全 文 ：第 38 卷 第 3 期
2016 年 3 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOUＲNAL OF BEIJING FOＲESTＲY UNIVEＲSITY
Vol． 38，No． 3
Mar．，2016
DOI:10． 13332 / j． 1000--1522． 20150197
北美枫香雄花和花序轴诱导体细胞胚胎发生
王晓琪1 胥 明2 赵 健1 张 炎1 周 晨1 刘学增3 郭会芳3 张金凤1
(1 北京林业大学生物科学与技术学院，林木育种国家工程实验室，林木花卉遗传育种教育部重点实验室，国家林业局
树木花卉育种生物工程重点开放实验室 2 上海辰山植物园园艺部 3 河南鄢陵龙源花木公司)
收稿日期:2015--05--28 修回日期:2015--11--02
基金项目:北京市教育委员会科学研究与研究生培养共建项目(BLCXY201511 )、北京林业大学青年教师科学研究中长期项目(2015ZCQ-
SW-02)、“948”国家林业局引进项目(2014-4-59)。
第一作者:王晓琪。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:liqiu8826623@ 163． com 地址:100083 北京市海淀区清华东路 35 号北京
林业大学 118 信箱。
责任作者:张金凤，教授，博士生导师。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:zjf@ bjfu． edu． cn 地址:同上。
本刊网址:http:j． bjfu． edu． cn;http:journal． bjfu． edu． cn
摘要:北美枫香是适应性强、生长速度快、秋叶红艳美丽的园林绿化树种。为了提高其繁殖效率，以北美枫香雄花
和花序轴为外植体，采用完全随机区组设计，研究外植体类型，基因型，TDZ浓度对北美枫香愈伤组织的诱导、体胚
分化和萌发的影响。结果表明:雄花作为外植体，合适的诱导培养基为改良 Blaydes 培养基 + TDZ 0. 15 mg /L +水
解酪蛋白 1 g /L +蔗糖 40 g /L + 3% 植物凝胶;花序轴作为外植体，合适的诱导培养基为改良 Blaydes培养基 + TDZ
0. 01 mg /L +水解酪蛋白 1 g /L +蔗糖 40 g /L + 3% 植物凝胶。合适的萌发培养基为不含水解酪蛋白的基本培养
基。如果出现球形胚，将培养物转接到不含任何生长调节剂的改良 Blaydes培养基上，体胚经成熟可进一步形成完
整小植株。该体胚体系的建成将显著提高北美枫香的繁殖效率。
关键词:北美枫香;体细胞胚胎发生;体细胞胚
中图分类号:S718. 43 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2016)03--0032--06
WANG Xiao-qi1;XU Ming2;ZHAO Jian1;ZHANG Yan1;ZHOU Chen1;LIU Xue-zeng3;GUO Hui-
fang3;ZHANG Jin-feng1 ． Somatic embryogenesis of Liquidambar styraciflua induced from staminate
flower and inflorescence axis． Journal of Beijing Forestry University (2016)38(3)32--37［Ch，19 ref．］
1 National Engineering Laboratory for Tree Breeding;Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest
Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education;Key Laboratory of Forest Trees and Ornamental
Plants Biological Engineering of State Forestry Administration;College of Biological Sciences and
Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing，100083，P． Ｒ． China;
2 Department of Horticulture of Shanghai Chenshan Botanical Garden，Shanghai，201602，P． Ｒ． China;
