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[ 9] 杨景锋 , 赵天才 ,白海侠 , 等.抵当四五汤对糖尿病血管
病变大鼠血液流变性的影响 [ J] .陕西中医 , 2008, 29
(8):1077-1078.
[ 10] 杨景锋 ,赵天才 , 白海侠 ,等 .抵当四五汤对糖尿病血
管病变大鼠血脂及肿瘤坏死因子的影响 [ J] .陕西中
医学院学报 , 2008, 31(4):66-68.
田基黄苷抗大鼠肝纤维化作用的实验研究
李沛波 ,杨翠平 ,王永刚 ,彭　维
(中山大学生命科学学院 ,广东 广州 510275)
　　摘要　目的:研究田基黄苷(Quercetin-7-β-D-rhamnose)抗大鼠肝纤维化作用。方法:采用胆总管结扎法制备肝
纤维化大鼠模型;从造模当天起 , 腹腔注射田基黄苷(0.5、 1.0、 2.0 mg/kg), 给药 4 w后 , 测定血清总胆红素
(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白
(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、TNF-α水平及肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性 、
丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(Hyp)的含量;采用 HE染色观察肝细胞结构和肝纤维化程度;采用免疫组织化学法检
测肝组织 α-肌动蛋白(α-SMA)的表达。 结果:田基黄苷能显著降低胆总管结扎诱导的肝纤维化大鼠血清 TBIL、
DBIL、ALT、AST、PC-Ⅲ 、HA、LN的水平及肝组织中 Hyp的含量。此外 , 也能提高肝组织 SOD、GSH-Px的活性 , 降低
肝组织 MDA及血清中 TNF-α的含量。病理组织观察结果显示:田基黄苷组大鼠肝小叶结构较清晰 ,肝内小胆管以
汇管区为中心轻度增生 ,增生胆管周围伴轻度纤维组织增生 , 肝组织胶原纤维沉积显著减轻;且肝组织 α-SMA蛋白
表达量减少。结论:田基黄苷能抑制胆总管结扎诱导的大鼠肝纤维化的形成 , 其抗肝纤维化作用与其抗氧化作用
及抗 TNF-α的分泌有关。
关键词　田基黄苷;肝纤维化;胆总管结扎;实验研究
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2011)03-0424-05
收稿日期:2010-06-03基金项目:广东省科技计划项目(2010B050100013)作者简介:李沛波(1973-),男,博士 ,讲师 ,主要从事药理学和中药新药研究与开发。
　　田基黄苷是田基黄的活性成分 ,笔者前期研究
表明田基黄苷能显著抑制 CCl4和 D-Gal所致的大
鼠肝损伤和 ANIT所致的小鼠胆汁淤积 ,具有显著
保肝退黄作用 〔1〕。笔者进一步对田基黄苷抗肝纤
维化作用进行了实验研究 ,现报道如下。
1　材料
1.1　实验动物　SPF级 SD大鼠 ,体质量 200 ～ 250
g,由广东省医学实验动物中心提供 , 许可证号:
SCXK(粤)2008-0002。
1.2　药物及试剂　田基黄苷 ,由本实验室从田基
黄中提取分离得到(取田基黄 1 kg,用 70%乙醇提
取 。提取浓缩液经聚酰胺 、正相硅胶和 Sephadex
LH-20柱层析 ,室温放置析出大量黄色粉末状固体 ,
过滤 ,再用甲醇重结晶 ,即得到田基黄苷。纯度大于
99.0%);水飞蓟素胶囊 ,德国马博士大药厂生产;
TBIL、DBIL、ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、Hyp检
测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠 TNF-
αELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公
司;HA、LN、PC-Ⅲ放免试剂盒购自上海海军医学研
究所生物技术中心;鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆
抗体和非生物素二步法免疫组化检测试剂购自北京
中山金桥生物技术有限公司 。
2　方法
2.1　动物造模 、分组及指标检测　取 SD大鼠随机
