全 文 ： 2012, Vol. 33, No. 11 食品科学 ※生物工程210
苦荞类异黄酮还原酶基因(FtIRL)的
克隆及序列分析
赵海霞，李成磊，白悦辰，陈 惠，吴 琦 *
(四川农业大学生命科学与理学院，四川 雅安 625014)
摘 要：利用RT-PCR技术，从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到类异黄酮还原酶基因(IRL)的开放阅读框序列
(ORF)，命名为 FtIRL。序列分析表明：FtIRL含一个长 942bp的ORF，编码 313个氨基酸，其氨基酸序列与金
荞异黄酮还原酶 FcIFR (GenBank登录号ABV02071)同源性最高，达到 97%；与其他植物 IRL同源性为 44%～73%。
生物信息学分析表明：FtIRL推导的蛋白质含有典型的底物结合口袋和保守的NADPH结合位点，符合短链脱氢酶
家族的结构特征。构建基于氨基酸的系统发育树表明，苦荞 FcIFR虽然在氨基酸序列上与其他植物的异黄酮还原酶
(IFR)有较高的同源性，但其生物学功能可能更接近落叶松脂醇还原酶(PLR)。
关键词：苦荞；类异黄酮还原酶；基因克隆；序列分析
Cloning and Sequence Analysis of the Isoflavone Reductase-like (FtIRL) Gene from Fagopyrum tatarium
ZHAO Hai-xia，LI Cheng-lei，BAI Yue-chen，CHEN Hui，WU Qi*
(College of Life and Basic Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)
Abstract ：The cDNA sequence of isoflavone reductase-like gene IRL from Fagopyrum tataricum was amplified by RT-PCR.
Sequencing showed that the ORF of IRL gene from F. tataricum (named as FtIRL) was 942bp, probably encoding a protein of
313 amino acids. Further analysis indicated that the deduced FcIFR protein had homology values of 97% with other plants
,
IRLs.
FtIRL possessed two short-chain dehydrogenase/reductase conserved motifs: a substrate-binding pocket and a NADPH binding
site. The phylogenetic tree constructed based on amino acid sequences indicated that, although the amino acid sequence of IRL
gene from F. tataricum had high homology with that of isoflavone reductase (IFR) genes from other plants, its biological function
might be more similar to that of pinoresinol lariciresinol reductase (PLR).
Key words：Fagopyrum tataricum；isoflavone reductase-like protein；gene cloning；sequence analysis
中图分类号：Q943.2；S517.032 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)11-0210-05
收稿日期：2011-07-04
作者简介：赵海霞(1977 —)，女，讲师，硕士，研究方向为基因工程。E-mail：aasky8@163 .com
*通信作者：吴琦(1973 —)，男，教授，博士，研究方向为植物分子生物学。E-mail：wuqiwq@yahoo.cn
苦荞(Fagopyrum tatarium)也称鞑靼荞麦，属蓼科
植物，原产于我国及印度等地，在我国主要分布在西
南山区、云贵高原及陕西和山西等地。随着经济和科
学的发展，以及对苦荞营养价值和保健功能的深入研
究，对苦荞的利用和开发也越来越受到重视[1]。祖国医
学《本草纲目》记载，苦荞性味苦、平寒，有益气
力、续精神、利耳目和降气宽肠健胃的作用。现代临
床医学表明，食用苦荞及其制品可显著降低人体血液中
的胆固醇和血糖含量，对高血压、冠心病和中风等病
人都有辅助疗效作用，对糖尿病有良好的治疗和缓解作
用。这些作用都与苦荞中富含的黄酮类物质有关[ 2 ]。
异黄酮还原酶(isoflavone reductase，IFR)、落叶
