液质 、糊化淀粉和蛋白质
等杂质的沉淀物 。醇溶液减压回收乙醇至无醇味 ,浓缩 ,
冷藏 24 h , 滤过弃去含脂溶性成分的沉淀 , 滤液含有机
酸 、生物碱等成分 。制成蓍草提取物 1.2 g/ml(每 1 ml
溶液含 1.2 g生药), 4 ℃冰箱保存待用。用前配制成
0.3、0.6、1.2 g/ml的低 、中 、高 3种剂量 。
秋水仙碱由云南西双版纳制药厂生产 , 批准文号:
国药准字 H53021369。将秋水仙碱片研碎用蒸馏水配成
0.02 mg/ml混悬液 , 用作阳性对照药物 。谷丙转氨酶
(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒购于南京建成生物工
程研究所。
1.3 实验方法 Wistar大鼠 60只 , 雌雄各半 ,体
重(180±20)g ,随机分为 6组:空白对照组(8只) ,肝
纤维化模型对照组 (12只), 秋水仙碱阳性对照组 (10
只),蓍草预防低 、中 、高剂量组各 10只。普食普水饲养
1周后参考文献 [ 3] 方法开始造模 , 除空白对照组外其
余各组以 40% CCl 4花生油溶液腹部皮下注射 , 首次
5 ml/kg ,以后 3 ml/kg ,每周 2次 ,连续注射 8周。造模前
两天开始灌胃给蓍草提取物预防 , 一直持续到实验结
束 ,每日给药 1次 ,剂量为:空白组和模型组灌以蒸馏水
10 ml/(kg·d);秋水仙组灌以秋水仙碱 0.2 g/(kg ·d);
蓍草预防低 、中 、高剂量组分别灌以蓍草提取物 3 、 6、
12 g/(kg ·d), 逐日观察大鼠活动 、进食量 、毛色等情
况 。8周末各组大鼠于末次灌胃 24 h后取材 、处死。实
验中有 4只大鼠死亡未列入统计 。
每只大鼠摘眼球法取血约 3 ml ,装入预先滴有肝素
50 μl的 EP管中 , 以 3 000 r/min离心 10 min , 取上清
液 ,赖氏法测定血清 ALT、AST活性 。取血完毕后处死大
鼠 ,立刻剖开腹腔 ,暴露肝脏 ,取肝右中央叶约 0.5 cm3 ,
迅速投入 10%福尔马林溶液中固定。石蜡包埋 ,制备病
理切片 ,HE染色 ,光学显微镜观察肝组织病理变化 。肝
组织病理学改变分为 4级:正常肝组织为“ -” ;肝小叶
结构完整 ,肝细胞点状坏死 ,炎细胞浸润 ,散在的肝细胞
脂肪变性为 “ +” ;纤维组织增生向肝组织小叶内延伸
“ ++” ;肝细胞结构紊乱 ,纤维组织增生 ,桥接坏死 ,早
期肝坏死为“ +++” 。
1.4 统计学方法 记数资料比较用 Ridit检验 ,
计量资料比较用 t或 t检验。
2 结 果
2.1 大鼠一般情况 在实验过程中 ,空白组大鼠
体重自然增加 , 行动敏捷 , 食欲正常 , 皮毛密集而有光
泽;模型组大鼠精神萎靡 , 倦卧少动 ,或易激惹 , 皮毛干
涩 , 蓬松少华 ,食欲欠佳 , 体重增长缓慢或不增长 ,易死
亡 ,尤以雌性大鼠明显;蓍草用药预防各组精神 、毛色及
进食量均好于模型组 。实验过程中模型组大鼠死亡 2
只 ,秋水仙碱组和蓍草预防高剂量组各死亡 1只。死亡
原因经解剖分析均为 CCl 4中毒死亡。
2.2 大鼠血清谷丙转氨酶 、谷草转氨酶的变化
模型组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)
的含量均有明显升高 ,与正常组比较差异有统计学意义
(P<0.01)。蓍草提取物预防组的低 、中 、高剂量组血清
ALT、AST含量均低于模型组 ,与模型组比较差异有统计
学意义(P<0.05), 中剂量与秋水仙碱组比较差异有统
计学意义(P<0.01)。见表 1。
2.3 大鼠慢性肝损伤肝纤维情况 空结果见
表 2。
2.4 大鼠肝脏病理变化 空白组肝小叶结构完
整 , 肝细胞无变性 、坏死 、炎性细胞浸润及纤维增生 。模
型组多数肝小叶正常结构被破坏 ,肝细胞索排列紊乱 ,肝
细胞变性坏死明显 ,表现为脂肪变性和细胞水肿 ,伴有程