分为 6组 ,即正常对照组 、模型组 、水飞蓟素阳性对
照组及田基黄苷低 、中 、高剂量组 。造模各组大鼠按
4mL/kg腹腔注射浓度为 10%的水合氯醛溶液进行
麻醉 ,暴露肝脏下胆管 ,结扎肝脏与胆管交界处和胆
管与胰腺交界处 ,将两处中间的胆管剪除以造成完
全胆管阻塞大鼠模型;正常对照组不作手术处理。
从造模当天起 ,水飞蓟素组大鼠每天按剂量 50 mg/
kg灌服水飞蓟素胶囊 1次 ,田基黄苷低 、中 、高剂量
组每天分别按剂量 0.5、1.0、2.0 mg/kg腹腔注射田
基黄苷 1次 ,连续 28 d。末次给药 1 h后 ,各组大鼠
用乙醚轻度麻醉 ,心脏采血 ,取血清采用试剂盒检测
TBIL、ALT、AST、AKP、GLB、ALB、HA、LN、PC-Ⅲ、
TNF-α水平;然后打开腹腔迅速取出肝组织并在生
理盐水下清洗 ,匀浆后采用试剂盒检测 SOD、MDA、
·424· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2011.03.031
GSH-Px、Hyp;另切取大鼠肝脏 ,用中性 10%福尔马
林固定 ,其中左叶进行 HE染色 ,以观察肝细胞结构
和肝纤维化程度 ,右叶用于免疫组织化学法(SABC
法)检测肝组织 α-肌动蛋白(α-SMA)的表达。
2.2　统计学处理　实验数据以 x±s表示 ,采用的
统计软件为 SPSS16.0, 组间比较采用 One-way
ANOVA统计处理。
3　结果
3.1　田基黄苷对肝纤维化大鼠血清 TBIL、DBIL、
ALT、AST的影响　结果如表 1所示 ,与正常对照组
比较 ,模型组大鼠血清 TBIL、DBIL、ALT和 AST水
平均显著升高(P<0.01),提示该模型大鼠的胆道
梗阻明显 ,且肝细胞明显破坏。田基黄苷低 、中 、高
剂量组大鼠血清 TBIL、DBIL、ALT和 AST的水平与
模型组比较差异显著(P<0.01或 0.05),且呈量效
关系 ,说明田基黄苷能降低胆总管结扎所致肝纤维
化大鼠的黄疸水平及肝损伤程度 ,提示田基黄苷对
胆总管结扎所致肝纤维化大鼠具有保肝和降低胆红
素的作用 。
3.2　田基黄苷对肝纤维化大鼠血清 PC-Ⅲ、HA、
LN及肝组织 Hyp的影响　结果如表 2所示 ,与正常
对照组比较 ,模型组大鼠血清 PC-Ⅲ、HA、LN含量
和肝组织中 Hyp含量均显著升高(P<0.01),提示
该模型大鼠具有明显的肝纤维化病理改变。田基黄
苷低 、中 、高剂量组大鼠血清中 PC-Ⅲ、HA、LN含量
和肝组织中 Hyp含量与模型组比较差异显著(P<
0.05或 P<0.01),且呈量效关系 ,提示田基黄苷对
胆总管结扎所致大鼠肝纤维化具有抑制作用 。
　　表 1 　田基黄苷对肝纤维化大鼠血清 TBIL、DBIL、ALT、AST的影响( x±s)
组别 n/只 剂量 /(mg/kg) TBIL/(μmol/L) DBIL/(μmol/L) ALT/(U/L) AST/(U/L)
正常对照组 10 - 5.45±1.43 3.91±1.06 52.32±12.21 106.25±41.09
模型组 9 - 28.79±4.62## 19.65±3.98## 389.58±67.43## 695.92±112.44##
水飞蓟素组 10 50 11.54±2.15＊＊ 5.97±1.73＊＊ 137.34±42.65＊＊ 213.43±42.78＊＊
低田基黄苷组 9 0.5 21.51±3.28＊ 14.82±4.32＊ 242.87±56.79＊ 336.47±103.32＊＊
中田基黄苷组 10 1.0 17.43±3.56＊＊ 11.83±3.02＊＊ 177.41±40.12＊＊ 304.57±121.48＊＊
高田基黄苷组 10 2.0 10.47±2.51＊＊ 5.52±2.87＊＊ 115.43±35.49＊＊ 247.38±78.96＊＊
　　注:与正常对照组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
　　表 2 　田基黄苷对肝纤维化大鼠血清 PC-Ⅲ 、HA、LN及肝组织 Hyp的影响( x±s)
组别 n/只 剂量 /(mg/kg) PC-Ⅲ /(μg/L) HA/(μg/L) LN/(μg/L) Hyp/(μg/g)
正常对照组 10 - 97.46±23.87 219.88±57.36 52.85±12.64 133.67±16.57
