全 文 ：作者简介 杨柳（1986-），女，硕士在读，研究方向：中药药理学；通信
作者：孟林，E-mail：mdndy@126.com。
文章编号 1006－8147（2011）03-0328-04
论 著
东北鹤虱多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞
功能的影响
杨 柳 1，王 萌 1，于 跃 1，郭秀英 1，阎 嘉 2，杨凤蕊 1，孟 林 1
（1.天津医科大学药理学教研室，天津 300070；2.北京市天坛生物制品股份有限公司，北京 100024）
摘要 目的：研究东北鹤虱多糖（LEGPS-Ⅱ）对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞（MΦ）功能的影响。方法：采用免疫力低下小鼠，通过
中性红实验，观察 LEGPS-Ⅱ对小鼠静止和 ConA活化的腹腔 MΦ体外吞噬功能的影响；采用噻唑蓝比色法（MTT），观察 LEG－
PS-Ⅱ对小鼠静止和 ConA活化的腹腔 MΦ体外分泌 IL-1β与 TNF-α的影响。结果：MΦ体外吞噬实验表明，LEGPS-Ⅱ在
0.015 6～0.25 μg·mL-1的浓度范围内可剂量依赖性地增加静止和 ConA活化的免疫力低下小鼠腹腔 MΦ吞噬中性红的能力；
LEGPS-Ⅱ在 20～80 μg·mL-1的浓度范围内可剂量依赖性地增加 ConA活化的免疫低下小鼠腹腔 MΦ分泌 IL-1β，但不能有效刺
激免疫低下小鼠静止的腹腔 MΦ产生 IL-1β；LEGPS-Ⅱ在 10～80 μg·mL-1的浓度范围内可增加静止和 ConA活化的免疫力低下
小鼠腹腔 MΦ分泌 TNF-α，且刺激作用具有剂量依赖性。结论：LEGPS-Ⅱ可以通过提高小鼠腹腔 MΦ的吞噬能力，并增加 IL-
1β与 TNF-α的分泌而增强 MΦ的免疫调节功能。
关键词 东北鹤虱；多糖；免疫调节；巨噬细胞；吞噬能力；细胞因子
中图分类号 R96 文献标识码 A
Effects of polysaccharide from Lappula Echinata Gilib on peritoneal macrophage in immunosuppressive
mice in vitro
YANG Liu1, WANG Meng1, YU Yue1, GUO Xiu-ying1, YAN Jia2, YANG Feng-rui1, MENG Lin1
（1.Department of Pharmacology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2. Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd, Bei－
jing 100024, China）
Abstract Objective: To study the immunoregulatory effects of polysaccharide from Lappula Echinata Gilib ( LEGPS-Ⅱ) on immuno－
suppressive murine peritoned macrophage in vitro. Methods: The effects of LEGPS-Ⅱ on phagocytosis of resting and ConA-activated
macrophage in immunosuppressive mice were detected with the neutral red method in vitro. The effects of LEGPS-Ⅱ on the cytokine
about IL-1β and TNF-α from resting and ConA-activated peritoned macrophage in immunosuppressive mice were assayed by MTT
method in vitro. Results: In vitro, the macrophage phagocytosis experiments showed that LEGPS-Ⅱ (0.015 6～0.25 μg·mL-1) had signifi－
cant enhancement on phagocytosis of resting and ConA-activated peritoned macrophage with the dose-dependent effect. LEGPS-Ⅱ(20～
80 μg·mL-1) could increase the level of IL-1β secreted by ConA-activated macrophage in immunosuppressive mice, but the level could
not be increased in the resting macrophage. LEGPS-Ⅱ(10～80 μg·mL-1) had obvious enhancement on the TNF-α secretion of resting and
ConA-activated peritoneal macrophage in immunosuppressive mice with the dose-dependent tendency. Conclusion: These indicate that
LEGPS-Ⅱ expresses its specific and nonspecific immunoregulatory effects by improving the phagocytosis and enhancing the secretion of
TNF-α and IL-1β in macrophage in vitro.
