全 文 ：〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1401
世界科学技术—中医药现代化★中药材DNA条形码鉴定研究
　　　收稿日期：2016-07-28
　　　修回日期：2016-08-10
＊　　 广东省中医院院内专项（2015KT1817）：岭南中草药 DNA条形码分子鉴定和生态适宜性研究，负责人：黄志海。
＊＊　 通讯作者：徐江，助理研究员，主要研究方向：中药分子生物学研究；黄志海，主任药师，主要研究方向：中药资源与中药鉴定研究。
耳草属 Hedyotis隶属于茜草科 Rubioideae，主要
分布于热带和亚热带地区，少数分布至温带。《中国
植物志》记载耳草属植物主要分布于长江以南各省
区，其中以广东省居多 [1]。耳草属植物在岭南民间
多作为中草药来防病治病。据统计，在广东地区药
用耳草属植物约有 20 种 [2]，其中白花蛇舌草、伞房
花耳草、金草、牛白藤、双花耳草、长节耳草、金毛耳
草等分布较广，使用较多 [2-4]。近年来，已有多种耳
草属药材开发成制剂，其中，白花蛇舌草注射液已
推广到国内多个厂家生产 [5]，金毛耳草是肠炎宁制
剂的主药 [1]。
由于中药材市场的混乱以及民间使用习惯、一
药多名、异药同名等原因，造成中药材品种混乱。同
时因药材形态特征有限，尤其是同属药材，难以从外
观上准确快速鉴定，造成严重的混伪品误用现象。如：
市售白花蛇舌草伪品主要来源于伞房花耳草及纤花
耳草，个别地区甚至把伞房花耳草直接作为白花蛇
舌草来使用 [4，5]。因此正确鉴定同属植物有利于确
保临床用药的安全有效。
DNA条形码技术是近年来生物分类及鉴定的
研究热点 [6]。2010 年，Chen等 [7]发现 ITS2序列在
物种水平的鉴定效率高达 92.7%，适用于中药材等
存在 DNA 降解的材料，并提出把 ITS2 作为药用植
物鉴定的标准条形码序列，现该技术已得到广泛应
用。该序列在种属水平的变异度较大，适用于物种
分类与系统的进化、药材真伪鉴别、药材基原探索
等研究 [8-10]。因此，本文将选用 9种耳草属常用药材，
采用 ITS2序列作为 DNA条形码对其进行鉴定，为
耳草属药材的物种准确及快速鉴定提供分子依据。
1 材料和方法
1.1 材料
实验采集白花蛇舌草、牛白藤、耳草、鼎湖耳草
及伞房花耳草等 5个物种共 51份样本（图 1），材料
经广东省中医院黄志海主任药师鉴定，凭证标本保
存于广东省中医院。此外，从 GenBank数据库中获
得同属物种序列 14条用于物种鉴定分析。样本具
体信息见表 1。
耳草属岭南药材 DNA 分子鉴定研究＊
黄 娟 1，李西文 2，徐 文 1，丘小惠 1，徐 江 2＊＊，黄志海 1＊＊
（1. 广东省中医院第二临床医学院 广州 510006；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）
摘 要：目的：本研究应用 ITS2序列作为 DNA条形码对 9种广东耳草属药材进行鉴定研究。方法：收
集广东耳草属药材样本，通过植物基因组 DNA提取、PCR扩增以及产物的双向测序获得 ITS2序列，所得
序列采用 CodonCode Aligner进行拼接。用 MEGA 6.06进行比对，分析种内和种间遗传距离，并构建系统
进化树。结果：9种耳草属植物 65条序列长度范围为 208-224 bp，共有 92个碱基变异位点，种内遗传距离
（0.002）明显小于种间遗传距离（0.202）。NJ和 ML聚类树结果基本一致，除耳草与金毛耳草关系较近难
以区分外，其余 7个物种种内样本分别聚在一支，表现出单系性。结论：ITS2序列基本能够准确的鉴定广
东耳草属药材，可作为耳草属药材基原植物鉴定的候选条形码序列。
关键词：耳草属 ITS2序列 分子鉴定 DNA条形码
doi：10.11842/wst.2016.08.026　　中图分类号：R282　　文献标识码：A
2016　第十八卷　第八期　★Vol.18 No.8
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1402
1.2 试剂和仪器
DDP305植物基因组 DNA 提取试剂盒（北京天
根生化科技有限公司，批号：P4104）；D 2000 DNA
Marker（日本 TaKaRa 公司，批号：P4219）；Glodview
核酸染料（上海赛百盛基因技术有限公司，批号：
20151209）；Tris-HCl（上海麦克林生化科技有限
公司，批号：T818979）；Tris（美国 sigma 公司，批