模型组 9 - 298.89±51.54## 482.61±135.71## 209.64±42.19## 668.93±121.44##
水飞蓟素组 10 50 167.54±39.42＊＊ 278.93±46.81＊＊ 85.61±21.08＊＊ 259.02±41.82＊＊
低田基黄苷组 9 0.5 170.35±32.17＊＊ 354.75±99.36＊ 143.73±32.06＊ 472.36±155.43＊
中田基黄苷组 10 1.0 155.92±29.68＊＊ 289.87±50.29＊＊ 98.75±12.94＊＊ 309.72±87.61＊＊
高田基黄苷组 10 2.0 134.56±27.66＊＊ 259.51±42.35＊＊ 90.92±21.84＊＊ 198.28±28.63＊＊
　　注:与正常对照组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.3　田基黄苷对肝纤维化大鼠肝组织 SOD、GSH-
Px、MDA及血清 TNF-α的影响　结果如表 3所示 ,
与正常对照组比较 ,模型组大鼠肝组织 SOD、GSH-
Px活性显著降低(P<0.01),而 MDA含量显著提
高(P<0.01),提示肝纤维化模型大鼠肝脏的抗氧
化水平显著降低 ,氧化损伤明显 。此外 ,可通过多种
机制参与肝纤维化过程调控的重要细胞因子 TNF-α
也显著升高(P<0.01)。而田基黄苷低 、中 、高剂量
组大鼠肝组织 SOD、GSH-Px活性 、MDA含量及血清
TNF-α含量与模型组比较差异显著 (P<0.05或 P
<0.01),并呈量效关系 ,表明田基黄苷能提高肝纤
维化模型大鼠肝脏的抗氧化能力 ,显著降低肝脏的
氧化损伤 ,也能抑制 TNF-α的分泌 。
3.4　田基黄苷对肝纤维化大鼠肝组织病理变化的
影响　肝组织 HE染色结果如图 1所示 ,正常对照组
肝小叶结构清晰 ,小叶内肝细胞基本正常 ,汇管区结
构清晰 ,汇管区及汇管区周围未见小胆管及纤维组织
增生;模型组见肝小叶结构模糊 ,小叶内肝细胞水肿 ,
局灶肝细胞坏死 ,小胆管大量增生 ,以汇管区为中心
放射状向肝实质内延伸 ,增生的胆管呈花环样 ,增生
·425·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月
胆管周围伴纤维组织增生及炎细胞浸润;水飞蓟素组
见肝小叶结构较清晰 ,小叶内局灶肝细胞呈点状坏
死 ,肝内小胆管以汇管区为中心轻度增生 ,增生胆管
周围伴轻度纤维组织增生及少量炎细胞浸润;中剂量
田基黄苷组可见肝小叶结构较清晰 ,小胆管以汇管区
为中心轻度增生 ,增生胆管周围伴轻度纤维组织增生。
　　表 3 　田基黄苷对肝纤维化大鼠肝组织 SOD、GSH-Px活性及 MDA、TNF-α含量的影响( x±s)
组别 n/只 剂量 /(mg/kg) SOD/(U/mg) GSH-Px/(U/mg) MDA/(nmol/mg) TNF-α/(pg/mL)
正常对照组 10 - 129.78±29.41 982.01±128.49 1.76±0.14 125.54±31.09
模型组 9 - 35.51±8.19## 321.82±65.27## 3.23±0.19## 358.29±48.91##
水飞蓟素组 10 50 63.43±12.34＊＊ 906.72±152.92＊＊ 2.01±0.21＊＊ 166.29±34.57＊＊
低田基黄苷组 9 0.5 45.42±9.63＊ 528.43±87.34＊＊ 2.66±0.35＊ 226.51±50.32＊＊
中田基黄苷组 10 1.0 70.76±23.72＊＊ 815.94±187.38＊＊ 2.04±0.39＊＊ 170.34±25.51＊＊
高田基黄苷组 10 2.0 79.88±21.93＊＊ 941.12±167.29＊＊ 1.89±0.11＊＊ 157.28±35.28＊＊
　　注:与正常对照组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
图 1　田基黄苷对肝纤维化大鼠肝组织的影响(×100)
3.5　田基黄苷对肝组织 α-SMA蛋白表达的影响
　大鼠肝组织 α-SMA蛋白表达免疫组化染色结果
如图 2所示 ,大鼠肝组织 α-SMA蛋白表达以细胞胞
质为主 ,着色为棕黄色 ,主要分布于汇管区 。正常对
照组可见 α-SMA在肝组织汇管区少量阳性表达;模
型组可见 α-SMA在肝组织内阳性表达的面积大大