Key words Lappula Echinata Gilib; Polysaccharide; Immunoregulatory activity; Macrophage; Phagocytosis; Cytokine
东北鹤虱（Lappula Echinata Gilib，LEG）为紫草
科植物东北鹤虱的果实，盛产于我国华北、东北等
地区。药书记载，其味苦、辛、平，入脾、胃、肝三经，
可治疗虫积腹痛 [1]，民间用其果实或全草水煎治疗
各种腹疼、腹泻，尤其对慢性、迁延性腹泻有独到的
疗效。已有研究证明其多糖具有抗炎[2]、缓解平滑肌
痉挛[3]、调节胃肠水平衡[4]等作用，也有实验表明，其
对机体淋巴细胞功能有增强或调节作用[5]。本文将
通过观察巨噬细胞（MΦ）体外吞噬、细胞因子 IL-1β
和 TNF-α的分泌，探讨 LEGPS-Ⅱ对 MΦ参与免疫
功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1．1．1 药物 东北鹤虱多糖 LEGPS-Ⅱ，淡黄色粉
末，易溶于水，纯度为 38.7%。药物用 PBS缓冲液配
制成 1 mg·mL-1储备液，-20 ℃冰箱保存，临用前用
Vol． 17, No． 3
Sep. 2011
天津医科大学学报
Journal of Tianjin Medical University
第 17卷 3期
2011年 9月328
PBS缓冲液稀释成所需浓度。
1.1.2 试剂 RPMI-1640培养液，北京天润善达生
物科技有限公司；超级新生牛血清，美国 Gibco公
司；注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，
生产批号：05091008；四甲基偶氮唑盐（Methyl thia－
zolyl tetrazole，MTT），瑞士 Fluka公司；中性红试剂，
中奥天元科技发展有限公司。
1.1.3 实验动物及细胞 近交系清洁级 BALB/C及
昆明种小鼠，体重（20±0.25）g，4～5周龄，雌雄不拘，
购自中国医学科学院放射医学研究所（批准文号：
SCXK津 2005-0001）。L929细胞株由天津医科大学
药学院惠赠。
1.1.4 仪器 Model 680型酶标仪（Bio-Rad）；CK40
生物倒置显微镜（Olympus）；Forma SeriesⅡ型二氧
化碳孵箱（Thermo Electron Corporation）
1.2 方法
1.2.1 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔 MΦ吞噬功
能的影响 取昆明种小鼠 1只，腹腔注射环磷酰
胺，每次给药剂量为 25 mg·kg-1，连续给药 3 d。第
3天给药 30 min后，将小鼠脱臼处死。无菌条件下
常规方法制备腹腔 MΦ悬液。另取同窝昆明种小鼠
1只制备正常小鼠腹腔 MΦ悬液，1640培养液调整
细胞密度为 2×106 mL-1。实验分为正常空白对照组
（1640培养液 200 μL）、免疫抑制组（1640培养液
200 μL）、LEGPS-Ⅱ单独刺激组（1640培养液 180
μL 和 0.25～0.031 25 μg·mL-1 LEGPS -Ⅱ 20 μL）、
LEGPS-Ⅱ联合 ConA 刺激组（1640 培养液 160
μL 和 0.25～0.031 25 μg·mL-1 LEGPS-Ⅱ20 μL以
及 5 μg·mL-1 ConA 20 μL）、ConA单独刺激组（1640
培养液 180μL和 5μg·mL-1ConA 20 μL）。孵育 24 h
后，吸去各孔上清液，PBS洗掉孔中非粘附细胞，然
后加入 0.072%的中性红溶液 100 μL，孵育 4 h。倒
置显微镜下观察染色情况。后吸弃上清，用 PBS洗
掉各孔中未进入细胞的中性红，反复两次。各孔中加
入细胞裂解液 100 μL，振荡 200 s后测 OD570nm值。
1.2.2 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔 MΦ体外分
泌 IL-1β的影响 取昆明种小鼠同 1.2.1的方法建
立免疫抑制小鼠模型，并于无菌条件下收集免疫抑
制小鼠腹腔 MΦ 悬液。另取同窝昆明种小鼠，同
1.2.1的方法制备正常小鼠腹腔MΦ悬液，用 1640培
养液调整细胞浓度为 2×106 mL-1。实验分组同上，其
中 LEGPS-Ⅱ单独刺激组 80～20 μg·mL-1 LEGPS-Ⅱ
20 μL、LEGPS-Ⅱ联合 ConA刺激组为80～20 μg·mL-1
LEGPS-Ⅱ20 μL以及 5 μg·mL-1 ConA 20 μL。孵育
48 h，此各孔上清液中即含 IL-1β。
另取 BALB/c小鼠 1只脱椎处死，无菌取胸腺，
研磨过 200目筛网，洗 2次，得胸腺单细胞悬液，调
细胞密度为 2.2×106 mL-1，混匀，于 96孔板中加入
