全 文 ：第 2 3 卷第 6 期
2 0 0 4 年 1 1 月
无 锡 轻 工 大 学 学 报
扫“ r n a lo f W u xU in iv ers it y o f L ig ht I n d “ s t r y V
o l
.
2 3
N o v.
N o 6
2 0 0 4
文章编号 : 10 0 9 一o 3 s X ( 2 0 0 4 ) 0 6 一0 0 4 3 一 0 4
活性氧对河岸葡萄叶圆片抗氧化酶活性的影响
张 峰 , 廖祥儒 , 唐 蕾
( 江南大学 生物工程学院 工 业生物技术教育部重点实验室 , 江 苏 无 锡 2 14 0 3 6 )
摘 要 : 研究 了 离体处理下活性氧对河岸葡萄叶 圆片杭氧化酶活性的影 响 . 结果表 明 , 外源 H Z 0 2
和 F e , + + H Z O : 处 理 4 h 可引起河岸葡萄叶圆片细胞膜透性 明显增加 , 引起 A P O D , G P O D 和 S O D
活性明显下 降 ,但低浓度活性氧可不 同程度引起叶圆片 C A T 活性增加 ; 细胞膜透性 与活性氧浓度
呈显著正相关 .
关键词 : 活性氧 ; 细胞膜透性 ;抗氧化酶 ; 葡萄
中图分类号 : Q 5 5 文献标识码 : A
E f fe c t o f R e a e t i v e O x y g e n S P e e i e s o n A c t i v i t y o f
A n t i o x i d a n t E n z ym e s i n L e a f D i s k s o f V i t i s v u l P i n e
Z H A N G F e n g
,
L I A O X i a n g
一 r u ,
( T h e K e y L a b o f I n d u s t r ia l B i o t e e h n o lo g y
,
M i
n i s t r y o f E d
u e a t io n
,
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n i v e r s i t y
,
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,
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A b s t r a e t : E f f e e t o f r e a e t i v e o x y g e n s P e e i e s o n t h e a e t iv i t y o f
a n t i o x id a n t
e n z y m e s i n l e a f d i s k s o f
V it i s v u l p i n e w a s i n v e s t i g a t e d
.
T h e d a t a
r e v e a l e d t h a t e e l l m e m b r a n
e
p e r m e a b i l i t y o f t h e l e a f
d i s k s w a s o b v i o u s l y e n h a n e e d b y i n v i t r o t r e a t m e n t w i t h h y d r o g e n p e r o x id e a n d h y d r o g e n
p e r o x id e p l u s F e Z
+
,
A e t iv i t y o f a s e o r b a t e p e r o x id a s e
,
g u a i a e o l p e r o x i d a s
e , a n d s u p e
r o x id e
d i s m u t a s e w a s s ig n i f i e a n t l y r e d u e e d b y t h e t r e a tm e n t o f r e a e t i v e o x y g e n s p e e i e s
,
b u t H
:
0
2 w i t h
l o w e o n e e n t r a t i o n s e o u ld e n h a n e e e a t a l a s e a e t iv i t y t o e e r t a i n d e g r e e
.
T h e e e l l m
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p e r m e a b i l i t y w a s r e l a t e d t o t h e e o n e e n t r a t i o n o f r e a e t iv e o x y g e n s p e e i e s a n d p o s i t i v e l y
s i g n i f ie a n t l y
.
K e y w o dr s
: r e a e t iv e o x y g e n s p e e i e s ; e e l l m e m b r a n e p e r m e a b l l i t y ; a n t i o x i d a n t e n
z y m e ; V i z i
,
活性氧是生物体许多正常代谢或生理过程的
副产物 ,在植物物质代谢和抗病过程中参与讯号传
导 ,因而也有重要 的调节 作用 l[, 2」 . 但在 逆境条件
下 ,由于活性氧的产生受到刺激和抗氧化能力的下
降 , 也引起植物体活性氧累积 、 导致氧化胁迫〔3一 6〕 .
生物体产生的活性 氧主要有 0 2 一 和 H。 O : , 它
们可引起脂质过氧化 、 导致生物膜透性增加 . 在微
量过度元素存在下 , O : 一 和 H ZO Z还易转化为轻自由
基 仁` , “〕 ,有很强的破坏蛋白质 、 脂类和核酸等大分子
结构的作用 . 关于外源活性氧的效应 , 隋建丽等报
道 H 。 O : 加 F e 3 + 可引起 D N A 断裂 t , J ; D e s im o n e 等
证明 活 性 氧 能 促 进 植 物 细 胞 R ub i s co 降解田 ;
收稿 日期 : 2 0 0 4一 0 7 一 0 2 ; 修回 日期 : 2 0 0 4一 0 9 一 1 9 .
