全 文 ：219※生物工程 食品科学 2010, Vol. 31, No. 13
苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因(dfr)的
克隆及序列分析
祝 婷，李成磊，吴 琦﹡，蒙 华，陈 惠，邵继荣
(四川农业大学生命科学与理学院，四川 雅安 625014)
摘 要：采用同源基因克隆的方法，以苦荞和甜荞叶片为材料，提取总RNA，经RT-PCR扩增获得其二氢黄酮
醇 4-还原酶基因(dfr)cDNA序列，并通过T载体克隆后测序。序列分析表明，获得了苦荞和甜荞 dfr的全长 cDNA
编码序列，其 1026bp的全长开放阅读框(ORF)均编码 341个氨基酸，并具典型的 dfr结构特征和功能模块。同源性
分析显示，苦荞和甜荞与其他植物的 dfr基因核苷酸相似性为 71%～98%；根据氨基酸序列构建系统进化树表明，
二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。
关键词：苦荞；甜荞；二氢黄酮醇 4 - 还原酶基因；克隆；序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Dihydroflavonol 4-Reductase Genes from Tartary Buckwheat
and Common Buckwheat
ZHU Ting，LI Cheng-lei，WU Qi*，MENG Hua，CHEN Hui，SHAO Ji-rong
(College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)
Abstract ：The cDNA sequence of dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene was amplified from total RNA from the leaves of
tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) and common buckwheat (Fagopyrum esculentum) by RT-PCR using homology-based
cloning strategy. The amplified fragments were then cloned into T-vector. Sequence analysis indicated that both cDNAs had
open reading frames of 1026 bp in full length, which encoded a polypeptide composed of 341 amino acids with typical structure
characteristics and functional module of DFR enzyme, respectively. The nucleotide similarity of dfr gene among Fagopyrum
tataricum, Fagopyrum esculentum and other plants ranged from 71% to 98%. In addition, the phylogenetic analysis based on amino
acid sequence enconded by dfr gene indicated that both buckwheat varieties, Leguminosae, Moraceae and Rosaceae were classified
into one class.
Key words：Fagopyrum tataricum Gaertn；Fagopyrum esculentum Moench；dihydroflavonol 4-reductase (dfr) gene；
cloning；sequence analysis
中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)13-0219-05
收稿日期：2009-12-29
基金项目：四川省科技厅科技攻关项目(04NG001-015；2006Z08-012)
作者简介：祝婷(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为基因工程。E-mail：wuyutingpeng@126.com
﹡通信作者：吴琦(1973 —)，男，副教授，博士，研究方向为酶工程。E-mail：wuqiwq@yahoo .cn
荞麦是世界上一种重要的杂粮作物，它属于蓼科
(Polygonaceae)、荞麦属(Fagopyrum Mill)双子叶禾谷类
作物，主要栽培种有甜荞(F. esculentum Moench也称
普通荞麦)和苦荞(F. tartaricum (L.) Gaertn又称鞑靼荞麦)[1]。
荞麦的蛋白质含量很高，主要有谷蛋白、水溶性清蛋
白和盐溶性球蛋白等，其质量均优于大米、小麦、高
粱和玉米，尤其是在苦荞中，这 3种蛋白占蛋白质总量
的 50%以上[2 ]。18种氨基酸中，荞麦不仅有人体必需
的 8种氨基酸，更有谷类作物最缺少的赖氨酸[3]。加上
它们均含有丰富的微量元素、维生素、食物纤维和多
种矿物质以及芦丁等生物类黄酮，可起到降低血液胆固
醇、治疗高血压、控制糖尿病和微血管脆弱引起的出
血病、防治便秘、延缓衰老等作用[ 4 -5 ]，被誉为新型的
绿色保健食品。目前在开发利用方面已有生物类黄酮
散、生物类黄酮软膏、生物类黄酮胶囊、生物类黄酮
牙膏以及生物类黄酮口香糖等产品。随着人们膳食结构