号：V900483）；β-巯基乙醇（美国 sigma公司，批号：
M6250）；琼脂（美国 sigma 公司，批号：V900500）；
引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成，
2×Tap PCR Mix酶（北京艾德莱生物科技有限公司，
批号：262451AX）；其余试剂均为分析纯。
Thermal Cycler PCR仪（美国 Applied Biosystems
公司，型号：2720）；电泳仪（北京市六一仪器厂，型
号：DYY-8C）；凝胶成像分析系统（北京君意东方电
泳设备有限公司，型号：JY04S-3C）；小型离心机（德
国 Sigma公司，型号：1-14）；混合仪（北京市大龙兴
创仪器有限公司，型号：MX-RL-E）。
1.3 方法
选取干燥的植物根茎 40 mg 或叶片 30 mg，
用组织研磨仪磨碎，采用植物 DNA 提取试剂盒
提取基因组总 DNA。ITS2 序列扩增采用 ITS2F：
5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS3R：
5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，进行扩增。
PCR 反应体系为 25 μL，包括：2×Taq PCR Mix 酶
12.5 μL，正向、反向引物各 1 μL（2.5 μmol·L-1），模
板 DNA 2.0 μL（约 30-100 ng），加 ddH2O 补 足 至
25 μL。扩增程序：94℃变性 5 min；94℃变性 30 s，
56℃退火 30 s，72℃延伸 45 s（40 个循环）；72℃、
10 min[10]。PCR 扩增产物采用 1.2% 琼脂糖凝胶电
泳进行检测，将清晰、明亮、单一电泳条带所对应的
PCR 产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行
双向测序。
1.4 数据分析
所得序列采用 CodonCode Alinger 6.02 软件进
行校对拼接，去除低质量区并采用基于隐马尔可夫
模型的 HMMer 注释方法去除两端 5.8S 和 28S 区
段，获得完整的 ITS2序列 [12]。利用软件 MEGA 6.06
分析比对，同时基于 K2P 模型进行种内种间遗传
距离分析，构建系统发育 NJ 树（Neighbor-Joining，
NJ）及 ML树（Maximum Likehihood，ML）[13,14]。同
时，利用相似性搜索法 BLAST对序列鉴定能力进行
分析。
2 结果与分析
2.1 ITS2 序列变异分析
应用 MEGA 6.06分析耳草属 9个物种的 65条
ITS2序列特征（表 2），结果发现耳草属物种种内变
异位点较少。牛白藤序列长度均为 217 bp，有 1个
变异位点，为 195位点 A/C突变；耳草序列长度均为
图 1 样本基原植物图
注：a.牛白藤，b.耳草，c.鼎湖耳草，d.伞房花耳草，e.白花蛇舌草。
a
d
b
e
c
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1403
世界科学技术—中医药现代化★中药材DNA条形码鉴定研究
217 bp，种内存在 4个变异位点，分别为 156位点 C/
T 突变、187 位点 C/G 突变、196 位点 A/G 突变、210
位点 A/C突变；鼎湖耳草长度为 207-208 bp，比对后
为 208 bp，有 2 个变异位点，分别为 14 位点碱基 C
的插入 / 缺失、166 位点 A/C 突变；伞房花耳草序列
长度均为 213 bp，有 1 个变异位点，为 121 位 C/T
突变；白花蛇舌草序列长度均为 214 bp，有 1 个变
异位点，为 173 位 G/T 突变；金毛耳草序列长度均
为 215 bp，有 2个变异位点，为 24和 80位点 C/T突
变；金草长度均为 207 bp，有 2个变异位点，分别为
31位点 C/T突变、92位点 A/T突变；双花耳草对比
后序列长度为 221 bp，种内无变异位点；纤花耳草对
比后序列长度为 224 bp，有 3个变异位点，分别为 25
位点 A/C突变、78位点 G/T突变、187位点 C/T突变。
所有序列比对后长度 233 bp，GC 含量为 61.03%-
68.66%，共有 92个碱基变异位点。结果表明，耳草
属物种 ITS2序列种间变异位点较多，易于区分各基
原物种。详见表 2。
表 1 耳草属岭南药材的样本信息
样本编号 基原物种 拉丁学名 采集地或来源 GenBank登录号