基金项 目 :河北省科技厅 2 0 0 4一 2 0 0 6年指导性研究计划 资助课题 .
作者简介 : 张峰 ( 1 9 6 0一 ) , 男 , 浙江绍兴人 , 工程师 .
4 无 锡 轻 工 大 学 学 第 2 3 卷
M cA ins h 等发现活性 氧影 响植物 叶片保卫细胞行
为川 ; Che n 等则证 明 , 活性氧参与诱导植物的防护
反应 .0[ ’ 。〕 . 但在逆境条件下 ,植物抗氧化酶活性 的变
化是否 与活 性 氧 的作 用 有关 还 不 清楚 . 分别用
H ; 0
2 ,
eF
, + 十 H : 0 2和 0 2 一 处理了河岸葡萄叶圆片 ,
以探讨外源活性氧对植物抗氧化酶活性的影响 ,
1 材料与方 法
1
.
1 实验材料
材料为河岸葡萄 ( Vi it 、 。 ul iP an L . ) , 取材及培
养方法同前 l[ `〕 .
1
.
2 活性氧处理
活性氧处理 温度 为 25 ’ C , 处理 时 间为 4 .h
H
:
0
2处理浓度分别 为 : o , 1 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 , 6 4 m m o l /
L
.
F e Z+ + H
Z
0
2 处理组合浓 度分别 为 : 2 0 拌m o l / L
F e S O
; , 2 0 拌m o l / L F e S O 4 + 1 m m o l / L H : O : , 4 0
拼m o l / L F e SO 4 + 2 m m o l / L H Z O : , 6 0 拼m o l / L
F e S O
;
+ 3 m m o l / L H
Z
O
。 , 8 0 拜m o l / L F e SO 4 + 4
m m o l / L H
Z
0
2 , 1 0 0 拜m o l / L F e S O ; + 5 m m o l / L
H
2
0
2 , 1 2 0 拼m o l / L F e S O ; + 6 m m o l / L H : O : .
1
.
3 细胞膜透性
细胞膜透性的测定参照文献〔12」的方法 .
1
.
4 酶活定义及酶活测定
过氧化氢酶 ( C A T ) ( E C 1 . 1 1 . 1 . 6) 活性测定参
照 J a b l o n s k i 和 A n d e r s o n 的方法 [` ,〕 . 1个酶活单位
( U )定义为每分钟催化 0 . 1 纳摩 尔过氧化氢 (0 . 1
n m o l H
。
0
2
/ m i n )所需的酶量 .
抗坏血酸过氧化物酶 ( A P O D ) ( E C 1 . 1 1 . 1 . 1 1 )
和愈创木酚过氧化物酶 ( G P O D ) , ( E C 2 . 2 1 . 1 . 7 )活
性按 A m a k 。 等的方法测定 14[ 〕 . 1 个 A P O D 酶活单
位 ( U )定义为每分钟催化 25 纳摩尔过 氧化氢 ( 25
n m o l H
Z
O
Z
/ m i n )所需的酶量 , 1 个 G P O D 酶活单
位 ( U ) 定 义为每 分钟 催化 2 微摩 尔 过氧 化氢 (2
拼m o l H Z O : / m i n ) 所需的酶量 .
超氧化物岐化酶 ( S O D ) ( E C 1 . 1 5 . 1 , 1 ) 活性按
文献 [ 1 5〕的方法测定 ,用 5 m m o l / L K C N 抑制 C u ,
Z n S O D 测 M n S O D 活性 , 以 抑 制 N B T 光 还原
50 写的酶量为一个活性单位 .
蛋白质质量按 B ar d f or d 方法测定 〔` 〕 . 所有数据
均来 自 3 个 独 立 实 验 , 并 各有 4 个 重 复 . 采 用
s P s S S
.
o 进行数据分析 .
2 结果与分析
2
.
1 活性氧对细胞膜透性的影响
H
Z
0
2和 F e Z+ + H Z 0 2处理 4 h 均引起河岸葡
萄叶圆片细胞膜透性显著增加 (见表 1 ) , 细胞膜透
性与 H Z O Z浓度呈显著正相关 . 在 H 2 0 2处理中 , 细
胞膜透性与 H : O : 浓度的关 系为 : Y 一 9 . 0 十 0 . 29 X
(r ~ 。 。 9 4 9 ) ; 而在 F e Z十 十 H Z O : 处理中 , 细胞膜透性
与 H : O : 浓度 的关 系为 : Y 一 2 . 50 + 3 . 46 X (r -
0
.