度不等 、范围不一的肝细胞坏死及炎性细胞浸润 ,汇管区
扩大 , 有粗细不均的纤维束从汇管区伸出 , 纤维组织增
生 ,提示造模成功。秋水仙碱组可见程度不等 、范围不一
表 2 蓍草对CCl4所致大鼠慢性肝损伤肝纤维化病理分级的影响
Table 2 Aml effect on chronic hepatic fibrosis and hepatic injury
induced by CCl4
compared with blank , ■■P<0.01;compared with model , #P<0.05.
Group n
Patholo gical grade
- + ++ +++
Blank control
Model control
Colchicina
Aml 3 g/kg
6 g/kg
12 g/kg
8
10
9
10
10
9
8
0
0
1
2
1
0
0
4
3
3
3
0
2
3
4
2
3
0
8■■
2#
2
#
3#
2#
表 1.蓍草对CCl 4所致慢性肝损伤肝纤维化大鼠血清ALT、AST的影响
(x-±s)
Table 1 Aml effect on levels of ALT , AST of chronic hepatic fibrosis
and hepatic injury induced by CCl 4 (x-±s)
Compared with blank:■P<0.05 , ■■P<0.01;compared with model
#P<0.05 , ##P<0.01;compared with group of colchicina , ◎P<0.05,
◎◎P<0.01.Aml:Achillea millefolium L.
Group n ALT(IU/L) AST(IU/L)
Blank control
Model control
Colchicina
Aml 3 g/kg
6 g/kg
12 g/kg
8
10
9
10
10
9
42.64±7.02
154.08±16.55■■
116.27±23.56■■#
81.58±27.99 ■##
58.30±17.94##◎◎
117.63±24.86■■#
67.64±7.92
225.44±27.91■■
179.29±34.40■■
152.00±39.55■■# #
144.95±26.62■■# #
172.21±30.74■■#
CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENES IS
Vol.19 No.1O7 Jan.
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论 著
癌变 畸变 突变
的肝细胞坏死区及变性的肝细胞 , 以脂肪变性为主 , 可
见少量正常肝细胞 。提示秋水仙碱有预防肝纤维化的作
用 。蓍草各剂量组肝细胞结构基本正常 , 纤维组织增生
明显减轻 ,脂肪变性 ,炎性细胞浸润减少(见图 1)。
3 讨 论
体内许多组织均含有谷丙转氨酶 (Alanine
aminotransferase , ALT)、 谷 草 转 氨 酶 (Aspartate
aminotransferase , AST), 其中 ALT主要存在于肝细胞内 ,
AST主要存在于心肌 ,其次为肝脏 。当肝细胞有损害时 ,
由于肝细胞坏死 , 细胞膜通透性增加 , 这两种酶即可大
量渗入血液 ,而使血中酶活性增高。所以血清中这两种
转氨酶活性的增高在一定程度上反映了肝细胞损害和
坏死的程度 。在本实验研究中 , 模型组大鼠血清 ALT 、
AST的活性均有明显升高 , 与正常组比较差异均有统计
学意义 (P<0.01), 提示 CCl 4引起肝损伤可致血清
ALT、AST含量升高 ,与文献报道一致 [ 3]。蓍草提取物预
防用药和治疗给药各组血清ALT、AST水平均低于模型
组(P<0.05 , P<0.01), 其中蓍草提取物预防低 、中剂