100 μL胸腺细胞悬液。将前述含有 IL-1β的待测巨
噬细胞上清液以每孔 100 μL按对应位置加入到此
96孔板胸腺细胞悬液中，孵育 48 h。以 MTT法测
570nm的吸光度值。
1.2.3 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔 MФ体外分
泌 TNF-α的影响 取昆明种小鼠同 1.2.1的方法建
立免疫抑制小鼠模型，并于无菌条件下收集免疫抑
制小鼠腹腔 MΦ 悬液。另取同窝昆明种小鼠，同
1.2.1的方法制备正常小鼠腹腔 MΦ悬液，用 1640
培养液调整细胞浓度为 2×106 mL-1。实验分组同前，
其中 LEGPS-Ⅱ单独刺激组 80～10μg·mL-1LEGPS-Ⅱ
20μL、LEGPS-Ⅱ联合 ConA刺激组 80～10 μg·mL-1
LEGPS-Ⅱ20μL以及 5μg·mL-1ConA20μL。消化、收
集 L929细胞，加腹腔 MΦ培养上清液并以 MTT法
测 570 nm的吸光度值，计算抑制率。
1.3 统计学方法 数据用 SPSS17.0统计软件进行
处理，结果以 x±s形式表示。多样本均数比较进行
方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔 MΦ吞噬功能
的影响 在图 1中，正常空白对照组的 OD值高于
免疫抑制组 2倍以上，提示免疫抑制小鼠 MΦ吞噬
能力明显低于正常小鼠，造模成功。结果也显示，单
独使用 LEGPS-Ⅱ，在 0.031 25~0. 25 μg·mL-1范围
内，MΦ吞噬能力较免疫抑制组提高，但低于 ConA
单独刺激组和正常空白对照组；同样剂量范围
LEGPS-Ⅱ联合 ConA，吞噬能力也较免疫抑制组提
高，但仍低于 ConA单独刺激组和正常空白对照组。
图 1 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MФ吞噬功能的影响 (x±s,
n=6)
Fig1 EffectsofLEGPS-Ⅱonphagocytosisofperitonealmacrophage
in immunosuppressive mice (x±s, n=6)
与免疫抑制组相比 *P<0.01；与 ConA单独刺激组相比 #P<0.01；与正
常空白组相比 ¤P<0.01
OD
值
（
57
0
nm
）
杨 柳，等.东北鹤虱多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响第 3期 329
2.2 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MΦ体外分泌
IL-1β的影响 被环磷酰胺免疫抑制后的巨噬细胞
处于静止期，几乎不再分泌细胞因子 IL-1β。从图 2
中可以看到，受免疫抑制组上清液中缺乏 IL-1β的
影响，其 OD值较正常空白对照组明显降低，提示免
疫抑制小鼠动物模型建立成功；4个 LEGPS-Ⅱ单独
刺激组对免疫抑制下的 MΦ分泌 IL-1β无明显增
加作用，与免疫抑制组的 OD值相比无统计学差异
（P>0.05）。经由 ConA诱导后，免疫抑制下的 MΦ可
再次分泌 IL-1β，ConA单独刺激组的 OD值达到免
疫抑制组的 1.41倍，而 80、60、40、20 μg·mL-1 4个
剂量组的 LEGPS-Ⅱ可以较大地提高被 ConA诱导
的 MΦ分泌 IL-1β的水平，并在此药物浓度范围内
具有剂量依赖性。
2.3 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔 MФ体外分泌
TNF-α的影响 如图 3所示，与免疫抑制组相比，
40、80 μg·mL-1这 2 个 LEGPS-Ⅱ单独刺激组的抑
制率超过了 ConA单独刺激组；而同剂量的 LEGPS-
Ⅱ联合 ConA刺激组与 ConA单独刺激组相比明显
提高。这说明，LEGPS-Ⅱ可促使静止的和被 ConA
活化的被免疫抑制的 MФ分泌 TNF-α的量增加，并
具有一定的剂量依赖性。
图 2 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MΦ体外分泌 IL-1β的影响
(x±s, n=6)
Fig 2 Effects of LEGPS-Ⅱon the cytokine about IL-1β from
phagocytosis of peritoneal macrophage in immunosuppressive
mice (x±s, n=6)
与免疫抑制组相比 *P<0.01；与 ConA 单独刺激组相比 #P<0.05，
##P<0.01；与正常空白组相比 ¤P<0.01
图 3 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MФ体外分泌 TNF-α的
