全 文 ：第 27卷第 3期
2009年 9月
湖北民族学院学报(自然科学版)
JournalofHubeiUniversityforNationalities(NaturalScienceEdition)
Vol.27　No.3
Sep.2009
收稿日期:2009-06-01.
基金项目:湖北省教育厅项目的研究(B200729006);湖北民族学院优秀青年项目.
作者简介:秦恩华(1964-),女 ,实验师 ,主要从事于食品微生物及生物资源开发工作.
小腊树黄酮的分离纯化及抗氧化研究
秦恩华 ,唐　腾
(湖北民族学院 生物科学与技术学院 ,湖北 恩施 445000)
摘要:研究了大孔树脂分离纯化小腊树黄酮的工艺 , 以及纯化前后对 DPPH自由基的清除作用.结果表明:AB
-8型树脂是分离纯化黄酮的适宜大孔树脂;AB-8型大孔树脂分离纯化黄酮的最佳工艺条件为:提取物上样量为
6BV(以湿树脂体积计),先用水淋洗 , 再用 30%的乙醇洗脱 ,洗脱剂用量为 3.3倍湿树脂体积.纯化后黄酮对 DPPH
自由基的清除效果要低于纯化前.
关键词:小腊树;黄酮;大孔树脂;纯化;DPPH
中图分类号:TS202.3 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2009)03-0282-03
StudyontheSeparationPurificationandAntioxidationof
FlavonoidsfromtheLigustrumquihouiCarr.
QINEn-hua, TANGTeng
(SchoolofBiologicalScienceandTechnology, HubeiUniversityforNationalities, Enshi445000, China)
Abstract:ThetechnologyforseparationandpurificationofflavonoidsfromLigustrumquihouiCarr.with
macroporousresinwasstudied, andtheeliminationefectontheDPPHfreeradicalofthecrudeandpuri-
fiedflavonoidswasdiscussed.Theresultsareasfolows:amongthreetypesofmacroporousadsorptionres-
in, AB-8 typemacroporousresinisthebestforseparatingandpurifyingLigustrumquihouiCar.fla-
vonoids;theoptimunconditionsare:theloadedamountofLigustrumquihouiCar.extractionis6BV, wash
withwaterandthenuse30% ethanolaseluant, andtheamountoftheeluantwas3.3resin.Theelimina-
tionrateontheDPPHofcrudeflavonidswashigherthanthepurified.
Keywords:LigustrumquihouiCarr.;flavonoids;macroporousresin;purification;DPPH
小腊树(LigustrumquihouiCarr.)又名小叶女贞 ,木犀科 ,女贞属的植物 ,在我国主要分布在江苏 、湖北 、
湖南等地.常生长于山坡 ,沟谷 ,溪边树林或灌木丛中 [ 1] .临床和实验研究发现小腊树的提取物具有显著的
增强机体免疫功能 、止咳平喘及清除自由基等作用 ,该属植物女贞果实中所含的主要成分齐墩果酸也已用于
肝炎的临床治疗 [ 2, 3] .本文主要对小腊树叶的黄酮分离纯化工艺进行了探讨 ,并对分离纯化前后的黄酮的体
外抗氧化作用进行了研究.
1　材料 、试剂与仪器
1.1　实验材料
小腊树枝 、叶:采于湖北民族学院 ,清洗晾干明水 ,于 60℃烘干粉碎备用.
1.2　主要试剂与仪器
芦丁 、乙醇 、石油醚 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、浓硫酸 、苯酚 、DPPH6.5×10-5mol/L溶液 、AB– 8
型 、D– 101型 、NKA–Ⅱ型大孔树脂 ,均为国产分析线.
SHZ-111B循环水式多用真空泵 ,临海市潭氏真空设备有限公司;DL-5低速大容量离心机 ,上海安亭
科学仪器厂制造;RE-52旋转蒸发仪 ,上海亚荣生化仪器厂;系列层析柱:1.6×50cm,上海沪西分析仪器
厂;756MC紫外可见光分光光度计 ,上海精密科学仪器有限公司.
2　试验方法
2.1　小腊树叶黄酮的提取工艺
取 100g叶样品 ,用石油醚浸泡 2h脱脂脱色 ,离心 ,倾去石油醚 ,自然风干 ,取 10g脱色脱脂样品 ,按 1∶
30的料液比 ,乙醇浓度 80%,在 80℃水浴锅中冷凝回流浸提 3h.离心 ,残渣按上述方法进行二次浸提 ,将两
次浸提液再用石油醚萃取 ,然后将萃取后的浸提液浓缩后定容至 250mL,备用.
2.2　黄酮质量分数测定 NaNO2 -Al(NO3)3 -NaOH
参照文献 [ 4] ,制备标准曲线 ,得回归方程为:y=-0.0049+1.0721x, R2 =0.9996
样品质量分数测定:取 0.2mL原液置于 10mL容量瓶中 ,按照标准曲线的方法测定吸光度;根据回归方
程计算得出叶样品中的黄酮质量分数.