松脂醇还原酶(pinoresinol-lariciresinol reductases，PLR)
和苯基香豆满苄醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether
reductase，PCBER)是合成木质素( l ignans)和异黄酮
( i s o f l a v on e )等植物次生代谢产物的关键酶，是具有
NADPH依赖性的芳香族还原酶[3]，属于同源性较高的短
链脱氢酶家族(short-chain dehydrogenase/reductase，
SDR)成员[4]。由于对 IFR、PLR和 PCBER各成员生物学
功能和反应机制的了解还比较有限，学界将其统一称为
类异黄酮还原酶(isoflavone reductase-like，IRL)[5-6]。近
年来的研究发现，IRL参与了植物对生物和非生物胁迫
的应答[7]，与植物中多种抗毒素的合成密切相关，例如
紫花苜蓿(Medicago sativa)中MsIFR是合成美迪紫檀素
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(medicarpin)的关键酶[8]。本研究以苦荞为材料，克隆编
码苦荞 IRL的 cDNA序列，为进一步研究苦荞黄酮类化
合物的合成表达调控与其抗逆生理提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞：“西荞二号”购自四川西昌学院。
Taq DNA聚合酶、质粒DNA小量提取试剂盒、胶
回收试剂盒、克隆载体 pMD19-T 日本 TaKaRa公司；
RNA提取试剂植物 RNAout试剂盒 天泽基因工程有限
公司；逆转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Syn-
thesis Kit 加拿大 Fermentas公司；其他化学试剂均为
国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取
苦荞花蕾总RNA提取所需器皿均按 RNA操作常规
方法处理。以植物RNAout试剂盒提取苦荞花蕾总 RNA，
电泳检验其完整性并置于液氮中保存。
1.2.2 RT-PCR制备 cDNA第一链
依次向 200μL PCR管中加入苦荞花总RNA 4μL、
引物Oligo-dT (10μmol/L) 1μL、DEPC H2O 7μL，温和
混匀后，70℃变性 5min，立即置于冰上。向上述 PCR
管中加入 5× R ea ct ion B uf fe r 4μL、R iboLock T M
Riobonuclease Inhibitor 1μL、dNTP Mix (10mmol/L) 2μL，
37℃反应 5min除去可能的RNA酶污染。上述 PCR管中
加入 1μL RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase，
反应总体积 20μL。42℃反应 60min；70℃条件下 10min
灭活反转录酶，将合成的 cDNA第一链保存于－ 20℃冰
箱备用。
1.2.3 苦荞 IRL基因开放阅读框序列(ORF)的克隆
根据NCBI上已经发表的金荞(Fagopyrum cymosum)
异黄酮还原酶基因序列(GenBank登录号EU116032)设计一
对特异引物 IRL-f和 IRL-r。上游引物 IRL-f包含基因的起
始密码ATG，序列为：5＇-GATGGCAAAGGGCAAGG
TG-3＇(下划线为起始密码)；下游引物IRL-r位于基因的3＇AUTR
区域，序列为：5＇-GCTCGCTCAAGAAAGGGGT-3＇。
苦荞类异黄酮还原酶基因 cDNA的 PCR反应体系：
ddH2O 34μL、10×Buffer 5μL、25mmol/L MgCl2 3μL、
dNTP mixture 3μL、20μmol/L上下游引物各 1.5μL、模
板 cDNA 1μL、Taq DNA聚合酶 1μL (5U/μL)，总体
积 50μL。PCR反应参数：94℃预变性 3min；94℃变
性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸 150s，共 30个循
环；72℃保温 8min。利用胶回收试剂盒回收 PCR扩增
片段并克隆到 pMD 19-T载体，筛选阳性转化子送上海
英骏生物技术公司测序。
1.2.4 苦荞 IRL的生物信息学分析
测序结果采用http://genes.mit.edu/GENSCAN.html和
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgic进行序列比对分
析。采用 http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/
预测蛋白质二级结构，http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/和 http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/预测信
