全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 2期，第 437-441页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.2, 437-441
研究报告
Research Report
百合(Lilium spp.)杂交后代 ISSR分析亲缘关系
苗美美 赵明明 刘绪明 侯悦 樊金萍 *
东北农业大学园艺学院,哈尔滨, 150030
*通讯作者, fan_xuer2000@aliyun.com
摘 要 本研究采用 ISSR分子标记技术百合的 3个杂交组合[粉美(dark beauty)×精粹(elite)，普瑞特(prato)
×耀眼(cedeazzle)，卷丹(Lilium lancifolium Thumb.)×多安娜(pollyanna)]的亲本及杂交一代(F1)进行遗传关系
的检测，并且应用 NTSYSpc2.0软件对其进行聚类分析，以筛选适合百合 ISSR-PCR反应的最佳体系，并探
讨杂交后代个体与其亲本间的亲缘关系与遗传特性。结果表明：从 100条引物中中筛选出 7条稳定多态的
引物，共得到扩增位点 95个，其中具有多态性共 69个，多态性位点百分率达 72.63％。从聚类图上可以看出
杂交组合粉美×精粹与普瑞特×耀眼总体上先倾向于父本后倾向于母本，而卷丹×多安娜则总体上先倾向于
母本后倾向于父本。
关键词 百合(Lilium spp.), ISSR标记,聚类分析,亲缘关系
Analysis on Genetic Relationships in Lily (Lilium spp.) Hybrids Based on
ISSRMolecular Markers
Miao Meimei Zhao Mingming Liu Xuming Hou Yue Fan Jinping *
Horticulture College, Northeast Agricultural University, Harbin, 150030
* Corresponding author, fan_xuer2000@aliyun.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.000437
Abstract Aiming to establish a optimal ISSR-PCR system for lily and to explore the genetic characteristics and
relationship between the parents and offspring individuals, genetic analysis was conducted among the parents and
F1 hybrids of three hybrid combinations (dark beauty×elite; prato×cedeazzle; Lilium lancifolium Thumb.×poll-yanna)
using ISSR molecular markers and cluster analysis was conducted using NTSYSpc2.0 software. The result showed
that seven stable polymorphic primers were screened out from 100 ISSR primers, and 95 amplification loci were
obtained of which 69 were polymorphic, with polymorphic loci percentage 72.63%. From the clustering figure we
can see that in combinations dark beauty×elite and prato×cedeazzle generally tend to male parent before they tend
to their female parent, while Lilium lancifolium Thumb.×pollyanna generally tend to female parent before they
tend to their male parent.
Keywords Lily (Lilium spp.), ISSR molecular markers, Clustering analysis, Genetic relationship
基金项目：本研究由黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z08259)资助
百合 (Lilium spp.)是百合科 (Liliaceae)百合属
(Lilium)花卉，花大、色艳，是世界著名的切花之一(陈
俊愉和程绪珂, 1989)；百合的新品种培育也一直备受
全球花卉业领域的关注。目前，百合新品种的选育工
作已经在全球花卉市场中获得了可喜的成绩。全球
已经培育出数千个百合新品种，其中美国与荷兰的
成就尤其突出(中国植物志编辑委员会, 1980;王连英,
1988)。生物技术也随着分子生物学的迅猛发展在百
合育种中得到了广泛的应用。
ISSR，即简单重复间序列标记，是一种主要检测
DNA序列差异的分子标记技术。该项新型技术是显
性标记，具有成本低、重复性好、适用性广、多态性高
等众多优点，常用于 DNA序列差异的检测，在种质
资源的研究已被广泛使用。在大豆杂交育种方面已
取得很大进展(赵世杰等, 1998)。刘梦培等(2011)人采
用 ISSR分子标记技术对华仁杏(Armeniaca cathayana
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1 41号引物对粉美×精粹杂交组合样品的 ISSR-PCR扩增
验证
Figure 1 ISSR-PCR amplification verification of Dark beauty ×
Elite combination using the primer 41
多态性位
点比例
Percentage
of polymo-
rphism
0.83
0.83
0.80
0.75
0.60
0.66
0.40
表 1 ISSR引物及其扩增条带分析
Table 1 The ISSR primers and their PCR band analysis
引物编号
Primer
No.