1-14 牛白藤 H. hedyotidea 广东肇庆 KU869621-KU869634
15-26 耳草 H. auricularia 广东肇庆 KU869635-KU869644
27-36 鼎湖耳草 H. effusa 广东肇庆 KU869645-KU869654
37-46
47-49
伞房花耳草 H. corymbosa
广东乐昌
广东广州
KU869655-KU869664
KU869665-KU869667
50-51
白花蛇舌草 H. diffusa
广东广州 KU869668-KU869670
52-53 GenBank JQ730817，HQ148836
54-56 金毛耳草 H. chrysotricha GenBank JF699921，JF699920，JF699917
57-59 金草 H. acutangula GenBank HQ148753，HQ148749，JX111197
60-62 双花耳草 H. biflora GenBank HQ148822，JF976479，JF699908
63-65 纤花耳草 H. tenelliflora GenBank EF570990，HQ148763，JF976506
表 2 耳草属岭南药材的 ITS2 序列信息
物种 ITS2序列长度 /bp 变异位点数
平均碱基含量 /%
A C G T
牛白藤 217 1 16.88 37.03 31.34 14.75
耳草 217 4 17.36 37.94 29.64 15.06
鼎湖耳草 207-208 2 18.19 37.06 30.32 14.43
伞房花耳草 213 1 17.37 34.08 30.05 18.50
白花蛇舌草 214 1 17.29 35.98 30.56 16.17
金毛耳草 215 2 16.74 37.67 29.77 15.82
金草 207 2 17.42 36.05 31.45 15.08
双花耳草 221 0 16.40 32.19 28.96 22.45
纤花耳草 224 3 17.42 37.48 29.70 15.40
2016　第十八卷　第八期　★Vol.18 No.8
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2
. 2

遗
传
距
离
分
析
基
于
M
E
G
A
6
.0
6
分
析
得
到
耳
草
属
种
间
及
种
内
K
2P
距
离
。
结
果
显
示
，不
同
物
种
间
的
IT
S2
序
列
变
异
较
大
，
K
2P
距
离
为
0.
01
0-
0.
32
8，
平
均
值
为
0.
20
2，
详
见
表
3。
其
中
，
耳
草
与
金
毛
耳
草
种
间
遗
传
距
离
最
小
，
金
草
与
白
花
蛇
舌
草
种
间
遗
传
距
离
最
大
。
耳
草
属
种
内
K
2P
距
离
较
小
，
为
0.
00
0-
0.
01
6，
计
算
得
均
值
为
0.
00
2。
各
序
列
种
间
变
异
大
于
种
内
变
异
，
说
明
IT
S2
片
段
可
用
于
鉴
别
耳
草
属
类
药
材
。
2
. 3

聚
类
树
分
析
将
正
鸡
纳
树
（
A
Y
53
83
54
、
G
Q
85
21
17
）
设
为
外
来
群
，基
于
K
2P
模
型
构
建
N
J
树
（
图
2）
和
M
L
树
（
图
3）
，
并
去
除
bo
ot
st
ra
p
支
持
率
小
于
50
%
的
分
支
。
结
果
显
示
，
两
种
方
法
构
建
的
聚
类
树
结
果
除
支
持
率
稍
有
差
异
之
外
，
其
余
基
本
一
致
：
鼎
湖
耳
草
、
伞
房
花
耳
草
、
金
草
及
双
花
耳
草
独
聚
一
支
；
耳
草
、金
毛
耳
草
及
牛
白
藤
聚
为
一
支
，白
花
蛇
舌
草
与
纤
花
耳
草
聚
为
一
支
。
进
一
步
分
析
发
现
，耳
草
与
金
毛
耳
草
聚
为
一
支
，表
现
出
及
近
的
亲
缘
关
系
，
说
明
应
用
IT
S2
序
列
构
建
的
聚
类
树
并
不
能
将
两
者
完
全
分
开
。
除
此
之
外
，
表
3
耳
草
属
种
内
及
种
间
平
均
遗
传
距
离
（
x- ±
s）
药
材
牛
白
藤
耳
草
鼎
湖
耳
草
伞
房
花
耳
草
白
花
蛇
舌
草
金
毛
耳
草
金
草
双
花
耳
草
纤
花
耳
草
牛
白
藤
0.
00
0
-
耳
草
0.
06
5±
0.