3 Longyuan Flowers and Trees Company of Henan Yanling，Yanling，Henan，461200，P． Ｒ． China．
Sweetgum (Liquidambar styraciflua) is a garden landscaping tree with strong adaptability，fast
growth，and red color of autumn leaves． In order to improve efficiency of its propagation，we used
staminate flower and the inflorescence axis as explants to investigate effects of explant types，genotypes
and TDZ concentration in culture media on callus and somatic embryo induction with random complete
block design． The results showed that the optimal medium for induction of embryogenic callus was
modified Blaydes medium + TDZ 0. 15 mg /L + casein hydrolysate 1 g /L + surcrose 40 g /L + 3% Phytagar
(sigma)with staminate flower as explant． The optimal medium for induction of embryogenic callus was
modified Blaydes medium + TDZ 0. 01 mg /L + casein hydrolysate 1 g /L + surcrose 40 g /L + 3% Phytagar
(sigma)with inflorescence axis as explant． The suitable medium of germination was modified Blaydes
medium without casein hydrolysate． Once globular-stage embryo formed，we transferred it to the same
medium without plant growth regulators，and somatic embryos would mature and germinate to developed
plantlets． The establishment of this somatic embryogenesis system will significantly improve propagation
第 3 期 王晓琪等:北美枫香雄花和花序轴诱导体细胞胚胎发生
efficiency of Liquidambar styraciflua．
Key words Liquidambar styraciflua;somatic embryogenesis;somatic embryo
北美枫香(Liquidambar styraciflua)是金缕梅科
(Hamamelidaceae)枫香树属高大硬木树［1］，原产于
北美地区，大多分布于墨西哥以及北美南部、中美洲
的高海拔山区［2］。由于适应性强、生长速度快、秋
叶红艳美丽、材质坚硬等特点，北美枫香具有重要的
经济价值，观赏价值，药用价值以及工业价值。
北美枫香一般采用种子繁殖，但由于其生长周
期长，大小年明显，种子后代遗传变异大，扦插繁殖
效率低于组培等特点，有必要开展无性繁殖技术研
究。体胚是目前最有应用前景的快速繁殖手段。体
细胞胚胎发生是指组织培养能产生类似胚的结构的
细胞、组织、器官，经历与合子胚胎发生和发育相似
的过程［3］。体细胞胚具有数量多、诱导成苗率高、
生产速度快、结构完整、遗传特性比较稳定、再生植
株变异小、其发生和发育途径更接近自然状态等特
点［4］，同时它是制作人工种子的基础［5］，如果形成
的体细胞胚结构完整，可直接形成再生植株［6］，植
物体细胞胚胎发生是高效的再生体系［7］。
苏梦云［8］利用北美枫香诱导愈伤组织，但国内
还没有通过体胚途径进行北美枫香繁殖技术研究。
国外对北美枫香的育种研究始于 20 世纪 70 年代，
但仍不能满足林业生产需要。国外利用北美枫香花
序和未成熟种子作为外植体进行诱导，成功获得了
体胚。其最初在 0. 01 mg /L TDZ(N-苯基-N-1，2，3-
噻二唑-5-脲)培养的花序轴上观察到球形胚结构，