2.3　小腊树黄酮分离纯化
2.3.1　大孔树脂的预处理　分别称取 10gAB-8、D-101、NKA-Ⅱ型大孔树脂用 95%乙醇浸泡 24h,充分
溶胀后 ,抽滤 ,用蒸馏水反复冲洗至中性;再用 5%的 NaOH溶液浸泡 3h再用蒸馏水洗至中性;接着用 5%
HCl溶液浸泡 3h,再用蒸馏水洗涤至中性.
2.3.2　大孔树脂的筛选[ 5] 　称取 1.0g经处理好的树脂于 50mL烧杯中 ,加入浓度为 C0的黄酮提取液 10
mL,在室温下搅拌 2h,然后在 4 800r/min下离心 15min,得上清液 1 ,测其黄酮浓度 C1.取出吸附饱和的树脂
加入 10mL体积分数为 90%的乙醇洗脱 ,同样温度下搅拌 2h,离心 ,得上清液 2,测其黄酮浓度 C2 ,分别以吸
附率和解吸率为参考指标 ,观察各树脂性能.
吸附量 =C0V-C1V1 /W;吸附率 =(C0V-C1V1)/C0V×100%;解吸率 =C2V2 /(C0V-C1V1)×100%
式中 C0为黄酮提取液浓度;C1为树脂吸附后剩余溶液浓度;C2为洗脱液浓度;V为加入的黄酮体积;V1为
上清液 1的体积;V2为上清液 2的体积 , W:湿树脂的重量(g).
2.3.3　大孔树脂吸附纯化黄酮工艺的确定
2.3.3.1　动态吸附曲线的测定 [ 6] 　量取一定量的大孔树脂置于层析柱中 ,以浓度为 0.608mg/mL的黄酮稀
释液上柱 ,每次上柱 20mL,流速为 1.5mL/min,收集流出液 ,测定流出液的体积及吸光度.直至流出液吸光
度与黄酮原溶液的吸光度接近时 ,此时树脂吸附饱和 ,停止上柱 ,画出吸附曲线.
2.3.3.2　洗脱剂浓度的确定　上样后的树脂先用水洗脱至无色并用浓硫酸检测无糖反应(取 1mL流出液
加入 1mL5%的苯酚 ,再加入 5mL浓硫酸 ,测定其吸光度.)再依次用 50mL30%、50%、70%、90%的乙醇溶
液进行洗脱 ,收集不同浓度的乙醇洗脱液 ,测定洗脱出的黄酮的浓度 ,以确定最佳的洗脱剂.
2.3.3.3　黄酮纯溶液的收集　在层析柱中加入一定量 AB-8树脂 ,而后加入一定量(能使树脂达到饱和吸
附状态)的提取液 ,等吸附完全后用水洗脱至无糖反应 ,再用一定浓度的乙醇溶液解吸 ,流速均为 1.5mL/
min并收集 ,每管 5mL,以上步骤的收集后 ,分别取 0.5mL测其吸光值.
2.4　小腊树叶及叶纯化后黄酮对 DPPH自由基的清除作用 [ 7]
在试管中依次加入 2.5mL6.5×10-5mol/LDPPH溶液和 1.5mL60%的乙醇 ,总体积为 4.0mL,混匀 20
min后 ,于 1cm比色皿中测定 D(517nm),记为 A0;加入 2.5mL6.5×10-5mol/L的 DPPH溶液再分别加入含
有小腊树黄酮浓度为 1.000mg/mL的溶液 0.08、0.16、0.24、0.32、0.40mL,测定值记为 Ai;加入 2.5mL体积
分数为 60%的乙醇和 1.5mL待测试样溶液 ,定值记为 Aj.按下式计算 DPPH自由基清除率.