增加;水飞蓟素组 α-SMA在肝组织内阳性表达的面
积小于模型组;田基黄苷中剂量组 α-SMA在肝组织
内阳性表达的面积明显小于模型组 ,趋于正常。
4　讨论
肝纤维化是机体对物理 、化学以及生物方面刺
激引起的各种慢性肝损伤的一种修复反应 ,也是多
种慢性肝病的共有病理变化 。在各种致病因素作用
下 ,静止期的肝星状细胞(HSC)被激活并增殖 、转化
·426· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月
图 2　大鼠肝组织切片 α-SMA蛋白表达免疫组化染色图(×400)
为肌成纤维细胞样细胞 ,其细胞外基质(ECM)的合
成和分泌上调 ,而降解减少 ,最终导致 ECM积聚而
发生肝纤维化乃至肝硬化 〔2〕。在 HSC的激活过程
中 ,重要的环节有:(1)Kupfer细胞在 LPS等因素的
刺激下产生和分泌 TNF-α、TGF-β1、PDGF等细胞因
子激活 HSC。 (2)TNF-α直接作用于肝细胞 ,导致
肝细胞凋亡 ,凋亡后产生的物质即可激活 HSC〔3〕 ,
如 Gabele, E等的研究结果表明:TNF-α对于胆道结
扎导致的急性肝损伤和肝纤维化是必须的〔4〕。 (3)
肝细胞膜受损时 ,通过脂质过氧化作用释放大量的
活性氧 ,后者即可激活 HSC〔5〕。目前常见的肝纤维
化动物实验研究模型主要有:化学性 (四氯化碳和
二甲基亚硝胺)、免疫性 (猪血清)、酒精性 、胆汁性
(胆总管结扎)等肝纤维化动物模型。其中 ,胆汁性
肝纤维化动物模型具有肝纤维化形成快 、自发逆转
率低 、实验指标稳定等特点 。故该模型在国内外广
泛用于考察药物的直接抗肝纤维化作用 ,以及筛选
非创伤性肝纤维化血清学诊断指标等研究 〔6〕。
　　本实验研究显示 ,田基黄苷能显著降低胆总管
结扎诱导的胆汁性肝纤维化大鼠血清中 TBIL、
DBIL、ALT、AST、PC-Ⅲ 、HA、LN的水平及肝组织中
Hyp的含量;减少胆管周围纤维组织增生及肝组织
胶原纤维沉积;也能抑制肝组织 α-SMA蛋白表达 ,
说明田基黄苷具有良好的抗胆汁性肝纤维化的作
用。此外 ,田基黄苷也能提高肝组织 SOD、GSH-Px
的活性 ,降低肝组织 MDA及血清 TNF-α含量 ,提示
田基黄苷抗肝纤维化作用可能与其抗氧化作用及抑
制 TNF-α的分泌有关 ,但对于其抑制 TNF-α分泌的
具体机制及在抗肝纤维化中的作用尚待进一步研
究。
参 考 文 献
[ 1] 李沛波 , 王永刚 ,吴钉红 , 等.田基黄中 3个黄酮类化合
物保肝退黄作用的实验研究 [ J] .中山大学学报(医学
科学版), 2007, 28(1):40-43.
[ 2] RebeccaG.Wels.Mechanismsofliverfibrosis:Newin-
sightsintoanoldproblem[ J] .DrugDiscoveryToday:Dis-
easeMechanisms, 2006, 3(4):489-495.
[ 3] CanbayA, FriedmanS, GoresGJ.Apoptosis:thenexusof
liverinjuryandfibrosis[ J] .Hepatology, 2004, 39(2):
273-278.
[ 4] GabeleE, FrohM, ArteelGE, etal.TNFαisrequiredfor
cholestasis-inducedliverfibrosisinthemouse[ J] .Bio-
·427·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月
chemicalandBiophysicalResearchCommunications, 2009,
378(3):348-353.
[ 5] NovoE, MarraF, ZamaraE, etal.Dosedependentanddi-
vergentefectsofsuperoxideaniononceldeath, prolifera-
tion, andmigrationofactivatedhumanhepaticstelatecells
[ J] .Gut, 2006, 55(1):90-97.
[ 6] 李志钢 ,杨晋翔 , 张伟 ,等 .肝纤维化实验动物模型的建
立与评价 [ J] .北京中医药大学学报(中医临床版),
2009, 16(4):43-45.