的不断改善，以荞麦特别是苦荞为原料的系列保健长寿
食品将在人们生活中起到重要的作用。
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二氢黄酮醇 4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，
DFR)是花色素苷和原花色素生化合成途径中的关键酶。
1985年，O’Reilly等[6]采用转座子标签法首次从玉米
和金鱼草中分离了 d fr 基因。随后，B eld 等[ 7]以金鱼
草 DFR 基因为探针获得了矮牵牛 dfr 基因。至今人们
从多种植物如拟南芥、西红柿、玫瑰、葡萄、水稻、
百合等分离出了 d f r 基因。原花色素 ( o l i g o m e r i c
proanthocyanidins，OPCs)为多羟基酚类化合物，衍生
于黄烷类化合物，属生物类黄酮，具有独特的化学和
药理活性。本研究以苦荞和甜荞为材料，采用 RT-PCR
技术克隆其 dfr基因的 cDNA序列，对了解荞麦花色素
苷和原花色素生化合成途径及荞麦主要活性成分代谢的
分子机制和在药用次生代谢产物代谢过程中的作用有重
要的意义，以期为发展花色基因工程和开发新型药物提
供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞和甜荞种子购于四川阿坝农户，种植于四川农
业大学生物系实验基地。经邵继荣教授鉴定，二者分
别是圆粒苦荞和太平甜荞。
R N A o u t 试剂盒 天泽基因工程有限公司；
RevertAidTM First Strand cDNA合成试剂盒 Fermentas公
司；2× Taq PCR Master Mix 北京 TIANGEN生物公
司；无菌去离子水 实验室自制；Gel Extraction Kit
Omega公司；pMD19-T simple Vector 宝生物工程(大连)
有限公司。
1.2 仪器与设备
Thermo MicroLite RF 220/240高速冷冻离心机 美国
热电公司；MyCyclerTM Thermal Cycler PCR仪、S.N.76S
凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司；DYY-Ⅲ -68型稳
压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂；DNP-9272型电热恒
温培养箱 上海精宏试验设备有限公司。
1.3 总RNA提取及 dfr基因 cDNA的克隆
采用植物RNAout试剂盒提取荞麦叶片的总RNA，电
泳检测。采用RevertAidTM First Strand cDNA合成试剂
盒进行RT-PCR合成 cDNA，反转录反应体系总体积为
20μL，含总RNA 4μL、Oligo-dTPrimer(0.5μg/μL)
1μL、DEPC H2O 7μL、5× reaction buffer 4μL、
RiboLockTM Riobonuclease Inhibitor 1μL和10mmol/L dNTP
mix 2μL，最后加入 1μL Revert AidTM M-MuLV Re-
verse Transcriptase。反应条件：42℃ 60min将mRNA
反转录为 cDNA第一链，70℃ 10min热灭活反转录酶，
将合成产物保存于－ 80℃冰箱备用。
以合成的 cDNA为模板进行 dfr基因 cDNA全长克
隆。参照NCBI登录的金荞麦(Fagopyrum cymosum)dfr
基因(EF522145)全长的 5端和 3端UTR序列设计一对引
物，上游引物 5-CTTTTCTCACCAAAACGACG-3，下
游引物 5-TTCTCACAAAAGTAAAACTAATCAA-3, 由
上海英骏生物公司合成。PCR反应体系总体积为 25μL，
含 2× Taq PCR Master Mix 12.5μL，10mmol/L 引物各
1μL，DNA模板 1μL和无菌去离子水 9.5μL。PCR反
应条件：94℃预变性 5min，94℃变性 50s、55℃退火
50s、72℃延伸 90s、35个循环，72℃延伸 10min。
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，采用Gel Extrac-
tion Kit回收后，与 pMD19-T simple Vector连接，转化
大肠杆菌，筛选阳性克隆，穿刺管培养后，送北京诺
赛基因公司测序。
1.4 dfr基因的序列分析
将测序结果拼接后，在GenBank进行生物信息学分
析。应用DNAMAN软件对推导的氨基酸序列进行多序
列比对，并构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 荞麦总RNA的提取
提取的总RNA的电泳检测结果见图 1。图 1中各泳
道可清晰观察到 28S RNA、18S RNA和mRNA 3条区
带，且 28S RNA和 18S RNA两者比例符合 2:1的特点，
表明提取的 R N A 较为完整，质量较高，可用于 R T -
P C R。
2.2 dfr基因的扩增及序列分析
1～3 .苦荞；4～6 .甜荞。
图 1 荞麦总 RNA的电泳检测
Fig.1 Electrophoresis patterns of total RNA from tartary buckwheat
and common buckwheat
1 2 3 4 5 6
28S RNA
18S RNA
mRNA
1、2 .甜荞；3、4 .苦荞；M. M arke r Ⅲ。
图 2 dfr基因全长 cDNA PCR扩增产物