量组均明显优于秋水仙碱组(P<0.01)。提示蓍草提取
物可使转氨酶明显下降 , 肝功能损害明显减轻 , 疗效较
秋水仙碱组为佳 ,尤以中剂量组疗效显著 。
经观察蓍草 3个剂量组的肝组织仍发生肝细胞变
性 、坏死及炎性细胞浸润 ,但病变程度远较模型组为轻 ,
表明蓍草对 CCl4中毒引起的肝细胞损伤具有很好的保
护作用 ,有助于抑制肝损伤而延缓肝纤维化的作用 。提
示蓍草较秋水仙碱具有更好的肝脏保护和抗炎作用 ,对
肝纤维化的防治起积极作用 。因此保护肝细胞 ,减轻肝
细胞变性坏死 ,清除肝纤维化的诱发因素可能是蓍草提
取物抗肝纤维化的作用机制之一 。秋水仙碱是从百合科
植物秋水仙或我国丽江山茨菇中提取的一种生物碱 ,是
较早应用于抗肝纤维化的药物 , 国外实验证明 , 秋水仙
碱在体外可抑制胶原的合成 、 分泌或延缓胶原纤维沉
积[ 4]。在肝纤维化实验研究中常被用作阳性对照药物。
因此本课题采用秋水仙碱作为阳性对照组的药物 ,并参
考采用姜氏等在实验中的使用剂量 0.2 mg/kg [ 5]。
肝纤维化是慢性肝病患者肝脏最重要的组织学改
变 ,是演变成肝硬变的必经之途 ,其肝纤维化程度决定了
肝病预后。近年来的研究表明 , 肝纤维化的病理是可逆
的[ 6]。只要在肝纤维化阶段而非延误至中晚期肝硬变 ,进
行合理治疗是完全可以达到逆转肝纤维化进程 , 进而缓
解乃至治愈肝纤维化的目的 。但由于肝纤维化的复杂 、
顽固性 ,需长期用药 ,故研制高效无明显毒副作用的抗肝
纤维化药物已成为研究的热点之一。近年来 , 国内外学
者对肝纤维化的发生机制 , 调节因素等方面进行了大量
卓有成效的研究 , 但在阻断肝纤维化上仍缺乏有效措
施。而中医药在逆转肝纤维化及改善临床症状上体现出
了较大的潜力和优势。蓍草是一年生草本植物 , 生产周
期短 ,种植方便 ,产量高 。蓍草预防肝纤维化作用的发现
为寻找新的预防肝纤维化药物提供了有利的实验依据 ,
有必要对其有效成分和作用机制开展进一步的研究。
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图 1a 正常肝细胞。肝小叶结构完整 , 肝细胞无变性坏死; 图 1b +肝损。伤肝小叶结构完整 ,肝细胞点状坏死 ,炎细胞浸润 ,散在的肝细胞脂肪变性; 图 1c ++肝损伤。 纤维组织增生向肝组织小叶内延伸; 图
1d +++肝损伤。多数肝小叶正常结构被破坏 , 肝细胞索排列紊乱 , 肝细胞变性坏死明显 ,纤维组织增生
Figure 1a Normal liver cells, whose constructure of hepatic lobules was
integrated , and its cell was not degenerated or necrotic; Figure 1b+damage , whose constructure of hepatic lobules was integrated , l iver cell
necrotic was like spots, and inflamed cell was infil trated , and sporadic
l iver cell was dengenerated like fat; Figure 1c ++damage , fibrous
tissue was proliferative and extend to hepatic lobules; Figure 1d+++ damage , normal constructure of most hepatic lobules was
damaged , arrange of liver cell cord was indiscriminate , degentration and
necrosis of liver cells was obvious, and fibrous tissue was proliferative