全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (9): 1341–1346　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0274 1341
收稿 2016-07-07　　修定 2016-09-01
资助 海南省科技厅重点研发计划(ZDYF2016054)和中国热带
农业科学院海口实验站科研专项经费(HKZKY140101)。
* 通讯作者(E-mail: wenca107@hotmail.com)。
山竹高效再生体系的建立
李敬阳1,2, 李艳霞2, 林妃2, 许奕2, 黄东梅2, 唐粉玲2, 李羽佳2, 金志强2,*
1华中农业大学植物科学技术学院, 武汉430070; 2中国热带农业科学院海口实验站, 海口570102
摘要: 本研究以山竹不定胚诱导的无菌苗叶片为外植体, 通过优化山竹叶片诱导再生的培养条件, 建立了山竹再生培养技
术体系方法。结果显示, 叶片转入WPM+1.0 mg∙L-1 GA3+1.0 mg∙L-1 6-BA+0.5 mg∙L-1 TDZ培养基中, 诱导结节性愈伤组织的
比例为62.4%。转入添加0.7 mg∙L -1 TDZ+0.5 mg∙L -1 6-BA的WPM胚性愈伤组织诱导培养基中, 诱导出36%的球状胚性愈伤
组织。8周后球状胚性愈伤组织转入不定芽诱导培养, 在含有WPM+2.0 mg∙L-1 6-BA+0.5 mg∙L-1 NAA的培养基中, 增殖系数
达12.54。当不定芽长到20 mm左右时, 转接到生根培养基中进行生根诱导, 诱导生根的最适培养基为1/2MS+0.5 mg∙L-1
6-BA+0.5 mg∙L-1 NAA+0.1 mg∙L-1 IBA, 生根率为85.2%。
关键词: 山竹; 结节愈伤组织; 胚性愈伤组织; 不定胚
山竹由于其美味享有热带水果“果中皇后”的
美名。研究表明, 山竹的果皮和果肉中含有氧杂蒽
酮和其他生物活性物质, 使其具有抗氧化、抗癌、
去疤痕等作用(Yu等2007; Akao等2008; Pothitirat等
2010), 还可提取具有抗细菌、抗真菌、抗蛔虫和
杀虫等作用的活性成分(Jung等2006; Ngawhirunpat
等2010)。山竹壳中含有特有的倒捻子素和鞣酸等
成分, 尤其鞣酸是被认为具有抗人类白血病发生
功能(Yang等2000; Okonogi等2007)。由此可见, 山
竹具有较高的经济价值和医用价值。
通常山竹的繁殖方法是通过种子播种而来,
但种子的数量常常有限, 且山竹种子自然存放很
容易失去活力, 还存在种子繁育系数低, 种子数量
少(1个果实最多产生2个种子或很多果实没有种
子)等缺点(Almeyda和Martin 1976), 这些因素严重
局限了山竹种苗快速和大量繁殖。山竹繁殖过程
中, 也有通过嫁接方法将良种接穗接到实生苗上
进行改良, 观察到通过嫁接可以使山竹提前结果
现象(Chong 1992), 然而由于接穗和砧木之间亲和
能力较差, 遇到大风, 容易引起嫁接部位出现断
裂、折断等问题, 因此嫁接的方法在繁育山竹种
苗上也存在很大的局限性。此外, 还有报道选用1
年生种子苗的带芽点枝条浸泡生根剂, 在温室沙
床中扦插繁殖山竹种苗。虽然扦插枝条很容易生
根, 但小的种苗有芽点数目较少繁育系数极低, 也
很难实现山竹种苗的大规模繁育(Chong 1992)。
栽培品种的山竹仅开雌花, 少有雄花, 其种子
是通过无融合生殖而形成的(Richard 1990)。由于
山竹是孤雌生殖, 没有分化成胚形式, 而形成不定
胚, 缺乏品种变异。也正是由于其存在的单性特
殊生殖方式和种子结构, 山竹的不定胚保存了母
本的性状, 并且可以稳定遗传, 不会产生品种变异
的现象。因此, 山竹不定胚的快繁技术研究对于
规模化培育山竹种苗具有重要意义。有学者利用
山竹种子(Goh等1988)和嫩叶(Te-Chato和Lim
2000)进行过组织培养研究, 而这些方法还存在技
术不成熟、诱导周期长、增殖率低的问题。本试
验以山竹不定胚诱导无菌苗的叶片为外植体, 旨
在建立一个高效的山竹再生体系, 为规模化开发
山竹产业奠定基础。
材料与方法
1 材料
试验材料(Garcinia mangostana L.)采自海南省
五指山毛道山竹基地, 待山竹果成熟后, 采收表皮无
流胶的健康果实, 清冼干净待用, 2 d内处理完毕。