Fig.2 Full length PCR amplification products of dfr genes from tartary
buckwheat and common buckwheat
1 2 3 4 M
4500bp
3000bp
2000bp
1200bp
800bp
500bp
200bp
221※生物工程 食品科学 2010, Vol. 31, No. 13
将苦荞和甜荞的总 RNA反转录成 cDNA后，再经
PCR扩增，均得到约 1200bp的特异性条带，结果见图
2。序列分析表明，苦荞 d f r 基因的 c D N A 长度为
1185bp，包含 1026bp的完整开放阅读框(ORF)，在NCBI
Genebank的登录号为GU169468, 将该序列命名为 Ftdfr；
甜荞 dfr基因的 cDNA长度为 1192bp，包含 1026bp的完
整开放阅读框(ORF)，在 NCBI Genebank的登录号为
GU169469，将该序列命名为 Fedfr。Ftdfr和 Fedfr均编
码一个含 341氨基酸残基的蛋白质(图 3)。经在线蛋白质
分析服务器(http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam)分析
表明，Ftdfr相对分子质量为 38.53，推测的等电点(pI)
为 5.78；Fedfr相对分子质量为 38.55，推测的等电点(pI)
为 5.60。此外，在 Ftdfr和 Fedfr起始密码子ATG附近
存在CCATGG序列，与参与真核生物翻译起始的Kozak
保守序列(A/GXXATGG)一致。
种名 登录号 同源性 /%
金荞麦(Fagopyrum cymosum) EF522145 98
甜荞(Fagopyrum esculentum) GU169469 96
水蓼(Persicaria hydropiper) AB070932 81
单籽山楂(Crataegus monogyna) AY786995 74
苹果(Malus x domestica) AY227728 74
西洋梨(Pyrus communis) AY227730 74
美洲商路(Phytolacca americana) AB128768 73
瞿麦(Gypsophila elegans) AY256381 73
菠菜(Spinacia oleracea) AB109016 72
苜蓿(Medicago truncatula) AY389346 71
表 1 Ftdfr与其他植物 dfr基因的同源性比较
Table 1 Homologous comparison of nucleotide sequences among dfr
genes from tartary buckwheat and other plant species
2.3 植物 dfr的序列比对与进化分析
在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站对Ftdfr进
行Blastn比对分析，结果表明该基因的核苷酸序列与其
他植物的 dfr基因的相似性较高，与金荞麦(Fagopyrum
c y m os um )、甜荞(Fagopy r um e s c u le n tum )、水蓼
(P e r s i c a r i a h y d r op i p e r )、单籽山楂( C r a ta e g u s
monogyna)、苹果(Malus x domestica)、西洋梨(Pyrus
communis)、美洲商路(Phytolacca americana)、瞿麦
(Gypsophila elegans)、菠菜(Spinacia oleracea)和苜蓿
(Medicago truncatula)等的 dfr基因相似性均在 71%～
98%之间，其中与金荞麦相似性最高，为 98%(表 1)。
以苦荞ORF序列推导的蛋白质序列进行BLASTp分
析结果表明，苦荞 dfr基因编码蛋白与其他植物的二氢
黄酮醇 4-还原酶(DFR)有高度同源性，其中与金荞麦 dfr
同源性最高为 98%。利用DNAMAN软件将Ftdfr与Fedfr
推导的氨基酸序列与同源蛋白进行多序列比对(图 4)，发
现在DFR蛋白质序列中存在一个NADP(H)结合保守区域
Ftdfr
Ftdfr
Ftdfr
Ftdfr
Ftdfr
Ftdfr
Ftdfr
Fedfr
Fedfr
Fedfr
Fedfr
Fedfr
Fedfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
Ftdfr
Fedfr
ATG.起始密码子；TGA.终止密码子；Kozak 序列用加粗字体表示。
图 3 Ftdfr与 Fedfr的 cDNA序列及推导的氨基酸序列比较
Fig.3 Comparison of cDNA sequences and deduced amino acid
sequences between dfr genes from tartary buckwheat and common
buckwheat
2010, Vol. 31, No. 13 食品科学 ※生物工程222
图 5 不同植物 DFR氨基酸序列的进化树
Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence encoded by dfr
gene in different plant species
果见图 5。结果表明这些植物共聚为 3大类，蓼科的苦
荞、甜荞和金荞，豆科的苜蓿和黄豆，桑科的啤酒花，
蔷薇科的苹果、单籽山楂和西洋梨聚为一类，商路科的
美洲商路，藜科的菠菜，石竹科的瞿麦和石竹聚为一
类，十字花科的拟南芥和玄参科的金鱼草为另一类。其
中，苦荞与金荞麦的同源关系最近，其次是甜荞。