并且发现在添加了 0. 10 mg /L TDZ 的培养基上，雄
花序的愈伤组织诱导率最高［9］。但是其只测试了
TDZ的 2 个浓度水平(0. 01 和 0. 1 mg /L)，并且未将
雄花和花序轴分别统计，也没有明确体胚的来源。
如果诱导的体胚来源于花粉，则其遗传背景与体
细胞不同［10］;因此，有必要将雄花和花序轴分别培
养和统计，并设置更多 TDZ 浓度水平，优化其结
果。本文首次将雄花和花序轴分开培养，以确定
体胚再生植株来源，优化北美枫香体细胞胚胎发
生体系。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
2014 年 1 月以上海辰山植物园由播种苗培育
的北美枫香为取材资源，选取 3 株生长良好的北美
枫香作为 3 个不同基因型，分别标记采集花枝。将
当天采集的花枝用塑料密封袋密封放入冰盒中带回
北京林业大学温室，水培待花芽将要张开，分别取雄
花和花序轴作为外植体(图 1a)。
1. 2 外植体的制备
将采集的雄花和花序轴用水洗净，在超净工作
台上用 20% Ｒoccal(十二烷基二甲基苄基氯化铵)
浸泡 1 min，70% 乙醇浸泡 1 min，20% Ｒoccal 浸泡 1
min，70% 乙醇浸泡 1 min，20% Ｒoccal 浸泡 1 min，
1%次氯酸钠 15 min，0. 01 mol /L HCl浸泡 3 min，无
菌水冲洗 5 ～ 6 次。在无菌条件下，将雄花和花序轴
接种到愈伤组织的诱导培养基上。培养皿为 90 mm ×
15 mm。
1. 3 愈伤组织的诱导培养
采用改良的 Blaydes 培养基［9］为基本培养基，
诱导培养基为基本培养基 +水解酪蛋白 1 g /L +蔗
糖 40 g /L + 3% 植物凝胶 + TDZ。雄花为外植体，
TDZ浓度为 0. 05、0. 10、0. 15 mg /L;花序轴为外植
体，TDZ质量浓度为 0. 01、0. 02、0. 03 mg /L。灭菌
前 pH 调至 5. 6 ～ 5. 7，高温灭菌 121 ℃ 25 min。每
个培养皿接种 10 个外植体，3 次重复，每 3 ～ 4 周继
代 1 次。置于(25 ± 2)℃ 条件下，暗培养。培养 8
周后拍照记录不同类型的愈伤组织并统计愈伤组织
的诱导率。
1. 4 体胚的成熟
成熟试验测试由雄花和花序轴作为外植体诱导
的愈伤组织进行成熟培养，每个培养皿接种 10 个愈
伤组织培养物，3 次重复。将愈伤组织转接到不含
有任何外源激素的基本培养基 +水解酪蛋白 1 mg /
L +蔗糖 40 g /L + 3% 植物凝胶，pH5. 6 ～ 5. 7，置于
(25 ± 2)℃ 条件下，暗培养，每 3 周继代 1 次。培养
4 周后观察并拍照。
1. 5 体细胞胚的萌发与植株再生
将成熟的子叶胚从愈伤组织上分离，转接至基
本培养基 +蔗糖 30 g /L + 3% 植物凝胶，pH 5. 6 ～
5. 7，置于(25 ± 2)℃条件下，在光周期为 16 h光照 /
8 h 黑暗条件下培养，每 3 周继代 1 次。培养 6 周后
统计体细胞胚萌发的数量并拍照记录。
1. 6 培养物观察
定期对培养材料进行观察，并用佳能 7D3 型照
相机拍照。愈伤组织以及体胚在 Olympus 光学显微
镜下观察并拍照。用植物凝胶糖包埋固定诱导得到
的体细胞胚，采用徕卡 UC6 型全自动震动超薄切片
机切片，将体细胞胚用苏木精染色液染色，在
Olympus 显微镜下观察并拍照。
33
北 京 林 业 大 学 学 报 第 38 卷
1. 7 数据分析
愈伤组织为胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的
总和;
愈伤组织诱导率 =诱导愈伤组织的外植体个
数 /接种外植体的总数 × 100%;
体细胞胚萌发率 =萌发的体胚个数 /接种体胚
的总数 × 100%;
所有数据用 SPSS 17. 0 软件处理分析。
2 结果与分析
2. 1 愈伤组织的诱导
雄花和花序轴接种到诱导培养基中(图 1b)，1
周后开始启动，具体表现为部分愈伤组织出现，5 周
后出现大量愈伤组织，雄花和花序轴均产生愈伤组
织(图 1c)，愈伤组织大多表现为致密形态特征。6
周后愈伤组织进行增殖培养(图 1d)。
2. 1. 1 外植体种类对愈伤组织诱导的影响
外植体为雄花和花序轴，表 1 说明:雄花作为外
植体的愈伤组织诱导率为 72. 22%，而花序轴作为
外植体的愈伤组织诱导率为 19. 26%。雄花作为外
植体进行体细胞胚胎发生的诱导最佳。
表 1 外植体种类对愈伤组织诱导的影响
Tab． 1 Effect of explant types on the induction of callus
外植体类型
Explant types