2 方法
2.1 无菌体系建立
山竹果剥掉外壳, 除去假种皮, 获得种子, 用
75%酒精表面处理30 s, 无菌水冲洗3次, 然后用5%
次氯酸钠溶液处理20 min, 在超净工作台上无菌水
振荡冲洗5次, 无菌滤纸吸干表面水分。种子切成
大小1 cm×1 cm的小块, 接种在含有1.0 mg·L-1 6-BA
的MS诱导培养基中, 暗培养1周后转入光下培养
(16 h光照/8 h黑暗, 光照强度为15 μmol·m-2·s-1), 培
植物生理学报1342
养室温度控制在(26±2)°C。25 d后外植体出现分化,
继续诱导, 获得无菌苗, 用无菌苗叶片进行试验。
2.2 不定芽的诱导和继代增殖培养
取50 d左右苗龄的无菌苗叶片, 分别切割成长
宽约为0.3 cm, 接种在含6-BA、GA、2,4-D和TDZ
的诱导愈伤WPM培养基中, 黑暗条件下培养。
将诱导获得的理想胚性愈伤转入诱导不定芽
的WPM改良培养基, 获得丛生不定芽后切割转接
到含有不同浓度6-BA和NAA的继代增殖培养基中,
设置不同培养基编号为A1~21, 琼脂粉7.5 mg·L-1,
蔗糖25 g·L-1, pH值调至5.8。光下培养50 d后统计
不定芽数量。
2.3 不定芽生根及炼苗移栽
切取生长健壮、长10~20 mm的单个不定芽接
种在含不同浓度6-BA、NAA、IBA的1/2MS培养
基中, 培养基编号为B1~10, 光照条件下(14 h光照
/10 h黑暗, 光照强度为30 μmol·m-2·s-1)培养30 d后
统计生根率。每个处理接种20瓶, 每瓶接种1个不
定芽, 重复3次。
2.4 数据分析
愈伤组织诱导率=(诱导愈伤类型的外植体数/
接种外植体总数)×100%; 生根率=(生根的不定芽
数/接种不定芽总数)×100%。数据采用SPSS 19.0
软件进行方差分析和多重比较分析(Duncan’s法)。
实验结果
1 山竹愈伤组织的诱导和分化
研究发现, 培养基中生长调节剂类别及浓度
等因素对山竹愈伤组织的形成和分化具有显著影
响。本试验通过山竹无菌苗叶片诱导出不同类型
的愈伤组织, 主要有疏松海绵状愈伤组织、结节
性愈伤组织以及胚性球状愈伤组织, 这三种不同
类别的愈伤组织直接影响其进一步分化, 且在不
同培养基中均有发生。在以木本培养基(WPM)添
加6-BA和GA的组合培养基中培养25 d后, 主要观
察到形成白色疏松海绵状愈伤组织(图1-A), 诱导
率最高为18.7%, 但此类愈伤很难进一步分化, 几
乎不能诱导成芽。在WPM培养基中添加6-BA和
2,4-D时, 主要观察到结节状愈伤组织的发生(图
1-B), 6-BA为2.0 mg·L-1和2,4-D为0.5 mg·L-1的浓度
组合诱导的结节性愈伤组织诱导率最高(62.4%)。
而在WPM培养基中添加6-BA和TDZ时, 主要为表
面光亮的球状愈伤组织的发生, 这些球状结构具
有早期诱导体细胞胚形成发生阶段的属性特征(图
1-C); 在含有0.5 mg·L-1 6-BA和0.7 mg·L-1 TDZ的培
养基中, 球状愈伤组织诱导率最高(36.0%) (表1)。
同时发现, 结节性愈伤组织在相同的培养条
件下继续培养, 难以进一步分化, 或者维持原状,
或者褐化死亡。但当结节性愈伤组织培养4周左
右后, 转接到添加6-BA和TDZ组合的培养基中, 能
诱导 球状胚性愈伤组织。
将球状胚性愈伤组织转接到含TDZ和6-BA组
合的不定芽诱导培养基中, 在光照条件下培养。
经过10 d左右时间培养, 可见光亮的球状愈伤组织
逐渐膨大, 颜色变为深绿色; 再经过25 d左右培养,
就有绿色的芽点长出(图1-D), 经15 d左右时间逐渐
发育成1 cm高左右的丛生芽。丛生芽切割成含有
1~2株单芽的组织块转接到新培养基中(图1-F), 继
续培养20 d后不定芽的高度可达3 cm左右。
2 山竹不定芽的增殖培养
将生长健壮的不定芽切割后转接到继代增殖
培养基中, 结果(表2)表明, 6-BA和NAA的浓度对
山竹增殖系数影响较明显。数据显示, 山竹的增
殖系数在0.19~12.54之间, 从不同培养基组合诱导
的增殖效果来看, 6-BA比NAA的山竹增殖系数的
影响更为显著, 起到了主导作用, 而NAA对不定芽
的增殖起协同作用。其中A-11至A-15培养基增殖
率较高(图1-E), 不定芽增殖系数最高的培养基A-13