00
4
0.
00
8±
0.
00
6
-
鼎
湖
耳
草
0.
02
7±
0.
00
4
0.
29
1±
0.
00
6
0.
00
2±
0.
00
3
伞
房
花
耳
草
0.
16
4±
0.
00
3
0.
09
4±
0.
00
5
0.
31
1±
0.
00
3
0.
00
3±
0.
00
3
白
花
蛇
舌
草
0.
14
6±
0.
00
3
0.
14
7±
0.
00
6
0.
32
2±
0.
00
3
0.
21
6±
0.
00
5
0.
00
3±
0.
00
3
金
毛
耳
草
0.
06
6±
0.
00
3
0.
01
3±
0.
00
5
0.
20
6±
0.
10
8
0.
20
1±
0.
00
5
0.
14
9±
0.
00
4
0.
00
3±
0.
00
3
金
草
0.
27
8±
0.
00
1
0.
29
5±
0.
00
7
0.
16
4±
0.
11
1
0.
29
4±
0.
00
4
0.
32
7±
0.
00
4
0.
29
7±
0.
00
6
0.
00
7±
0.
00
6
-
双
花
耳
草
0.
13
5±
0.
00
0
0.
11
8±
0.
00
5
0.
28
9±
0.
01
2
0.
19
0±
0.
00
3
0.
14
9±
0.
00
0
0.
10
7±
0.
00
3
0.
21
4±
0.
12
9
0.
00
0
纤
花
耳
草
0.
12
3±
0.
00
0
0.
11
9±
0.
00
5
0.
27
7±
0.
00
3
0.
19
1±
0.
00
3
0.
09
9±
0.
00
4
0.
12
0±
0.
00
3
0.
22
3±
0.
07
4
0.
13
6±
0.
00
0
0.
00
3±
0.
00
3
其
余
物
种
种
内
样
本
分
别
聚
在
一
支
，表
现
出
单
系
性
，可
进
行
明
显
区
分
。
3
讨
论
本
文
利
用
IT
S2
序
列
对
广
东
耳
草
属
药
材
进
行
鉴
别
，
通
过
对
同
属
内
种
间
及
种
内
遗
传
距
离
比
较
，
结
合
聚
类
树
分
析
发
现
，
耳
草
与
金
毛
耳
草
表
现
出
极
近
的
亲
缘
关
系
，
种
间
遗
传
距
离
较
小
，
仅
为
0.
01
0-
0.
01
6。
分
析
发
现
，金
毛
耳
草
序
列
长
度
为
21
5
bp
，而
耳
草
为
21
7
bp
，两
者
比
对
后
序
列
长
度
为
21
7
bp
，物
种
间
仅
在
85
b
p
存
在
1
个
T
-
C
特
异
性
变
异
位
点
。
综
合
实
验
结
果
，
可
通
过
85
b
p
位
点
、
序
列
长
度
及
聚
类
树
分
析
可
将
两
者
进
行
区
分
。
除
此
之
外
，
耳
草
属
药
材
IT
S2
序
列
种
间
变
异
明
显
大
于
种
内
变
异
；
物
种
间
最
小
种
间
遗
传
距
离
均
远
小
于
最
大
种
内
遗
传
距
离
，
存
在
明
显
的
条
形
码
间
隔
；
各
物
种
种
内
样
本
分
别
聚
在
一
支
，
表
现
出
单
系
性
。
这
些
结
果
显
示
，
IT
S2
基
本
可
用
于
耳
草
属
植
物
的
鉴
定
。
广
东
耳
草
属
中
应
用
最
为
广
泛
的
药
材
为
白
花
蛇
舌
草
，
该
药
市
场
需
求
量
较
大
，
同
时
混
伪
品
也
较
多
。
闫
嵩
等
[5
]
基
于
IT
S
2
序
列
检
测
市
售
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1405
世界科学技术—中医药现代化★中药材DNA条形码鉴定研究
药材白花蛇舌草，发现伪品主要是伞房花耳草及其
他不同属物种，且正品与伪品间容易区分。本文利用
MEGA 6.06软件分析该药材同属混伪品植物伞房花
耳草及纤花耳草，发现白花蛇舌草与伞房花耳草种内
均只有一个变异位点，而两种药材间变异位点有 40
个；纤花耳草种内变异位点有 3个，与白花蛇舌草比
对后有 25个变异位点。该结果进一步说明 ITS2序
列能够对白花蛇舌草药材混伪品进行准确的鉴定。
综上，本文选用 ITS2 序列作为 DNA 条形码鉴
别耳草属药材，突破了依靠经验及受植物形态、生
长年限和药用部位等影响的传统鉴定方法，具有准
确可靠、稳定性高、操作简便的优势，基本适用于耳
草属药材的鉴别。鉴于个别物种间差异较小，可选
取其他 DNA 条形码序列，如 psbA-trnH、rbcl、matk
等基因序列进行进一步的鉴定，为临床用药提供准
确可靠的鉴定依据及手段。
图 2 基于 ITS2 序列的 9 种耳草属药材的 NJ 树
2016　第十八卷　第八期　★Vol.18 No.8
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1406
1 常颖 . 广东耳草属分类学研究 . 郑州 : 河南农业大学硕士学位论文 ,
2012: 3-4.