3 讨 论
3.1 二氢黄酮醇 4-还原酶(DFR)是花色素苷生化合成途
径中的关键酶，是一个重要的调控点。它催化二氢黄
酮醇在C4位发生立体特异的还原反应[8]，继而在花色素
苷合成酶(anthocyanin synthase，ANS)和类黄酮 3-O-糖
基转移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT)的作
用下合成各种花色素苷[9]。因此，DFR 是将二氢黄酮醇
转变为花色素苷反应的第一个酶，这一反应需要NADP
(H)。在不同的物种中，DFR 与 NADP(H)的结合区域
“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”是高度保守的[10]。不
同物种的DFR对底物选择性和表达水平的不同促使不同
花色素的合成。关于底物选择特异性的分子机制，早
期的研究者提出了一个 26个氨基酸的底物特异选择的结
构域[7]，DFR对不同底物的结合是由其分子中底物结合
区的氨基酸序列所决定，这个序列在不同物种中也是高
度保守的[11]。该结合区 132 位与 141 位的氨基酸可直接
影响酶的底物特异性，大多数物种在 132 位含有D(天冬
金鱼草 Antirrhinum majus(X15536)
苷蓿 Medicago truncatula(AY389346)
黄豆 Glycine max(AF167556)
甜荞 Fagopyrum esculertum(GU169469)
苦荞 Fagopyrum tataricum(GU169468)
金荞 Fagopyrum cymosum(EF522145)
拟南芥Arabidopsis thaliana(NP_199094)
美洲商路Phytolacca americana(AB128768)
菠菜Spinacia oleracea(AB109016)
瞿麦Gypsophila elegans(AY256381)
石竹Dianthus gratianopolitanus(AF291097)
啤酒花Humulus lupulus(AB290349)
单籽山楂Crataegus monogyna(AY786995)
西洋梨 Pyrus communis(AY227730)
苹果Malus×domestica(AY227728)
0.1
422
1000
1000
705
917
956
627
512
687
1000
1000
579
VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY，还存在一个底物特异
性结合保守区域 T V N V E E K Q K P V Y D E T C W S D V
DFCRRV。比对结果表明二者与金荞麦、苹果、美洲
商路、石竹、拟南芥等在 DFR 蛋白氨基酸序列系统进
化上有高度保守性。
基于 Ftdfr和 Fedfr氨基酸序列构建系统进化树，结
NADP(H)结合保守区域用虚线表示，底物特异性结合保守区域用粗下划线表示。
图 4 FtDFR和 FeDFR与其他植物 DFR的氨基酸序列比对
Fig.4 Amino acid sequence alignment among dfrgenes from tartary buckwheat and common buckwheat and other plant species
223※生物工程 食品科学 2010, Vol. 31, No. 13
氨酸)或N(天冬酞胺)，分别被称为Asp型DFR和Asn型
DFR；还有一类DFR的第 132位氨基酸残基既不是天冬
氨酸也不是天冬酰胺，因此被称为非Asn/Asp型DFR[12]。
在植物中 Asn型 DFR分布广泛，单子叶植物都是Asn
型 DFR，而 Asp型 DFR 只分布在部分双子叶植物中。
此外，只有少数植物含有非Asn/Asp型 DFR [13]，并且
在进化上分布较远，由此推测 Asp型和非 Asn/Asp型
DFR有可能是由Asn型DFR进化而来。本研究中苦荞和
甜荞均属双子叶植物，而且DFR氨基酸序列的 132位为
N，则推测其为Asn型 DFR，且具有底物选择特异性。
3.2 金荞与甜荞和苦荞之间的亲缘关系是荞麦属种间亲
缘关系争论的焦点。Steward[14]、Suvorova等[15]和王莉
花等[16]认为金荞与甜荞之间的亲缘关系比与苦荞的亲缘
关系近。Kishima等[17]、Sharma等[18]和赵佐成等[19]认为
金荞与苦荞的亲缘关系比与甜荞的亲缘关系近。这可能
是由于各学者所采用的材料不同或者是野生种不同种群
间遗传差异等造成。本研究通过比较不同植物DFR氨基
酸序列构建的系统进化树表明金荞和苦荞的亲缘关系与
金荞和甜荞的亲缘关系相比较更近。可见，分析同源
蛋白的结构对研究种属和种间差异也具有重要意义。
3.3 dfr基因已在多种植物中得到分离，其分子特征和
调控机制也得到了深入研究，发现它通常是单基因和小
基因家族[8]。已报道的 dfr基因为单基因的植物有拟南
芥[20]和金鱼草[21]等。植物基因启动子是重要的顺式作用
元件，位于结构基因 5′端上游，指导酶与模板的正确
结合，活化 RNA 聚合酶，决定转录起始部位和转录效
率，影响基因的表达。本研究在首次克隆苦荞和甜荞
中 dfr基因的全长 cDNA编码序列的基础上，拟进一步
对其启动子和基因表达调控等进行深入研究。
由于荞麦含有独特生物活性成分，具有较高的营养
价值和药用价值，荞麦制品正日益受到人们的青睐[22]。
我国荞麦资源丰富，利用生物技术扩展对 dfr的研究对
于黄酮代谢途径工程的研究和保健食品等的开发具有重
要作用。
参 考 文 献 ：
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