为WPM+2 mg·L-1 6-BA+0.7 mg·L-1 NAA , 每个叶
外植体可平均产生12.54个不定芽, 不过这种不定
芽长势弱, 生长速度慢, 不利于继代增殖。而A-5
至A-9培养基的增殖系数虽然相对较低, 但这类不
定芽长势健壮(图2-G), 生长速度快, 有利于继代增
殖, 培养基A-9为WPM+1.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1
NAA的增殖系数为4.92, 为理想增殖芽。A-16至
A-21的增殖系数可以看出, 随着两种植物生长调
节剂浓度的递增, 诱导不定芽数量呈下降趋势, 且
不定芽生长势也较弱, 说明6-BA和NAA浓度过高
均不利于山竹的增殖培养。
3 山竹的生根和移栽
当不定芽茎长到20 mm左右时, 基部切割后转
接到含有6-BA、NAA和IBA的生根培养基中进行
李敬阳等: 山竹高效再生体系的建立 1343
图1 山竹的组织培养和快速繁殖
Fig.1 The tissue culture and rapid propagation of G. mangostana
A: 疏松愈伤组织; B: 结节性愈伤组织; C: 球状胚性愈伤组织; D: 愈伤分化的芽原基; E: 愈伤组织诱导丛芽; F: 切割山竹不定芽在试
管中增殖培养2周情况; G: 生长健壮的山竹增殖苗; H: 准备移栽的山竹生根植株; I: 移栽成活试管苗。
植物生理学报1344
表1 不同培养基中无菌山竹叶片的不同形态愈伤组织诱导率
Table 1 Callus induction rate of different kind of calli formation from leaves of G. mangosteana in different media
6-BA浓度/
疏松愈伤组织诱导率/% 结节性愈伤组织诱导率/% 球状胚性愈伤组织诱导率/%
mg·L-1
GA浓度/mg·L-1 2,4-D浓度/mg·L-1 TDZ浓度/mg·L-1
0 0.5 1.0 2.0 3.0 0 0.5 1.0 1.5 2.0 0 0.5 0.7 0.9
0 2.3 3.5 5.1 4.6 4.1 2.1 15.1 19.4 20.4 9.7 1.3 9.4 18.4 18.6
0.5 5.7 6.4 8.4 7.7 6.0 14.1 21.3 27.5 28.1 16.8 10.5 21.6 36.0 22.1
1.0 10.4 10.8 12.4 18.7 13.7 23.4 41.4 33.6 20.9 15.7 12.7 18.2 22.6 17.3
2.0 11.4 12.3 9.8 9.4 9.7 18.7 62.4 22.1 11.4 6.1 13.5 20.3 24.9 12.7
3.0 9.4 9.8 8.4 8.6 9.0 4.1 10.1 12.4 8.4 3.5 8.7 14.6 17.1 9.9
生根诱导。研究表明, 在培养10 d左右时根原基开
始形成, 生根情况如表3。当在1/2MS培养基中添
加0.5 mg∙L-1 6-BA+0.5 mg∙L-1 NAA+0.1 mg∙L-1
IBA+1.0%活性炭, 培养5周时间肉质根可长到2.5
cm左右, 生根率可达85% (图1-H)。将已生根20 d
左右的试管苗打开瓶盖, 放在湿度为60%~70%的
人工气候箱中炼苗2~3 d后, 取出试管苗用自来水
洗净根部的培养基, 并用1 000倍浓度的多菌灵溶
液浸泡10 s, 然后移栽到混合基质中(椰糠:河沙:黄
土为2:1:1), 在盆子上面用塑料薄膜封住盆口放在
温室中培养, 1周后揭取薄膜喷水保持小环境相对
湿度在80%以上, 以后逐步降低生长室相对湿度,
生根萌芽了转移到温室存活率可达95% (图1-I)。
讨　　论
本文利用山竹不定胚发育而来的种子诱导无
菌苗, 研究以无菌苗叶片为外植体时激素对愈伤
组织分化及不定芽再分化的作用, 以期提高繁殖
效率。研究表明, 山竹愈伤组织分化形成过程和
胚决定及器官分化中, 表现为不同形式, 愈伤组织
形成表现不同的发育阶段, 形状有疏松状、半透
明状及致密状等。在山竹再生体系建立过程中,
诱导结节性愈伤组织是一个关键因素, 结节愈伤
组织已经在多种草本和木本植物中有过报道(钟原
等2011), 每一个小分生结节, 或称为子结节, 理论
上均可以分化出不定芽。本试验中, 2,4-D和6-BA
组合处理可以获得高频率的山竹结节性愈伤组织,
