全 文 ：新疆中医药 2008年 第26卷 第3期(总第115期)
地耳草又名田基黄,为藤黄科植物地耳草Hypericum
japonicumThunb.的全草,具清热利湿、解毒消肿之功效,主治
湿热黄疸、泄泻、痢疾、疮疖痈肿、急性肾炎、血吸虫病等,其
注射液已广泛用于临床,治疗急、慢性肝炎,效果均显著。现
代药理研究表明,地耳草具有增强免疫和抗肿瘤的作用。地
耳草药用广大,商品药材中时常出现混伪品,正确鉴定地耳
草是确保临床用药安全、有效的关键。色谱指纹谱技术是国
际公认的有效控制中药或天然产物内在质量的关键技术。目
前已成为中药质量评价的重要手段之一。本实验采用高效液
相色谱法对地耳草及其混伪品细叶金丝桃指纹图谱鉴定进
行了初步探讨,以期为地耳草药材鉴别和质量控制提供一些
依据。
1 仪器与试药
Water510高效液相色谱仪,DAD检测器,Empower工作
站;ShimadzuAY220电子天平;KQ-500B型超声波清洗器(昆
山市超声仪器有限公司)。
甲醇(江苏汉邦科技有限公司,色谱纯);0.4%磷酸(实
验室制备);水(重蒸去离子水);其余所用试剂均为分析纯。
槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号
10081-200406)。地耳草药材购自或取自南中医药大药材标
本馆(S-1)、南中医药大国医堂(S-2、3)、南中医药大百草堂
(S-4、5)、江苏省中医院药房(S-6、7)、江苏省中医学会门诊
部(S-8、9)或江苏省中医院中药库房(S-10),共10份样品,经
笔者鉴定为藤黄科植物地耳草HypericumjaponicumThunb的
全草;地耳草混伪品由江苏省中医院中药库房提供,经鉴定为
同种植物细叶金丝桃HypericumgramineumG的全草。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:汉邦KromasilC18分析柱(250mm×4.6mm,5!m);
流动相:A(甲醇),B(0.4%磷酸);梯度洗脱条件:0→20min,A
(%)10→30,B(%)90→70,20→45min,A(%)30→45,B(%)
70→55,45→70min,A(%)45→45,B(%)55→55;流量:
0.9mL/min;柱温:30℃;检测波长:320nm;参比波长360nm;
分析时间:70min;进样量:10!L。
2.2 供试品的制备
精密称取药材粗粉1.0g(过40目筛),准确加入70%甲醇
50mL,称重,超声40min(超声功率250W,频率50kHz)。放冷,
称重后,用70%甲醇补足减失的重量。摇匀、过滤,精密移取
30mL续滤液,加入25%盐酸15mL水浴回流水解60min,快速冷
却,定容至50mL,摇匀,离心(10000r/min)10min,取上清液
用微孔滤膜(孔径为0.45!m)滤过,滤液作为供试品液。
2.3 对照品的制备
精密称定槲皮素对照品适量,加70%甲醇制成60!g/
mL溶液,作为对照品液。
2.4 方法学考察
以南中医药大药材标本馆的地耳草为样品,对其稳定
性、仪器精密度、实验方法重现性作了相应考察。
2.4.1 稳定性试验 取同一份供试品溶液,分别在0、1、2、4、
8、10、12、24、36、48进行检测,考察色谱峰相对保留时间的一
致性,各主要色谱峰相对保留时间的RSD%为0.8%~4%。经证
明样品在10h内较为稳定。
2.4.2 精密度试验 取同一份供试品溶液,连续进样5次,考
察色谱峰相对保留时间的一致性、各色谱峰相对保留时间的
RSD%均低于3%。
2.4.3 重现性试验 取同一批号的供试品5份,同法检测,考
察色谱峰相对保留时间的一致性,以保留时间为58min的槲
皮素峰为对照,各色谱峰相对保留时间RSD%均低于3%。
2.5 指纹图谱建立
精密吸取对照品与供试品溶液各10!L,注入高效液相
色谱仪,按选定的色谱条件,进行检测。同一实验条件下,测
定所有供试品HPLC色谱图。根据不同批次供试品测定结果
给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关参
数,进行分析比较,制定优化的指纹图谱。
2.6 指纹图谱分析