号肽序列和亚细胞定位。采用 SWISSS MODEL (http://
swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质结构三维建模。采用
用软件MEGA 4.0构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 苦荞花总RNA的提取及其 IRL基因ORF的扩增
由图 1苦荞花总RNA经 2%琼脂糖凝胶电泳可知，
28S RNA和 18S RNA的条带清晰可见，亮度比接近 2:1，
RNA完整性较好。以反转录后的 cDNA为模板，使用
引物 IRL-f和 IRL-r进行 PCR扩增。由图 2可知，扩增
得到一条约 1.2kb的特异条带。
2.2 FtIRL的序列分析
PCR扩增产物经克隆并测序后，得到长度为 1081bp
的核苷酸序列，包含引物设计位点 IRL-f和 IRL-r，将该
序列命名为 FtIRL。http://genes.mit.edu/GENSCAN.html
1、2 . 苦荞花总 RNA。
图 1 苦荞花总 RNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Electrophoresis of total RNA extracted from F. tataricum
28S
1 2
18S
5.8S
M. DNA MarkerⅢ；1、2.苦荞 IRL基因 ORF扩增产物。
图 2 苦荞 IRL基因 ORF的扩增
Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products of IRL ORF from
F. tataricum
4500bp
M 1 2
3000bp
2000bp
1200bp
800bp
500bp
200bp
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网站预测结果表明，FtIRL包含 1个长度为 942bp的完
整ORF，编码 313个氨基酸；含有植物黄酮类化合物合
成相关基因典型起始序列ATGGCA[9]；终止密码 TAG后
含有一段 138bp的 3＇-UTR。将 FtIRL推导的氨基酸序列
提交 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgic进行同源比
对，结果表明 FtIRL的氨基酸序列与 FcIFR(GenBank登
录号ABV02071)同源性最高，达到97%；与其他植物 IRL
同源性为 44%～73%之间，表明成功克隆苦荞 FtIRL的
c D N A 序列。
将 FtIRL的氨基酸序列提交应用蛋白质组分析工具
(http://www.expasy.org/tools/#proteome)，推测 FtIRL蛋
白总的原子数为 5008个，理论分子质量为 35.23kD，pI
值为 6.20；蛋白质中极性氨基酸含量为 33.55%，疏水
氨基酸含量为 36.10%。采用 SignalP 3.0 (http://www.cbs.
dtu.dk/services/SignalP/)对 FtIRL蛋白进行亚细胞定位预
测，没有发现分泌途径信号肽 ( S P )、叶绿体转运肽
(cTP)以及线粒体靶肽(mTP)，表明 FtIRL蛋白可能定位
于细胞质[ 10 ]。
2.3 FtIRL二级结构分析
采用 SOPMA(self-optimized prediction method from
alignment)程序进行 FtIRL蛋白二级结构预测。由图 4可
知，FtIRL蛋白二级结构较为复杂，其中α -螺旋占39.30%
(12个较大的α -螺旋，6个较小的α -螺旋)，β -折叠
为 17.25%(14个β -折叠)，β -转角为 9.27%(15个β -转
角)以及 34.19%的无规则卷曲。FtIRL蛋白的二级结构
与紫花苜蓿MsIFR和金叶连翘 FiPLR蛋白的高度相似，
三者在二级结构单元的含量和部位上差异较小，为其
形成活性中心和行使相应的生物学功能提供了良好的结
构基础。
方框表示引物序列；小写字母表示
5＇-UTR和 3＇-UTR；*. 表示终止密码。
图 3 FtIRL的 ORF序列及其对应的氨基酸序列
Fig.3 DNA sequence of ORF of FtIRL gene and deduced amino acid
sequence of FtIRL protein
2.4 FtIRL三维结构建模
图 4 FtIRL二级结构预测
Fig.4 Deduced secondary structure of FtIRL protein
FtIRL
MsIFR
FiPLR
10 20 30 40 50 60 70
50 100 150 200 250 300
进入 Swiss -Model三维结构预测服务器，将所得
PDB文件用 Spdbv37sp5软件进行浏览和编辑，见图 5。
FtIRL蛋白由两个结构域组成，与金叶连翘 FiPLR三维