但结节性愈伤组织很难直接分化成不定芽, 如在
该条件下继续培养, 这些愈伤组织并不会进一步
形成球状愈伤, 它们要么仍然结节, 或形成大量愈
伤组织, 慢慢出现褐化, 最后死亡。因此, 需要将
形成结节愈伤组织外植体转入添加TDZ和6-BA组
合的培养基中才能转化为胚的分化。
在山竹不定芽形态发生过程中, NAA表现有
抑制芽分化效应, NAA对形态分化和不定芽分化
的产生负面影响, 而6-BA对芽分化作用明显, 适当
量的TDZ能诱导芽形成而抑制形成愈伤组织。
Prommee和Sompong (1999)的研究表明, 叶片组织
培养中, 利用乙烯影响其组织分化, 乙烯对组织培
表2 不同浓度6-BA和NAA对山竹不定芽增殖系数的影响
Table 2 Effects of various concentrations of 6-BA and NAA
on multiplication coeffi cient of embryonic callus
编号 6-BA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 增殖系数
A-1 0 0 0.19±0.03i
A-2 0 0.1 0.52±0.09h
A-3 0 0.3 0.88±0.16h
A-4 0.5 0 1.82±0.12g
A-5 0.5 0.1 3.23±0.09f
A-6 0.5 0.3 3.21±0.11f
A-7 1.0 0 2.23±0.18g
A-8 1.0 0.1 3.61±0.26f
A-9 1.0 0.3 4.92±0.05e
A-10 1.5 0.3 7.69±0.12c
A-11 1.5 0.5 10.45±0.49ab
A-12 1.5 0.7 10.80±0.25ab
A-13 2.0 0.7 12.54±0.68a
A-14 2.0 0.9 8.23±0.63c
A-15 2.0 1.2 9.63±0.36b
A-16 3.0 0.9 8.78±0.11c
A-17 3.0 1.2 8.32±0.47c
A-18 3.0 1.5 6.06±0.41cd
A-19 4.0 1.2 5.76±0.22d
A-20 4.0 1.5 5.16±0.22e
A-21 4.0 2.0 5.04±0.15e
　　表中数据为平均值, 同一列中不同字母表示数据差异显著
(P≤0.05); 下表同此。
李敬阳等: 山竹高效再生体系的建立 1345
表3 不同植物生长调节剂对山竹生根的影响
Table 3 Effects of different plant growth regulators on G. mangostana rooting
编号 IBA浓度/mg·L-1 6-BA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 生根率/%
B-1 0 0 0 8.79±0.29h
B-2 0.1 0 0.3 14.32±0.78g
B-3 0.1 0.3 0.3 42.50±1.52e
B-4 0.1 0.5 0.5 85.23±0.96a
B-5 0.5 0 0 35.54±2.27f
B-6 0.5 0.3 0.3 64.08±2.07c
B-7 0.5 0.5 0.5 73.83±1.59b
B-8 1.0 0 0 49.35±1.09d
B-9 1.0 1.0 0.5 48.66±1.67d
B-10 1.0 1.5 1.0 50.18±0.84d
养中芽的形态产生一定的影响, 但本试验未观察
到其有明显的影响。
本研究通过愈伤诱导发生途径成功建立了山
竹无菌叶片高效可行的再生体系, 不同种类愈伤
组织诱导和及时调整生长条件是诱导叶片不定芽
成功的关键, 这将为山竹产业发展及新品种培育
奠定了基础。
参考文献
Akao Y, Nakagawa Y, Iinuma M, Nozawa Y (2008). Anti-cancer
effects of xanthones from pericarps of mangosteen. Int J Mol
Sci, 9: 355–370
Almeyda N, Martin FW (1976). Cultivation of neglected tropical
fruits with promise 1. The mangosteen (Garcinia mangostana L.).