合欢皮总皂苷对小鼠呼吸系统的毒性及机制研究
康晓星 ,高越颖 ,余行云 ,冯　磊 ,陈　爽 ,邱丽颖＊ ,金　坚
(江南大学医药学院)
　　摘要　目的:研究合欢皮总皂苷对小鼠呼吸系统的毒性及机制。方法:以昆明小鼠为受试对象 ,实验随机分为
生理盐水对照组 、合欢皮总皂苷低剂量致毒组(7.5 mg/kg)、合欢皮总皂苷高剂量致毒组(750mg/kg), 灌胃给药 14
d后 , 气管插管术 ,生物信号记录系统记录呼吸的频率和幅值。取肺组织 , HE染色观察病理形态的变化 , 生化法测
定肺组织 SOD和 GSH-Px活性 ,末端标记法(TUNEL法)检测肺组织细胞凋亡 ,免疫组织化学法检测肺组织 COX-1、
COX-2基因蛋白的表达。结果:合欢皮总皂苷致毒剂量对小鼠呼吸频率和幅值无显著影响;肺组织病理变化明显 ,
其 SOD、GSH-Px活性与生理盐水组比较致毒组肺组织 SOD和 GSH-Px的活性显著降低 , 与低剂量致毒组比较高剂
量致毒组 SOD活性显著降低而 GSH-Px活性无显著差异;与对照组比较 , 致毒组肺间质及支气管黏膜上皮细胞凋
亡数目增多 , COX-2表达增加 , COX-1表达无显著改变。结论:致毒剂量合欢皮总皂苷对小鼠呼吸频率和肺通气量
无明显影响 , 对呼吸系统的毒性主要表现在促使支气管黏膜上皮细胞凋亡 、肺组织的氧化损伤及炎症反应。
关键词　合欢皮总皂苷;细胞凋亡;氧化损伤;
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2011)03-0428-04
收稿日期:2010-05-24基金项目:江苏省中医药管理局资助项目(HE0817KY);无锡市科技局资助项目作者简介:康晓星(1987-),女,硕士研究生 ,主要从事天然药物的提取分离及心血管药理的研究。＊通讯作者:邱丽颖 , E-mail:qiulydoc@sina.com。
　　合欢皮为豆科落叶乔木植物合欢 (Albizia
julibrisinDuraz)的树皮 。有安神解郁 ,活血消肿等
功效〔1〕。笔者前期工作发现合欢皮提取液有显著
抗肿瘤和新生血管的作用 〔2-4〕 ,其主要成分为皂苷 。
肿瘤新生血管生成抑制剂及皂苷对呼吸系统的毒性
少见报道 ,故本实验对合欢皮总皂苷对呼吸系统的
毒性作用及机理进行了研究。
1　材料
1.1　实验动物　昆明种清洁级小鼠雌雄各半 ,体
质量 18 ～ 22g,购自上海中国科学院实验动物中心 ,
合格证号:沪 SXK2007-001。饲养温度 25 ℃,相对
湿度 55%,在恒温(22 ℃),光照周期 12 h∶12 h环
境中饲养 ,动物适应 1 w后开始实验。处理前禁食
4 h,任意饮水 。
1.2　药品与试剂　本实验所用的合欢皮总皂苷的
提取分离路线:70%乙醇回流提取 2次 ,提取液浓缩
至无乙醇。通过 D101型大孔树脂柱吸附后依次用
水 、35%和 80%乙醇进行梯度洗脱 ,收集 80%洗脱
组分 ,冷冻干燥 ,所得冻干粉即为实验用样品。细胞
凋亡及 COX测定试剂盒均购自武汉博士德生物有
限公司;超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase,
SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,
GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;其
余试剂均为国产分析纯 。
2　方法
2.1　动物分组及处理　动物随机分为生理盐水对
照组 、低剂量致毒组(7.5 mg/kg)及高剂量致毒组
(750mg/kg),每组 10只 ,雌雄各半。给药剂量参照
本实验室急性毒理学研究所得的最小致毒量和最小
致死量确定。禁食 4 h后一次性灌胃给药 ,对照组
给予等体积生理盐水。
2.2　呼吸频率和幅值的测定　给药 14 d后 , 8%
水合氯醛腹腔麻醉 ,仰卧位固定 ,气管插管 ,连接生
物换能器 ,埃德公司 PowerLab八导生物信号记录
系统记录呼吸的频率和幅值 。
2.3　肺组织结构显微观察　小鼠给药 14 d后 ,脱
颈椎处死 ,速取肺新鲜组织 ,生理盐水洗净 , 10%福
尔马林固定 ,进行组织切片。采用常规切片(厚度 5
·428· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月