2 王 发 国 , 叶 华 谷 . 广 东 省 耳 草 属 药 用 植 物 资 源 . 中 药 材 , 2003,
26(8): 547-548.
3 张秋燕 , 张福平 . 粤东地区茜草科药用植物资源研究 . 中医药临床
杂志 , 2015, 27(6): 857-861.
4 袁青梅 , 张发广 , 王兴 , 等 . 我国耳草属植物的种类与分布 . 云南
大学学报 ( 自然科学版 ), 2004, 26(S1): 166-170.
5 闫嵩 , 任伟超 , 郑希龙 , 等 . 市售白花蛇舌草药材的 DNA 条形码鉴
定研究 . 中国现代中药 , 2015, 17(10): 1014-1019.
6 Hebert P D, Ratnasingham S, deWaard J R, et al. Barcoding animal
life: Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related
参考文献
图 3 基于 ITS2 序列的 9 种耳草属药材 ML 树
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1407
世界科学技术—中医药现代化★中药材DNA条形码鉴定研究
Molecular Identification of Hedyotis Medicinal Plants in Guangdong Province Using DNA Barcode
Huang Juan1, Li Xiwen1, Xu Wen1, Qiu Xiaohui1, Xu Jiang2, Huang Zhihai1
(1. Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Institute of Chinese Material Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)
Abstract: ITS2 sequence was taken as a DNA barcode to identify Hedyotis medicinal plants in Guangdong
Province. Samples from Hedyotis were collected and the ITS2 regions were amplified and sequenced. The
sequences were assembled by CodonCode Aligner and analyzed by MEGA 6.06. The Kimura 2-Parameter (K2P)
distances were computed, while the phylogenetic tree was built using the neighbor-joining (NJ) and test maximum
likelihood (ML) models. It was found that the length of ITS2 region varied from 208-224 bp with 92 variable
sites. The intraspecific distance (0.002) was much shorter than the interspecific distance (0.202). The outputs of
NJ tree chimed with that of ML tree. Apart from the indistinguishability between Hedyotis and H. chrysotricha in
the NJ and ML trees, the other samples of the seven species were clustered to one branch respectively, featuring
monophyly. In conclusion, the ITS2 sequence provided the molecular evidence behind the identification of the
nine species of Hedyotis medicinal plants in Guangdong Province and could be treated as an ideal DNA barcode
for identifying species of Hedyotis medicinal materials.
Keywords: Hedyotis, ITS2, molecular identification, DNA barcode
（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）
species. Proc Biol Sci, 2003(270): 96-99.
7 Chen S, Yao H, Han J, et al. Validation of the ITS2 region as a novel
DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One,
2010, 5(1): e8613.
8 Yao H, Song J, Liu C, et al. Use of ITS2 region as the universal DNA
barcode for plants and animals. PLoS One, 2010, 5(10): e13102.
9 陈士林 . 中国药典中药材 DNA 条形码标准序列 . 北京 : 科学出版社 ,
2015: 6-14.
10 Gao T, Yao H, Song J, et al. Identification of medicinal plants
in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2. J
Ethnopharmacol, 2010, 130(1): 116-121.
11 陈士林 , 姚辉 , 韩建萍 , 等 . 中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原
则 . 中国中药杂志 , 2013, 38(2): 141-147.
12 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and
HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430 (1-2): 50-57.
13 Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very larger
phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc Natl Acad Sci
USA, 2004, 101(30): 11030-11035.
14 Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al . MEGA5: Molecular
evolutionary genetics analysis using maximum likelihyood, evolutionary
distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011,
28(10): 2731-2739.