9 71 )
. 从 回归 系数可 以看 出 , F e +2 十 H : O : 处理
(即经 自由基 )对细胞膜的损伤远大于 H Z O : 处理 .
表 1 活性叙处理对河岸葡萄叶细胞膜透性的影晌
T a b
.
1 E fe
e t o f h y d or ge n P
e r o x id e a n d h y d or ge n ep
r o x i d e
p一us F ez + o n e el 一m e确 r aen p e r m e曲一i ty o r v l t七 v u一
P加 e Ie a f d is 七
H
:
0
2 + F e S ( )
;
H Z ( ) 2
m m o l / I
碑
膜透
性 / % H Z O Z
( m m o l / L )
F e S O
;
(林m o l / L )
膜透
性 / %
09`
乃`
01
10 6
.
0 士 1 . 0
1 7
.
1士 0 . 9
4
.
3 士 1 . 0
6
.
5士 0 . 8
4 1 0
.
8土 1 . 4 2
8 1 4
.
7土 2 . 5 3
4 0
6 0
8
.
0士 1 . 0
9
.
4士 0 . 9
16 1 5
.
3士 1 . 9 4
3 2 1 9
.
3土 2 . 3 5
8 0 1 7
.
1士 2 . 0
6 4 2 6
.
5士 4 . 9 6
1 0 0 2 1
.
0土 1 . 8
1 2 0 23
.
9 士 3 . 4
2
.
Z H : O
: 处理对抗氧化酶活性的影响
在 64 m m ol / L 浓度 范围内 , H : O : 处理对河岸
葡萄叶圆片 C A T 活性具有一定 的刺激作用 (见 图
l )
,但明显降低其 A P O D , G PO D 和 S O D 活性 ( P <
。 . 0 5 ) . 其 中 G P O D 活性 随 H : O : 浓度的增加而下
降 , A P () D 的活性在 H : O : 浓度上升到 1 6 m m o l / L
时降到最低 并 维持 在较低水平 , 而 SO D 活性在
H
:
O
: 浓度升至 s m m ol / L 时降至最低并维持在较
低水平 . 叶圆片细胞 膜透性与其 A P O D , G P O D 和
S O D 活性呈显著负相关 ,其回归方程分别为 : M P -
2 7
.
2一 1 0 3 A P O D ( r = 一 0 . 9 0 7 , P < 0 . 0 1 ) , M P =
2 3
.
7一 0 . 0 9 2 G P O D ( r - 一 0 . 9 4 1 , P < 0 . 0 1 ) , 和 M P
= 6 8
,
5一 0 . 6 6 SO D ( r = 一 0 . 9 6 3 , P < 0 . 0 1 ) ;说 明
H
:
O
: 处理下叶圆片细胞膜透性的增加 , 可能也与
这 3 种酶活性的降低有关 .
C A T
` “廿卜十之塑 ,
0卜一一~ - -盆~ 一一止~ - - ~- - -日0 16 3 2 4 8 6 4
ǎ助` /口)只赃擂知如洲姐祝毕
H
2
0
:浓度 /(m m o ll L )
第 6期 张 峰等 : 活性氧对河岸葡萄叶圆片抗氧化酶活性的影响
宙 1 2 0 r月 O弓 史只 。 八 限 ,夔。 “ {~冬冬斗一州望 4 D 卜 丫 \ _侧 1 刃火姗 } ~ ~ 喇 ) 一 G P O D砍 l 一~ 一~ ~ ~ 丫淤 0 ` 一- -一一一~ ~ J ` 一一一~ 一
U 16 3 2 4 8 6 4
H
2
0
2浓度 /(m m o l /L )
图 1 过瓶化氮对河岸葡萄叶圆片抗峨化酶活性的影响
F lg
.
1 E fe
e t o f h y d r o g e n P e r o x i d e o n a c t iv i t y o f a n t i o x
-
i d an t
e此 y m se i n Ie a f d is k e o f V i t is v u l P i n a L .
2
.
3 eF
,十 + H Z仇 处理对抗氧化酶活性的影响
低浓 度 F e Z+ + H : q 处 理 ( 小 于 2 mm o l / L
H
Z
q )使河岸葡萄叶圆片 C A I、 活性增加 (尸 < 0 . 05 ) ,
对 A P O D 活性也无明显影响 ,但在较高浓度下 CAT
(尸< 0 . 0 5 )和 A P O D (尸< 0 . 01 ) 活性 明显下降 (见图
2)
.