US Agr Res Service South Region, 155: 1–18
Chong ST (1992). Vegetative propagation of mangosteen (Garcinia
mangostana L.). Acta Hort, 292: 73–80
Goh GKL, Rao AN, Loh CS (1988). In vitro plantlet formation in
mangosteen (Garcinia mangostana L.). Ann Bot, 62 (1): 87–93
Jung HA, Su BN, Keller WJ, Menta RG, Kinghorn AD (2006).
Antioxidant xanthones from the pericarp of Garcinia
mangostana (Mangosteen). J Agric Food Chem, 54: 2077–2082
Ngawhirunpat T, Opanasopi P, Sukma M, Sittisombut C, Kat A,
Adachi I (2010). Antioxidant, free radical-scavenging activity
and cytotoxicity of different solvent extracts and their phenolic
constituents from the fruit hull of mangosteen (Garcinia
mangostana). Pharm Biol, 48 (1): 55–62
Okonogi S, Duangrat C, Anuchpreeda S, Tachakittirungrod S,
Chowwanapoonpohn S (2007). Comparison of antioxidant
capacities and cytotoxicities of certain fruit peels. Food Chem,
103: 839–846
Pothitirat W, Chomnawang MT, Supabphol R, Gritsanapan W (2010).
Free radical scavenging and anti-acne activities of mangosteen
fruit rind extracts prepared by different extraction methods.
Pharmaceutical Biol, 48 (2): 182–186
Prommee W, Sompong TC (1999). Varietal improvement of
mangosteen (G. mangostana L.) by mutagen application in vitro.
The 37th Kasetart University Annual Conferense, 1999-02-03-
05. Thailand, Bangkok: Text and Journal Publication Co Ltd,
192–199
Richard AJ (1990). Studies in Garcinia, dioecious tropical forest tree:
the origin of mangosteen (G. mangostana L.). Bot J Linn Soc,
103: 301–308
Te-Chato S, Lim M (2000). Improvement of mangosteen
micropropagation through meristematic nodular callus formation
from in vitro-derived leaf explants. Sci Hort, 86: 291–298
Yang LL, Lee CY, Yen KY (2000). Induction of apoptosis by
hydrolyzable tannin from Eugenia jambos L. on human leukemia
cells. Can Lett, 157: 65–75
Yu L, Zhao M, Yang B, Zhao Q, Jiang Y (2007). Phenolics from hull
of Garcinia mangostana fruit and their antioxidant activities.
Food Chem, 104: 176–181
Zhong Y, Cheng F-Y, Qin L (2011). Meristematic nodule: a valuable
developmental pathway for plant regeneration. Bull Bot, 46 (3):
350–360 (in Chinese with English abstract) [钟原, 成仿云, 秦磊
(2011). 分生结节: 一种有价值的植株再生途径. 植物学报, 46
(3): 350–360]
植物生理学报1346
Establishment of highly effi cient regeneration system of mangosteen (Garcinia
mangostana)
LI Jing-Yang1,2, LI Yan-Xia1, LIN Fei1, XU Yi1, HUANG Dong-Mei1, TANG Fen-Ling1, LI Yu-Jia1, JIN Zhi-Qiang2,*
1College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2Haikou Experimental Sta-
tion, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 570102, China
Abstract: This study established the system of in vitro culture and multiplication of mangosteen (Garcinia
mangostana) using explants from germinated seedlings. The results showed that after 6 weeks of culture inocu-
lation, high percentage (62.4%) of nodular callus formations were established from aseptically leaf explants on
WPM medium with 1.0 mg·L-1 GA3+1.0 mg·L
-1 6-BA +0.5 mg·L-1 TDZ, and 36% globular callus formations
were induced on WPM medium with 0.7 mg·L-1 TDZ+0.5 mg·L-1 6-BA. After 8 weeks of culture, the multipli-
cation coeffi cient of globular embryogenic callus reached 12.54 on WPM medium supplemented with 2.0 mg·L-1
6-BA and 0.5 mg∙L-1 NAA. Subsequently, adventitious buds with 20 mm length were transferred to rooting me-
dium for rooting culture. And the best medium for rooting was 1/2MS+0.5 mg∙L-1 6-BA+0.5 mg∙L-1 NAA+0.1
mg∙L-1 IBA+1.0% AC, and the rooting rate was 85.2%.
Key words: Garcinia mangostana; nodular callus; embryonic callus; adventitious embryo
Received 2016-07-07 Accepted 2016-09-01
This work was supported by the Key R&D Programs for Science and Technology of Hainan Province, China (Grant No. ZDYF2016054) and Spe-
cial Research Funds of Haikou Experimental Station, CATAS (Grant No. HKZKY140101).
*Corresponding author (E-mail: wenca107@hotmail.com).