结构高度相似：较大的结构域约N端约 200个氨基酸残
基构成，负责与 IRL蛋白的辅助因子NADPH结合；较
图 5 FtIRL蛋白的三级结构
Fig.5 Deduced 3-D structure of FtIRL protein
A271
活性中心
V266
N-端结构域
活性中心
C-端结构域
F164
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小的结构域由C端约 100个氨基酸残基构成，形成 IRL
蛋白的底物结合口袋。FtIFR蛋白具有 SDR家族的典型
特征，其 N 端和 C 端聚集在活性中心口袋周围，而其
活性中心口袋较紫花苜蓿MsIFR狭窄且与 FiPLR更为接
近。在氨基酸组成上，FtIFR的活性中心有较大的可变
性，由 F164、V266和 A271构成，而 FiPLR蛋白活性中心
由 F 164、V 268和 L 271构成，其中 F 164氨基酸残基在所有
的 IFR、IRL和 PLR中高度保守。这在一定程度上解释
了 IRL、PLR和 PCBER等 SDR家族成员虽然在氨基酸序
列上高度相似，但其生物学功能确各有差异的原因。
2.5 分子进化分析
RT-PCR技术获得了FtIRL，但却未能从甜荞中获得与 IRL
类似的序列。通过序列分析，FtIRL与高黄酮含量的金
荞愈伤组织中分离的 FcIFR在基因的长度和结构上同源
性较高，表明二者编码的蛋白可能具有相似的生物学功
能。蛋白质高级结构的分析结果和基于氨基酸序列的分
子进化结果均进一步表明，FtIRL在结构和进化上更加
接近 PLR。
苦荞和金荞中的黄酮类化合物的合成存在着不同的
分支途径，随着各分支途径的代谢的强弱不同，相关
基因的表达丰度存在一定差异。而苦荞中 FtIRL可能与
未直接参与异黄酮的合成过程，很可能作为 SDR家族中
的成员从而参与其他次生代谢产物的合成反应。近年
来，随着对苦荞抗逆生理研究的深入，发现苦荞中黄
酮类化合物含量的上升常常伴随着逆境的出现[14-16]，这
在一定程度上反映了苦荞中黄酮类化合物的含量与FtIRL
表达丰度之间的潜在关系。例如：水稻OsIRL在稻瘟病
病原菌(Magnaporthe grisea)和茉莉酸的诱导下，其表达
量上升[17]；研究者从西柚中鉴定出 IRL基因，该基因在
紫外照射和真菌浸染时被诱导表达[18]；咖啡叶中CoIRL
在真菌浸染和机械损伤的逆境下，表达量显著上升[ 7]。
植物黄酮的生物合成，是由不同的基因所编码的酶
控制并以代谢流的方式流向不同的支路，从而形成了种
类多样、结构复杂的植物黄酮及其衍生物。FtIRL作为
苦荞 SDR中的 IRL类基因，其生物学功能还不甚明晰，
与苦荞中黄酮类化合物生物合成的关系以及对逆境的应
答机制有待进一步研究。因此，对苦荞 FtIRL的研究有
助于进一步认识苯丙烷类代谢途径中不同基因的表达机
制以及相应代谢产物的生理作用，从而获得更多与苦荞
品质相关的功能基因，为高黄酮苦荞转基因育种提供实
验素材。
参 考 文 献 ：
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关序列。采用MEGA4.0软件[11]，通过邻接法构建基于
有花植物中 13个物种 IRL相关氨基酸序列的系统发育
树。由图 6可知，同为蓼科植物的 FtIRL与金荞 FcIFR
同源关系最近，且和木犀科的金叶连翘 PLR聚为一大类
(Cluster Ⅰ)；其他植物的 IFR和 IRL聚为一大类，其中双
子叶植物聚为Cluster ⅡA，单子叶植物聚为Cluster ⅡB。
多数植物的 IR L 在进化上较为保守，符合植物分类规
律。苦荞和金荞虽然在氨基酸序列上与其他植物的
IFR 相关基因有较高的同源性，但其生物学功能可能
更接近 PLR。
3 讨 论
在中国、日本和韩国等亚洲国家，苦荞作为一种
具有保健价值的粮食作物日益受到关注[12]。黄酮类化合
物的含量是衡量苦荞品质高低的标准之一。异黄酮类化
合物主要分布于豆科植物中(Leguminosae)[13]，但苦荞中
的黄酮类化合物是以芦丁为代表的黄酮醇类物质及其衍
生物，目前还未见从苦荞中分离出异黄酮的报道。本
研究以苦荞黄酮类化合物含量最高的花蕾为材料，采用
图 6 不同植物 IRL 氨基酸序列的系统发育进化树
Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of IRL protein
in different plants
梨 IFR
欧洲白桦 IRL
拟南芥 IRL
紫花苜蓿 IFR
咖啡 IRL
蓖麻 IFR
大麦 IFR
水稻 IRL
玉米 IRL
高粱 IRL
金叶连翘 PLR
金荞 IRL
苦荞 IRL
0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
Cluster ⅡA
Cluster ⅡB
Cluster Ⅰ
100
100
100
100
83
85
37
67
88
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