SO D 活性随 F矛+ 十 H : q 处理浓度的增加而降
低 . 在 F扩+ + H Z q 处理下 , 叶圆片细胞膜透性与其
妙O D , G PO D 和 OS D 活性呈显著负相关 ,其回归方
程分别为 : M P二 25 . 1一 10 2A P (〕D (r ~ 一 0 . 9 15 , 尸<
0
.
0 1)
,
M P一 2 9 . 3 一 0 . 8 2 8G PO D ( r ~ 一 0 . 94 1 , P <
0
.
0 1 )
,和 M P = 72 . 0一 0 . 6 5 7 SO D ( r - 一 0 . 9 7 5 , P <
。 . 0 1 ) ;说明 eF Z + 十 H Z q 处理下叶圆片细胞膜透性的
增加 ,可能也与这 3 种酶活性的降低有关 .
2
.
4 活性氧处理对 S O D 同工酶活性的影响
较低浓度的 H Z O Z (4 m m ol / )L 处理 4 h 明显降
低葡 萄叶 C u , Z n S O D 活性 ( 尸 < 0 . 05 ) , 但随着
H
:
O
: 浓度的升高其活性又有回升 , M n S O D 活性随
处理中 H : O : 浓度的升高 而降低 ( 尸 < 。 . 05 , 见图
3 ) ; 在 H Z 0 2浓度小于 6 m m o l / L 的范围内 F e Z+ +
H
Z
O
: 处理对葡萄叶 C u , Z n S O D 无明显影响 , H Z 0 2
浓度小于 2 m m ol / L 时 M n S O D 活性也无明显变
化 ,但随着 H : O : 浓度的进一步增加 M n S O D 活性
迅速降低 (尸< 0 . 0 5 ) . 说明河岸葡萄叶 S O D 同工酶
的不同类型对不 同活性氧的敏感性是有差异的 ,不
同活性氧对同一类型 S O D 活性 的影响也有所不
同 .
C u
,
Z n S O D
4 0
2 0
M n S O D
峪一一一几犷一价布一一穿一-筋
ǎ助日/匀)只业仲如遨口困祝晰
H
Z
o
:浓度 / (m m o l /L )
ǎ切任、口í只缓鹅神如姐喇祝墩
12 0
8 0
C A T
O犷一一苏一二芯一飞犷一端
F e
, + + H
:
0
2处理中H 20 2浓度 /(m m o l /L )
A P OD
” 苏
1 2 0 厂
ǎ切已、口í长鹅瀚神如姐蝴帜带
F e
,+ 十 H Zo :处理中H之0 2浓度 /(m m o l / L )
图 3 活性氧对河岸葡萄叶圆片 SO D 同工酶活性的影
响
F i g
.
3 E f fe e t o f r e a e t iv e o x y ge l l o n a c t i v it y o f OS D
is o z yme
s i n l e a f d is 七 o f V i t is v u l P in a L .
S OD
3 讨 论
4 0 卜
。
l 即 o D 一 、
0 I
2 了
夕尸卜 J , _ d
ǎ助日、pí只仲鹅堪如扭瞩祝牢
图 2 F e抖 + ZH O : 处理对河岸葡萄叶国片抗氧化酶活
性的影响
R g Z E月, c才 of 凡 , + + 瑞 q 叻 a e t iv i t y o f an t i 0 X i d a n t
e取y m es i n le a f d is k e o f V it is v u l P in a L .
抗氧化酶活性增加 ,是植物适应逆境的方式之
一 ,然而严重的逆境胁迫多引起植物体抗氧化酶活
性降低 , 导致活性氧积累〔 ’ 一 6 ” 2 ” 5 ’ ` 7」. 本实验结果表
明 ,外源活性氧处理 4 h 可引起河岸 葡萄叶圆片
A P O D
,
G P O D 和 S O D 活性明显下降 , 但低浓度活
性氧可不同程度引起叶圆片 C A T 活性增加 . 因此 ,
在逆境条件下 ,植物体抗氧化酶活性的下降可能是
活性氧积累的结果之一 ,并进一步导致活性氧浓度
卷23第
增加 ,
轻自由基对蛋白质结构有很强 的破坏的作用 ,
直接 影 响 抗 氧 化 酶 活 性 ; 而 H : O : 则 抑 制 C u ,
Z n SO D
.