2.6.1 共有指纹峰的标定
经与对照品对照以及比较所有测定和记录的色谱图,
地耳草标定10个共有峰作为指纹图谱的特征峰,细叶金丝桃
标定9个共有指纹特征峰。与槲皮素对照峰相比,地耳草各共
有峰的相对保留时间和相对峰面积见表1,表2;细叶金丝桃
其他8个共有指纹峰相对保留时间依次为:0.0442、0.3388、
地耳草的HPLC指纹谱鉴定研究
李仕海1,刘训红2,韩 乐2,茆春利2
(1.江苏省滨海县中医医院,江苏 滨海 224500; 2.南京中医药大学,江苏 南京 210029)
摘 要 目的:建立地耳草HPLC指纹图谱鉴定方法。方法:用RP-HPLC法,梯度洗脱,测定地耳草及其混伪品
细叶金丝桃的指纹图谱,并作相似度比较分析。结果:地耳草不同样品指纹图谱相似度较好,而地耳草与细叶金丝
桃的指纹图谱具有一定差异。结论:HPLC指纹图谱具有重现性好、特征性强、方法简便等特点,可用于地耳草药材
的鉴别。
关键词 地耳草;细叶金丝桃;指纹图谱;高效液相色谱法
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新疆中医药 2008年 第26卷 第3期(总第115期)
S-1 S-2 S-3 S-4 S-5 S-6 S-7 S-8 S-9
S-1 1 0.996 0.966 0.965 0.895 0.867 0.908 0.924 0.910
S-2 0.996 1 0.969 0.965 0.902 0.876 0.915 0.927 0.920
S-3 0.966 0.969 1 0.982 0.957 0.928 0.947 0.943 0.936
S-4 0.965 0.965 0.982 1 0.966 0.944 0.973 0.975 0.977
S-5 0.895 0.902 0.957 0.966 1 0.990 0.972 0.961 0.965
S-6 0.867 0.876 0.948 0.944 0.990 1 0.957 0.928 0.934
S-7 0.908 0.915 0.947 0.973 0.972 0.957 1 0.989 0.990
S-8 0.924 0.927 0.943 0.975 0.961 0.928 0.989 1 0.996
R 0.959 0.969 0.979 0.994 0.975 0.953 0.986 0.989 0.992
S-9 0.910 0.920 0.936 0.977 0.965 0.934 0.990 0.996 1
S-10 0.965 0.957 0.929 0.931 0.854 0.826 0.861 0.883 0.892
S-10
0.965
0.957
0.929
0.931
0.854
0.826
0.861
0.883
0.925
0.892
1
R
0.959
0.962
0.979
0.994
0.975
0.953
0.986
0.989
0.992
0.925
1
表3 10个批次地耳草指纹图谱相似度
0.4043、0.5286、0.5396、0.5947、0.7346、0.9101。
2.6.2 地耳草指纹图谱相似度评价 将上述10个批次的地
耳草样品HPLC测试数据导入国家药典委员会“中药指纹图
谱相似度评价系统(2004A)”软件,经校正,将谱峰自动匹配,
然后生成对照谱图,进行谱峰差异性评价和整体相似性评
价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出地耳草样品
HPLC指纹谱共有模式R;与共有模式比较,10个批次地耳草
指纹图谱相似度如表3。
2.6.3 地耳草与细叶金丝桃的指纹图谱比较 从各自的指
纹图谱中,可以直观看出,地耳草与细叶金丝桃的指纹图谱
有些不同,其特征峰数目、相对保留时间、峰面积都有一定差
异。通过中药指纹图谱相似度计算软件分析,与地耳草HPLC
指纹谱共有模式比较,细叶金丝桃相似度仅为0.805。
3 讨 论
3.1 在色谱条件优化过程中,主要考察地耳草的色谱图,经
实验比较,以甲醇与0.4%磷酸为流动相,按上述条件进行梯
度洗脱,地耳草样品中各色谱峰分离效果较好;采用DAD检
测器对检测波长进行考察,结果在320nm波长下,地耳草色谱