11
25
32
41
55
61
72
引物序列
Primer
sequences
(AC)8GT
(TC)7TG
(AC)8CG
(CTC)4RC
(GGC)6
(AG)8A
(TG)8G
多态性
条带
Polymor-
phism
bands
4
3
5
6
4
3
3
总条带
Scorable
bands
5
5
6
7
5
4
5
多态性位
点比例
Percentage
of polymor-
phism
0.80
0.60
0.83
0.85
0.80
0.75
0.60
多态性
条带
Polymo-
rphism
bands
4
3
3
4
1
2
总条带
Scorable
bands
5
4
4
5
3
3
多态性位
点比例
Percentage
of polymo-
rphism
0.80
0.75
0.75
0.80
0.33
0.66
多态性
条带
Polym-
orphism
bands
45
5
4
3
3
2
2
总条带
Scorable
bands
6
6
5
4
5
3
5
粉美×精粹杂交组合
Dark beauty×Elite combination
卷丹×多安娜杂交组合
Lilium lancifolium Thumb.×
Pollyanna combination
普瑞特×耀眼杂交组合
Prato×Cedeazzle
D.L. Fuetal) 3个杂交组合的亲本及杂交一代(F1)进
行了遗传分析，王天菊等(2011)采用 ISSR分子标记
技术分析 28个花生栽种品种的亲缘关系和 DNA多
态性。周俐宏等(2009)利用 ISSR标记技术分析不同
类型月季的遗传多样性。Miltiadis等(2010)采用 ISSR
分子标记法研究核桃的希腊当地品种和国际种植型
之间的亲缘关系以及遗传多样性，结果表明其间存
在较高的遗传变异性。
本次试验通过 ISSR分子标记技术将经过杂交
获得的 F1代实验材料对其进行亲缘关系分析，弄清
了亲本与后代的亲缘关系远近，为种质创新及百合
遗传多样性研究提供了理论和实践依据。
1结果与分析
1.1百合杂交F1代 ISSR扩增
从 100 条引物中中筛选出稳定多态的 7 条引
物，得到的扩增位点共达 95个，其中具有多态性的
有 69个，多态性位点的百分率达 72% (表 1)。其中
41和 11号引物对三个杂交组合的 ISSR-PCR 扩增
结果如图 1、图 2和图 3。
1.2杂交亲本及后代群体 ISSR分子标记的聚类分析
1.2.1粉美×精粹杂交组合遗传距离与亲缘关系
由树状图可得，以相似系数 0.48为阈值，24份
材料可分为两类，其中第一类群包括母本粉美，第二
类包括父本和所有杂交后代，共 23份材料。表明该
杂交组合 F1代均与父本精粹的遗传关系较近，与母
本的次之(图 4)。
粉美×精粹杂交组合后代中的 22个单株，同母
本“粉美”的遗传相似系数在 0.353~0.530之间，同父
本精粹的遗传相似系数为 0.353~0.618。其中 1号、3
号、11号和 21号子代与父母本的均存在明显差异，
其遗传相似系数仅为 0.353。
由树状图可得，以相似系数 0.49为阈值，22份
供试材料可分为两类，第一类有包括母本在内得两
份供试材料，表明该个体与母本的亲缘关系较近；第
二类共包括父本在内得 20份供试材料，表示这些个
体和父本耀眼的亲缘关系更加亲近(图 5)。
在普瑞特×耀眼杂交组合的所有后代植株中，与
父本耀眼遗传关系最近的是 17号，其遗传相似系数
为 0.700，其次是遗传相似系数为 0.600 的 3 号、7
号、8号、18号以及 20号。同母本“普瑞特”遗传关系
最近的是 9号单株，其遗传相似系数为 0.700 0，表现
明显倾向母本的遗传特性，其次是遗传相似系数为
438
图 4粉美×精粹杂交组合 ISSR标记的 NTSYS聚类分析
Figure 4 The NTSYS cluster analysis of Dark beauty×Elite hybrid
combination by ISSR maker
图 5普瑞特×耀眼杂交组合 ISSR标记的 NTSYS聚类分析
Figure 5 The NTSYS cluster analysis of Prato×Cedeazzle hybrid
combination by ISSR maker
图 2 11号引物对普瑞特×耀眼杂交组合样品的 ISSR-PCR扩
增验证
Figure 2 ISSR-PCR amplification verification of Prato×Cedeazzle
combination using the primer 11
图 3 41号引物对卷丹×多安娜杂交组合样品的 ISSR-PCR扩
增验证
Figure 3 ISSR-PCR amplification verification of Lilium lancifoli-
um Thumb.×Pollyanna combination using the primer 41
0.667的 16号，1号与 2号和母父本之间的遗传差异
性均比较明显，遗传相似系数约是 0.333。