G o m e
z 等报道 活性氧能够刺激 蛋白质 的
酶促降解 〔`幻 . 因此 ,在逆境条件下 ,植物体抗氧化酶
活性的下降也可能与活性氧刺激的酶蛋 白的酶促
降解有关 . 不过我们的结果显示 , 16 m m ol / L H : 。 2
处理 C u , Z n SO D 明显高于 4 m m o l / L 的 , 可能此
时 H Z 0 2参与 了讯号传导 , 诱导 C u , Z n S O D 表达 ,
但还缺少直接证据 .
从抗氧化酶对活性氧的反应来看 , G P O D 对活
性氧最为敏感 , A P O D 对 H Z O : 和轻 自由基处理较
为敏感 . 而经 自由基对抗氧化酶活性的影响最 大 .
不同类型活性氧处理对 S O D 同工酶 的影响也有差
别 , H Z O : 和 F e Z + + H : 0 2处理都不同程度引起 C u ,
Z n SO D 和 M n SO D 活性下降 ; 但河岸葡萄叶 S O D
同工酶的不同类 型对 不同活性 氧的敏感性是有差
异的 ,不同活性氧对 同一类型 S O D 活性 的影响也
有所不同 . 其中 C u , Z n SO D 对 F e Z + + H : O : 处理
不太敏感 , 说明经 自由基浓度 与 H : O : 对 C u , Z n
SO D 的作用机制是有区别的 .
综上所述 ,活性氧处理可明显引起河岸葡萄叶
A P O D
,
G P O D 和 SO D 活性下 降 , 但在一定浓度范
围内也使 C A T 活性增加 . 因此 , 低浓度的活性氧或
一些类型的活性氧可能具有传递逆境信号的作用 ,
并因此调节植物 的逆境反应 . 然而 , 有关活性氧对
A P O D
,
G P O D
,
C A T 和 S O D 同工酶的影响以及活
性氧对抗氧化 酶活性 的具体作用机制都还待深入
研究 .
参考文献 :
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s p h
o s p h
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o x y g e n a s e in is o l
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〔x 3〕 J a b lo n s k i P P , A n d e r s o n Jw . L ig h t d e p e n d e n t : e d u e t io n o f d e h y d r o a s e o r b a t e by : u p t u r e d p e a C h lo r o p la s t s〔J〕. P一a n t P h ys -
10 卜 1 9 8 1 , 6 7 : 1 2 3 9一 1 2 4 4 .
仁1 4」A m a k o K , 。 h e n G X , A s a d a K . S e p a r a t e a s s a y s s p e e if iC f o : a s e o r b a t e p o r o x id a s e a n d g u a ia e o l p e r o 石 d a s e a n d fo : t h e e h lo -
r o p l
a s t i e a n d
e y t o s o li
e i s o z y m
e s o f a s e o r b a r e p e r o x id a s e in p la n t s 〔J〕. P一a n t e e 一1 P h邓 10 1, 1 9 9 4 , 3 5 : 4 9 7一 5 0 4 .
〔1 5〕 Z h a n g J , K i r kh a m M B . A n t io x id a n t : e s p o n s e s t o d ro u g h t i n s u n f lo w e : a n d s o r g h a m s e e d l in g s [ J〕. N e w p h y t o l , 1 9 9 6 ,
1 3 2
:
3 6 1一 3 7 3 .
〔1 6 ] B r a d f o r d M M . A r a p id m e t h o d f o : t h e q u a n t i t a t i o n o f m ie r o g r o m q u a n t i t ie s o f p r o t e i n u t ili z in g t h e p r in e i p l e o f p r o t e in 一d y e
b i n d in g〔J〕. A ua 一B io e h em , 19 7 6 , 7 2 : 2 4 8一 2 5 4 .
〔1 7〕 R a o M V , P a li y a t h G , O r m r o d D P . U l t r a v io le -t -B a n d o z o n o in d u e e d b io e h e m i e a l c h a n g e s i n a n t io x i d a n t e n ` y m e s o f A r a b i-
d
o p s i
s th a li a n a [J〕. P 一a n t p h邓 10 1 , 1 9 9 6 , 1一。 : 1 2 5一 1 3 6 .
〔1 8〕 G o nr e : L D , C a s a n o L M , T r ip p i V S . E f f e e t o f e e ll w a ll a s s o e ia t e d p r o t e in s i n g r o w in g b e a n h y p o e o t y ls 〔J」. P一a n t Q l-
P h ” 10 1 , 2 9 9 5 , 3 6 : 2 2 5 9一 1 2 6 4 . (责任编样 : 杨 萌 )