外植体数
Number of
explants
诱导率
Induction
frequency /%
雄花 Staminate flower 270 72. 22 ± 0. 25
花序轴 Inflorescence axis 270 19. 26 ± 0. 11
注:表中数据均在接种后 6 周统计。表 2、3 同此。Note:data were
collected after 6 weeks of culture． The same for Tab． 2 and 3．
2. 1. 2 基因型对愈伤组织诱导的影响
由表 2 可知，当雄花作为外植体，1 号基因型的
诱导 率 为 75. 53%，2 号 基 因 型 的 诱 导 率 为
67. 77%，3 号基因型的诱导率为 73. 33%。由表 3
可知，当花序轴作为外植体，1 号基因型的诱导率
为 21. 11%，2 号基因型的诱导率为 14. 44%，3 号基
因型的诱导率为 22. 22%。经方差分析，不同基因
型对愈伤组织诱导的影响差异不显著。
表 2 雄花作为外植体时基因型对愈伤组织诱导的影响
Tab． 2 Effect of genotypes on the induction of callus
derived from staminate flower
基因型
Genotypes
外植体数
Number of explants
诱导率
Induction frequency /%
1 号 No． 1 90 75. 53 ± 0. 36a
2 号 No． 2 90 67. 77 ± 0. 31a
3 号 No． 3 90 73. 33 ± 0. 12a
表 3 花序轴作为外植体时基因型对愈伤组织诱导的影响
Tab． 3 Effect of genotypes on the induction of callus
derived from axis of inflorescence axis
基因型
Genotypes
外植体数
Number of explants
诱导率
Induction frequency /%
1 号 No． 1 90 21. 11 ± 0. 19a
2 号 No． 2 90 14. 44 ± 0. 05a
3 号 No． 3 90 22. 22 ± 0. 08a
2. 1. 3 TDZ质量浓度对愈伤组织诱导的影响
通过表 4 可知，当雄花作为外植体，当 TDZ 浓
度 0. 05 mg /L，其诱导率是 43. 33%;当 TDZ 浓度为
0. 10 mg /L，其诱导率是 80. 00%;当浓度为 0. 15
mg /L TDZ，其诱导率是 93. 33%。不同质量浓度的
TDZ对愈伤组织诱导的影响差异显著，质量浓度越
大，愈伤组织的诱导情况越明显。说明加大激素浓
度的选择范围，以筛选得到较高愈伤组织诱导能力
的激素浓度，进而加快体胚繁育进程。
表 4 雄花为外植体时 TDZ质量浓度对愈伤组织
诱导的影响
Tab． 4 Effect of TDZ on the induction of callus derived
from staminate flower
TDZ质量浓度
Concentration of TDZ /
(mg·L －1)
外植体数
Number of explants
诱导率
Induction
frequency /%
0. 05 90 43. 33 ± 0. 17b
0. 10 90 80. 00 ± 0. 12a
0. 15 90 93. 33 ± 0. 07a
注:表 4、5 中数据均在接种后 6 周统计。通过 Duncans 多重比较，字
母不同代表差异显著(P ＜ 0. 05)。Notes:data were collected after 6
weeks of culture． Means of different letters are significantly different by
Duncans Multiple Ｒange Test at P ＜ 0. 05．
通过表 5 可知，花序轴作为外植体，TDZ 浓度
0. 01 mg /L，其诱导率是 31. 11%;当 TDZ 浓度 0. 02
mg /L，其诱导率是 11. 11%;当 TDZ 浓度 0. 03 mg /
L，其诱导率是 15. 55%。不同质量浓度的 TDZ对愈
伤组织诱导的影响差异显著，对于花序轴作为外植
表 5 花序轴作为外植体时 TDZ质量浓度对愈伤
组织诱导的影响
Tab． 5 Effect of TDZ on the induction of callus derived
from axis of inflorescence
TDZ质量浓度
Concentration of TDZ /
(mg·L －1)
外植体数