影响 (x±s, n=6)
Fig 3 Effects of LEGPS-Ⅱon the cytokine about TNF-α from
phagocytosis of peritoneal macrophage in immunosuppres-
sive mice (x±s, n=6)
与免疫抑制组相比 *P<0.01；与 ConA单独刺激组相比 #P<0.05，##P<
0.01；与正常空白组相比 ¤P<0.01
OD
值
（
57
0
nm
）
抑
制
率
（
%）
3 讨论
本实验研究了 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔 MΦ的体
外吞噬能力及对 IL-1β和 TNF-α分泌的影响。实
验结果显示，LEGPS-Ⅱ在 0.031 25～0.25 μg·mL-1
范围内可使静止的以及被 ConA[6]诱导激活的免疫
抑制小鼠的腹腔 MΦ吞噬能力增加，并具有剂量依
赖性。同时实验结果也显示，ConA单独刺激 MΦ的
吞噬能力高于 LEGPS-Ⅱ各剂量组，两者合用并没
有表现出联合作用，反而使单用 ConA时的作用减
弱，小剂量 LEGPS-Ⅱ即可表现出对 ConA作用的拮
抗，随着浓度增加而逐渐增强，由此提示，LEGPS-Ⅱ
有可能在 MΦ表面有结合位点，而且部位与 ConA
在 MΦ表面的丝裂原受体接近或重叠，因此表现出
竞争性抑制，但这点有待于进一步实验证实。被活
化 MΦ的吞噬能力呈现出对 LEGPS-Ⅱ的剂量依赖
性，当 LEGPS-Ⅱ的浓度不断加大，其转为向下调节
被活化 MΦ的吞噬能力，这有可能对发生过度非特
异免疫应答起到一定的保护作用。
LEGPS-Ⅱ并不能单独刺激已被免疫抑制的
MΦ分泌更多的 IL-1β[7]，但此 MΦ被 ConA激活后，
20~80 μg·mL-1 LEGPS-Ⅱ则可促进其分泌 IL-1β，
并且均高于 ConA单独刺激的效果，表现出剂量依
赖性。因此分析，LEGPS-Ⅱ对活化的巨噬细胞分泌
IL-1β的促进作用更明显，而对免疫抑制的静止巨
噬细胞效果欠佳，增大 LEGPS-Ⅱ的剂量亦不能使
巨噬细胞 IL-1β分泌增加。推测在病原体感染（此
时巨噬细胞被病原体激活）或其他刺激原存在情况
下，LEGPS-Ⅱ可能对于正常个体或免疫功能抑制个
体具有较好的上调 IL-1β水平的作用，进而上调巨
噬细胞非特异免疫功能，提高机体的防病、抗病能
力。对于免疫抑制的静止巨噬细胞，较大剂量的
LEGPS-Ⅱ可以明显地增加 TNF-α的产生[8]，而对于
免疫抑制的活化巨噬细胞，各个剂量的 LEGPS-Ⅱ
（下转第 337页）
第 17卷天津医科大学学报330
均可以促使其分泌 TNF-α增多。由此可见，处于免
疫抑制状态下的静止巨噬细胞对 LEGPS-Ⅱ敏感度
低，需要增大 LEGPS-Ⅱ的浓度才能刺激巨噬细
胞更多地分泌 TNF-α，而当免疫抑制状态的巨噬细
胞被激活，LEGPS-Ⅱ使 TNF-α 的分泌量增加，且
与 ConA有联合作用。
从以上 LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫
功能调节实验中可以看到，LEGPS-Ⅱ可以增加免疫
抑制条件下静止的、活化的巨噬细胞的体外吞噬能
力，以及 TNF-α的生成能力；促进免疫抑制条件下
活化的巨噬细胞体外分泌 IL-1β。
参考文献：
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(2010-11-01收稿)
患者相比没有统计学意义。本次研究显示 LADA患
者并发肾病、高血压、视网膜病变、周围神经病变及
下肢/足部病变的比例与 2型糖尿病相比无差异，可
能与样本不足有关。另外，本研究糖尿病并发症信
息是调查获得，故也不排除信息偏倚所致。有关
LADA患者与 T2DM患者相关并发症出现率的差异
有待深入研究。Ariken等[6]还报道，与 T2DM患者相
比，LADA患者注射胰岛素的比例更高，与本次研究
结果一致。
一些研究结果显示 LADA 患者与 T2DM 患者
相比，确诊年龄更早，体重指数更低[6-7]。Romkens[8]报
道 LADA 患者与 T2DM 患者相比，HDL-C 水平更
高。本研究结果显示，LADA患者与 T2DM患者相
比，糖尿病确诊年龄、BMI和WHR的差异没有统计
学意义；LADA患者 VLDL-C低于 T2DM患者，而其
它血脂水平与 T2DM 相比均无统计学差异；LADA
患者与 T2DM患者酮症史的差别没有统计学意义。
这些研究结果不一致，可能与研究对象的年龄构
成、样本含量、糖尿病病程、资料获取方法的可比性
等因素有关，有待于进一步深入研究。
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（上接第 330页）
王 竞，等.LADA与 2型糖尿病患者临床特点的比较第 3期 337