由树状图可得，以相似系数 0.44为阈值，29份供
试材料可分为两类，第一类仅包括父本 1份供试材
料，第二类共有包括母本在内的 28份供试材料(图 6)。
27个杂交子代，22号和 27号与父本多安娜的
遗传关系最近，其相似系数达 0.640，二者的遗传特
性明显表现为倾向于父本；而 11号同父本的遗传相
似系数最小，为 0.200，关系最远，明显呈分离状态。
而同母本卷丹遗传关系最为亲近的是 5号，其遗传
特性明显地倾向于其母本，二者的相似系数是
0.720，其次是 1、7、18、19和 21号，遗传相似系数是
0.640，亲缘关系最远的是遗传相似系数为 0.360的
3号单株。
2讨论
ISSR分子标记技术因其具有较高的多态性水平
及重现性，而且不需要预先克隆与测序等优点，已成
功地被包括植物遗传多样性在内的众多研究领域广
泛应用。利用 ISSR技术对百合进行遗传分析的关键
在于筛选出稳定性好、扩增性强的引物。本研究对百
合基因组 DNA进行 ISSR-PCR，从 100条引物中中
筛选出 7条稳定多态的引物，得到的扩增位点共达
95个，其中具有多态性的有 69个，多态性位点的百分
率达 72.63%，这表明本研究中三个百合杂交组合的
后代及其亲本之间的多态性较高，具有较丰富的遗传
多样性。从聚类图中可以看出三个杂交组合后代与亲
百合(Lilium spp.)杂交后代 ISSR分析亲缘关系
Analysis on Genetic Relationships in Lily (Lilium spp.) Hybrids Based on ISSR Molecular Markers
439
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 6卷丹×多安娜杂交组合 ISSR标记的 NTSYS聚类分析
Figure 6 The NTSYS cluster analysis of Lilium lancifolium
Thumb.×Pollyanna hybrid combination by ISSR maker
本之间的亲缘关系均不同，杂交组合粉美×精粹与普
瑞特×耀眼总体上先倾向于父本后倾向于母本，而卷
丹×多安娜则总体上先倾向于母本后倾向于父本，可
能是在选择亲本时，它们之间的性状差异比较大。
白锦军在对杏种质资源 ISSR标记的遗传多样
性研究中应用 ISSR分子标记与形态学标记探究杏
品种和种间的归类地位以及亲缘关系。本实验如果结
合形态学方面进行研究会更充分一些，本研究只是
首次运用 ISSR技术对百合杂交后代与亲本亲缘关
系分析，获得了亲缘关系树状图，弄清了后代与亲本
之间的亲缘关系。在这一点上比传统的归类手法更
为准确有效，可以为改良由传统归类手法而树立起
来的归类系统奠定了坚实的基础。
3材料与方法
3.1供试材料
供试材料采自东北农业大学园艺站，包括亚洲
百合品种精粹、耀眼、粉美、普瑞特、多安娜以及野生
栽培品种卷丹。
3.2百合基因组 DNA提取
当幼苗经过8个月的生长后长至 10 cm高时取
0.2 g叶片提取百合的 DNA。方法采用 CTAB法(王
关林和方宏筠, 2002)，然后 1.0%琼脂糖电泳检测，
-20℃冰箱保存备用。
3.3 ISSR反应体系的优化及其产物检测
以亚洲百合粉美的 DNA为模版，对模板浓度、
引物浓度、dNTPs浓度、退火温度、Taq DNA聚合酶
浓度以及不同的 PCR反应程序等因素进行筛选并
优化扩增条件，以建立一套最佳的反应体系。
采用 20 μL的 PCR体系，其中 1 μL模板 DNA，
1.5 μL引物(100pmol/L)，2μLdNTPs(20mmol/L)，2μL
10×Buffer (Mg2+)，0.5 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)。
扩增程序采用：94℃预变性 5 min，94℃变性 40 s，
退火温度因引物而异，72℃延伸 1.5 min，循环 37次，
72℃延伸 6 min，最后 4℃条件下保存。在 mastercy-
cler 梯度 PCR 仪上进行 ISSR 扩增产物以 2 000 bp
Ladder Plus Marker为分子量标记，在 2.0%琼脂糖凝
胶上进行电泳并检测。
3.4数据统计
分析遗传距离时，应用 0-1系统记录凝胶图像
的谱带位置，然后把统计所得的 0、1 矩阵图形文
件转换为数据文件并进行分析。系统聚类分析以
及分子进化系统树的构建使用 NTSYSpc2.0 软件
的 UPGMA (毛伟海等, 2006)。
作者贡献
苗美美、樊金萍是本研究的实验设计和实验研究
的执行人，并完成了论文初稿的写作；赵明明、刘绪明
和侯悦参与实验设计，实验结果分析；樊金萍教授是
项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论
文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z08259)
资助。
参考文献
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