图中色谱峰较多,信息丰富,故选择320nm为检测波长。
3.2 相似度分析结果表明,地耳草不同样品指纹图谱相似
度较好(92.5%~99.2%),而地耳草与细叶金丝桃的指纹图谱
有一定差异,其相似度仅为80.5%。可以看出,进行HPLC指纹
图谱相似度分析是鉴别地耳草药材的一种行之有效的方法。
3.3 本实验对地耳草HPLC指纹图谱的构建进行了初步探
讨,为地耳草药材的品种鉴定和质量评价提供科学依据。
(收稿日期:2007-09-10)
峰号 S-1 S-2 S-3 S-4 S-5 S-6 S-7 S-8 S-9 S-10
1 0.0429 0.0427 0.0426 0.0425 0.0428 0.0428 0.0426 0.0423 0.0423 0.0423
2 0.2798 0.2772 0.2828 0.2777 0.2794 0.2807 0.2799 0.2794 0.2794 0.2807
3 0.3684 0.3658 0.3668 0.3710 0.3677 0.3693 0.3689 0.3677 0.3678 0.3696
4 0.3896 0.3872 0.3881 0.3916 0.3887 0.3907 0.3900 0.3890 0.3894 0.3903
5 0.5172 0.5152 0.5153 0.5189 0.5164 0.5181 0.5177 0.5170 0.5169 0.5177
6 0.5369 0.5353 0.5353 0.5392 0.5367 0.5378 0.5378 0.5369 0.5368 0.5377
7 0.5983 0.5971 0.5968 0.6009 0.5985 0.5989 0.5992 0.5991 0.5982 0.5990
8 0.7163 0.7161 0.7153 0.7019 0.7163 0.7168 0.7173 0.7160 0.7160 0.7167
9 0.9016 0.9011 0.9003 0.9012 0.9007 0.9005 0.9009 0.8996 0.8997 0.9011
10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
表2 地耳草指纹图谱共有峰的相对峰面积
表1 地耳草指纹图谱共有峰的相对保留时间
峰号 S-1 S-2 S-3 S-4 S-5 S-6 S-7 S-8 S-9 S-10
1 0.1765 0.0956 0.1399 0.1209 0.0834 0.0894 0.0396 0.0648 0.0621 0.7865
2 0.0826 0.0900 0.0310 0.0278 0.0576 0.0561 0.0303 0.0300 0.0302 0.1057
3 0.0479 0.0559 0.0703 0.0714 0.0212 0.0179 0.0543 0.0582 0.0595 0.0736
4 0.1481 0.1565 0.0740 0.0756 0.0637 0.0660 0.0721 0.0707 0.0623 0.1621
5 0.1040 0.0982 0.0578 0.0645 0.0745 0.0532 0.0514 0.0605 0.0573 0.1228
6 1.8606 1.7388 1.1793 1.1835 0.8194 0.6699 0.8763 1.1157 1.0396 2.0623
7 0.3342 0.3312 0.1852 0.1860 0.1102 0.1121 0.1694 0.1751 0.1766 0.3764
8 0.4515 0.4399 0.2018 0.1981 0.1590 0.1620 0.1719 0.1751 0.1762 0.4710
9 0.1457 0.1585 0.2798 0.0723 0.2382 0.2636 0.0461 0.0503 0.0472 0.1547
10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
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