Number of
explants
诱导率
Induction
frequency /%
0. 01 90 31. 11 ± 0. 12a
0. 02 90 11. 11 ± 0. 02b
0. 03 90 15. 55 ± 0. 07ab
43
第 3 期 王晓琪等:北美枫香雄花和花序轴诱导体细胞胚胎发生
a．花序植物学结构;b．接种的雄花和花序轴;c．雄花和花序轴产生的愈伤组织;d．增殖的愈伤组织，bar = 500 μm;e．球形胚，bar = 500 μm;
f． 球形胚(石蜡切片);g． 子叶胚，bar = 1 000 μm;h．成熟的子叶胚，bar = 1 000 μm;i． 放在萌发培养基的子叶胚;j． 体细胞胚生根，bar =
500 μm;k． 成熟体胚光下培养;l． 再生植株。a． Inflorescence botanical structure;b． Staminate flower and the inflorescence axis in intiation;c．
Callus induced from staminate flower and inflorescence axis;d． Callus in proliferation，bar = 500 μm;e． Globular somatic embryo，bar = 500 μm;
f． Globular somatic embryo (paraffin section);g． Cotyledonary somatic embryos，bar = 1 000 μm;h． Cotyledonary somatic embryos after 4 months，
bar = 1 000 μm;i． Cotyledonary somatic embryos on germination medium;j． Ｒoot differentiation of somatic embryos，bar = 500 μm;k． Mature
somatic embryos on light;l． Plantlet regenerated．
图 1 北美枫香体细胞胚胎发生过程
Fig． 1 Somatic embryogenesis of Liquidambar styraciflua
体，应选择小于 0. 01 mg /L 的 TDZ 对愈伤组织进行
诱导。
2. 2 愈伤组织的保持
愈伤组织在诱导培养基中诱导 5 周后，将愈伤
组织转到增殖培养基上，增殖培养基为 TDZ为 0. 01
mg /L的培养基上，4 周继代。愈伤组织具体表现为
透明，致密，且具有分化出发育正常的体细胞胚的能
力(图 1d，1e)。
2. 3 体细胞胚的成熟
将早期形成的胚胎进行石蜡切片，由明显的胚
根和球形胚(图 1f)。培养在成熟培养基 2 周后有
透明子叶胚出现(图 1g)。4 周后有大量乳白色子
叶胚出现(图 1h)。能产生体胚的愈伤组织为胚性
愈伤组织，统计其团数。当雄花作为外植体，胚性愈
伤组织团数为 19 个，产生体胚为 49 个，胚性愈伤产
生体胚为 11. 37;当花序轴作为外植体，胚性愈伤组
织团数为 9 个，产生体胚为 37 个，胚性愈伤产生体
胚为 15. 20 个 / g(表 6)。2 种不同外植体的体胚成
熟阶段体胚发生无显著差异。
53
北 京 林 业 大 学 学 报 第 38 卷
表 6 外植体种类对体胚成熟的影响
Tab． 6 Effect of explant types on the maturation of somatic embryos
外植体类型
Type of explant
愈伤组织数量
No． of callus
胚性愈伤组织团数
No． of embryogenic
callus
产生体胚的个数
No． of embryos
胚性愈伤产生体胚数
No． of somatic embryos per gram
of embryogenic callus /(calli·g － 1)
雄花 Staminate flower 90 19 49 11. 37 ± 2. 43a
花序轴 Inflorescence axis 90 9 37 15. 20 ± 8. 12a
2. 4 体细胞胚的萌发
将(图 1g)子叶胚分开培养，转接到不含有水解
酪蛋白的基本培养基上，由暗培养转到光下培养，光
周期为 16 h光照 /8 h黑暗。2 周后成熟体胚有根形
成(图 1i)。3 周后子叶变为绿色，胚轴伸长，胚根生
长点明显(图 1j)。将子叶胚放在光下培养(图
1k)，待子叶伸展(图 1l)，可移栽至室外生长。
由表 7 可知:雄花作为外植体的的萌发率为
57. 67%，花 序 轴 作 为 外 植 体 的 体 胚 萌 发 率