I%= 1-Ai-AjA0 ×100%
3　结果与分析
3.1　柱层析树脂的优化
三种树脂对小腊树黄酮吸附分离性能见表 1,由表 1的数据可以看出 , D-101树脂对小腊树叶黄酮的
283第 3期　　　　　　　　　　　　　　秦恩华等:小腊树黄酮的分离纯化及抗氧化研究　　　　　　　　　　　　　　　　
表 1　3种树脂对小腊树叶黄酮的吸附分离性能比较
Tab.1　Comparisonofadsorpinganddesorpingcapabilityof
threetypesmacroporousresinonpyracanthafruitflavonoid
树脂 清液体积/mL 吸附量/mg· g-1 黄酮吸附率 /% 解析出黄酮量 /mg 解析率/%
AB– 8 8.25 5.92 19.97 5.20 87.83
NKA–Ⅱ 8.25 6.11 20.61 3.32 54.25
D– 101 7.75 7.14 24.08 3.79 53.08
图 1　动态吸附曲线
Fig.1　Thedynamicabsorptioncurve
表 2　乙醇浓度对 AB-8大孔树脂纯化黄酮的影响
Tab.2　Effectofethanolconcentrationonthe
purificationofflavonoidswithAB-8 typeresin
乙醇浓度 /%黄酮质量分数 /mg· mL-1黄酮回收率 /%
30 0.116 1 26.11
50 0.092 8 20.86
70 0.046 2 10.38
90 0.064 8 8.74
图 2　AB-8树脂洗脱曲线
Fig.2　EluentcurveofAB-8typemacroporousresin
表 3　小腊树叶黄酮纯化前后对 DPPH自由基的清除作用
Tab.3　TheeliminationefectontheDPPH
ofthepurifiedandcrudeflavonoids
黄酮浓度/μg· mL-1 粗黄酮% 对 DPPH自由基的清除作用 /%
20 32.894 7 15.469 6
40 47.894 7 17.403 3
60 49.736 8 26.243 1
80 63.421 1 27.900 6
100 78.421 1 33.977 9
吸附率最高 ,达到 24%,但是其解析率是最差的 ,
只有 53%左右 , AB-8树脂对黄酮的吸附率虽然
低于 D-101树脂 ,但解析率要远远高于 D-101,
因此同样的处理条件下 , AB-8树脂解析出的黄
酮的量最多 ,因此选用 AB-8树脂作为小腊树叶
最佳动态吸附介质.
3.2　柱层析纯化实验
(1)动态吸附曲线见图 1,由图 1可知在 0 ～ 30mL时缓慢
增长 ,而在 30 ～ 40mL时增幅明显增大 ,到了 40mL后 ,流出液
的浓度基本达到吸附平衡 ,因此选择上样量为 30mL/4.82mL
湿树脂 ,即 6BV的上样量.
(2)洗脱溶剂浓度研究结果见表 2.由以上数据可以看出浓
度为 30%的乙醇解析效果好.
(3)AB-8洗脱曲线如图 2所示 ,第 12管即 60mL
后洗脱液吸光度减小 ,表明此部分洗脱液中黄酮质量分
数很低 ,绝大多数黄酮在前 60mL已被洗脱下来 ,从经济
和效率考虑 ,第 60mL后可不予收集 ,故洗脱剂用量定为
3.3倍湿树脂体积.
3.3　小腊树叶黄酮纯化前后对 DPPH自由基清除率的
作用
由表 3的结果可以看出 ,纯化后小腊树叶黄酮对
DPPH自由基的清除作用下降 ,其原因有可能是在粗黄
酮提取液制备时采用的溶剂为乙醇溶液 ,这样所有溶解
于乙醇的物质都会进入到此溶液中 ,包含皂甙类(具资
料报道小腊树中皂甙类质量分数较高),这些皂甙对黄
酮的抗氧化效果有可能具有辅助作用;而纯化后的溶液
中皂甙类物质基本上被去除 ,只保留了黄酮类物质 ,从而
使得其抗氧化效果有所下降 ,目前有关小腊树皂甙的抗
氧化特性正在研究.
4　结论
(1)AB-8大孔树脂对柚皮黄酮具有良好的吸附性
能 ,用其纯化小腊树黄酮是可行的;
(2)AB-8大孔树脂分离纯化小腊树黄酮的最佳条
件为:上样量为 6BV湿树脂 ,先用水淋洗去杂 ,然后用
30%的乙醇洗脱 ,洗脱剂用量为 3.3倍湿树脂体积;
(3)纯化后小腊树黄酮对 DPPH自由基的清除效果
有所下降 , 100 μg/mL的精黄酮对 DPPH清除率为
78.421 1%,而纯化后的反为 33.977 9%,相同浓度粗黄
酮对 DPPH的消除力大约是纯化黄酮的 2.3倍.有关其原因尚有待于进一步研究 ,并且纯化前后的黄酮类物
质对其他自由基的清除作用是否与 DPPH的相同也仍然值得进行研究.
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(下转第 288页)
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3　结论
从白杨镇磷矿根际土壤中筛选到的 15株解钾菌 ,通过测定各菌株液体培养后培养液中钾含量 ,并通过
计算单位钾矿溶出的可溶性钾的质量来评价其解钾能力 ,结果发现有 93%对钾长石底物有解钾效果 ,其中
以 dk8、dk7、dk14三种菌解钾能力较强 ,其中以 dk8菌株产生速效钾解钾的能力最强 ,在解钾培养基上生长
状况良好.试验结果充分说明在白杨镇磷矿根际土壤中筛选到的解钾菌株中大多数解钾菌分解钾长石矿粉
的能力 ,若再经其在农作物增产效果的进一步研究确认后 ,即可作为制作微生物肥料优先选用菌 ,或添加到
经发酵降解的有机基质(如桐籽饼粕粗蛋白降解物)中[ 11] ,制作成为生物有机肥应用到农业生产中去.
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