54. 67%。雄花作为外植体和花序轴作为外植体对
体胚萌发的影响差异不显著。
表 7 体胚萌发率
Tab． 7 Somatic embryo germination rate
外植体类型
Explant types
接入体胚数
Number of
embryos
萌发率
Germination
frequency /%
雄花 Staminate flower 30 57. 67 ± 0. 12a
花序轴 Inflorescence axis 30 54. 67 ± 0. 11a
2. 5 体胚体系的繁殖潜力
以花序轴诱导的胚性愈伤组织进行增殖培养，1
g胚性愈伤组织产生 15. 20 个体胚。1 g 胚性愈伤
组织 4 周增殖为原来的 2 倍，进行悬浮培养 6 个月;
胚性愈伤组织在成熟培养基 4 个月有 15. 20 个 / g
体胚出现，2 个月后萌发成幼苗，萌发率为 54. 67%。
1 g 胚性愈伤组织繁殖潜力:1 × 26 × 15. 20 ×
54. 67% =531. 8 株 /(g·a)。
3 结论与讨论
本文采用完全随机区组试验设计，系统研究雄
花和花序轴为外植体，3 种基因型和 TDZ 激素浓度
对体细胞胚分化的影响，对多个关键因素进行探讨，
确定北美枫香体胚诱导最佳条件，从而建立北美枫
香体胚发生和植株再生体系。
针叶树愈伤组织的诱导与外植体种类关系紧
密［11］。其实，同一树种的不同种类外植体对组织培
养条件都存在差异［12
--13］。在针叶树种中，利用胚
根、胚轴、未成熟胚和成熟胚等不同外植体进行体胚
诱导时，以未成熟的合子胚为材料可以有效提高愈
伤组织的诱导率［14］。外植体为未成熟的合子胚进
行体胚诱导的效果比花序效果显著［9］。本文研究
结果显示:雄花比花序轴的体胚发生效果显著，可能
由于未完全成熟的雄花的细胞处于分化的早期细
胞，早期的细胞其全能性高;因此，早期细胞越易经
过脱分化成为胚性细胞［15］。本文外植体分为雄花
和花序轴，将雄花和花序轴进行分开统计和明确体
胚的来源。未成熟雄花诱导出的胚性细胞有可能是
从花粉壁细胞诱导出的体胚，或者是由花粉产生的
花粉植株。雄花产生的体胚与优树的遗传物质不一
致［10］。但花序轴是营养器官，诱导出的胚性细胞只
可能是体细胞胚胎发生;并且花序轴诱导的体胚的
遗传物质和优树一致，确保遗传稳定性。由雄花诱
导得来的体胚可进行细胞倍性水平或分子遗传分
析，进一步确定其遗传来源。
外源植物激素是影响愈伤组织在组织培养过程
中最重要的因素之一［16］。TDZ 对于用花序作为外
植体进行体胚诱导是最适合的，而 2，4-D 对于花序
作为外植体进行体胚发生是无效的［9］。本试验设
定了 6 种 TDZ 质量浓度对体胚进行研究，结果显
示:以雄花为外植体，0. 15 mg /L TDZ 对愈伤组织诱
导效果最好;TDZ浓度越高，越可能促进体细胞胚胎
的诱导。以花序轴为外植体，0. 01 mg /L TDZ 对愈
伤组织诱导效果最好。从诱导阶段结果看，不同浓
度 TDZ对愈伤组织诱导的效果差异显著。
基因型不是北美枫香体胚诱导的重要因素。此
前，国外对北美枫香体胚诱导所选的 3 个基因型也
都能诱导出体胚［9］，各基因型的体胚诱导率有差异
但差异不显著。本文结果显示:3 基因型间差异不
显著，其中是否有表观遗传调控，原因值得进一步探
讨。3 棵树都能产生细胞系，并且 3 种基因型诱导
的愈伤组织无显著差异，说明基因型不是北美枫香
体胚诱导的重要因子。而在针叶树种中，基因型是
体胚诱导的重要因素［17
--18］。例如，基因型对云杉
(Picea abies)组织诱导率有极显著影响［14］，Lelu 等
人［19］以海岸松(Pinus pinaster)未成熟合子胚作为
外植体，发现杂交亲本双方及特定的 8 个基因型影
响胚性愈伤组织的诱导率。
体细胞胚胎发生是一种极其复杂的发育过程，
63
第 3 期 王晓琪等:北美枫香雄花和花序轴诱导体细胞胚胎发生
从外植体的筛选，胚性愈伤组织的诱导，胚性愈伤组
织的增殖到体胚的成熟萌发，过程涉及多种因
素［14］。本试验探讨了北美枫香外植体种类和外源
激素对体胚诱导的影响，成功诱导出体细胞胚和再
生植株，利用北美枫香雄花和花序轴建立了体细胞
胚再生体系，建立了良好的研究试验体系，提供了开
展北美枫香的遗传改良研究的科学依据。为了提高
愈伤组织诱导率和胚性能力强的细胞系的数量，今
后应优化体胚各个阶段发育过程，建立同步化的北
美枫香体细胞胚胎发生体系，为我国开展育苗技术
提供一条新途径。
参 考 文 献
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(责任编辑 赵 勃
责任编委 苏晓华)
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