全 文 ：分子植物育种，2008年，第6卷，第2期，第291-296页
MolecularPlantBreeding,2008,Vol.6,No.2,291-296
研究报告
ResearchReport
东方百合Siberia多倍体诱导及其细胞学鉴定
池坚 席梦利 张静 胡凤荣 施季森 *
南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,南京,210037
*通讯作者,jshi@njfu.com.cn
摘 要 本文以东方百合Siberia的试管苗为试验材料，研究了预培养时间、秋水仙素处理方法及浓度等因素
对诱导试管苗多倍体的影响。研究结果表明：秋水仙素溶液直接浸泡较共培养法好，且以0.05%的浓度和浸泡
48h为最佳组合，最终获得了18株四倍体试管苗。通过根尖染色体计数确定其为稳定的同源四倍体。显微观测
气孔特征后发现：二倍体与四倍体植株的叶下表皮气孔密度及气孔保卫细胞长、宽差异均达到了极显著水平。
关键词 东方百合Siberia,多倍体诱导,细胞学鉴定
PolyploidyInductionandCytologicalIdentificationinOrientalLilySiberia
ChiJian XiMengliZhangJing HuFengrong ShiJisen*
KeyLaboratoryofForestGenetics&Biotechnology,NanjingForestryUniversity,MinistryofEducation,Nanjing,210037
*Corespondingauthor,jshi@njfu.com.cn
Abstract Inthepaper,wereportedtheresultsonpolyploidyinductionbycolchicinetreatmentsandcytological
identificationinorientallily.UsingplantletsoforientallilySiberiaasmaterials,theefectfactorsincluding
pre-culturehoursandconcentrationofcolchicineonpolyploidyinductionwereinvestigatedrespectively.There-
sultsindicatedthatthebestinductionconcentrationofcolchicinemightbe0.05%,andthemostsuitabletreatment
timemightbe48hbymarinatingway.Wegot18tetrapliodsinalbyusingtheabovementionedcombinationof
treatment.Chromosomenumberbymicroscopiccountingconfirmedthatthetetrapliodswegotshouldbestablete-
traploids.Andalsowefoundthattherearethesignificantdiferencesonleavestomataldensityandguardcelsize
(lengthandwidth)betweendiploidsandtetraploidsbasedonthecytologicalidentifications.
Keywords LiliumorientalSiberia,Polyploidyinduction,Cytologicalidentification
多倍体育种是百合种质创新的重要途径。研究
表明，多倍体百合具有植株健壮、抗性增强、鳞片肥
厚、高产优质等特点。1997年，荷兰的植物育种及繁
殖研究中心应用多倍体诱导得到了一系列杂种百合
(vanTuyl,1997)。我国有关百合多倍体育种的工作多
集中在离体条件下利用秋水仙素溶液处理百合鳞茎
来获得多倍体。连雪斌(1995)以及刘选明等(1996)利
用秋水仙素诱导得到兰州百合和龙牙百合四倍体植
株；张兴翠等(2003)诱导得到药用百合多倍体植株；
郑思乡等(2004a)也曾通过体细胞加倍的方法获得了
百合多倍体;后来郑思乡等(2005a)又用秋水仙素处
理获得了2n雌配子；还有何林等(2006)用秋水仙素
基金项目：本研究由上海市重点攻关项目(沪农科攻字2003,第2-3-1号;沪农科攻字2006,第4-1号)资助
处理东方百合 Tiber的鳞茎获得了多倍体植株。
Siberia隶属于东方百合杂种系，花色纯白，气味芳
香，是我国栽培的主要切花品种。有关Siberia多倍
体诱导的研究未见报道。本研究以其试管苗为材料，
研究了预培养时间、秋水仙素处理方法及浓度等因
素对诱导试管苗加倍的影响，旨在为东方百合
Siberia的多倍体育种提供技术基础。
1材料与方法
1.1材料
本研究以东方百合(Liliumorientalhybrids)栽培
品种西伯利亚(Siberia)的试管苗作为试验材料。该品
种由上海振东园艺有限公司从荷兰进口。
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
1.2多倍体的诱导
共培养(培养基中添加秋水仙素)：将预培养0d、
7d、13d和 15d的试管苗鳞片接种到添加有 0.1%
和0.2%秋水仙素溶液的芽诱导培养基 (MS+6-BA
1.0mg/L+NAA0.5mg/L)中培养，30d后切取新生小
芽，转入正常壮苗及生根培养基，培养成苗待检测。
直接浸泡：将鳞片浸泡在浓度分别为 0.01%、
0.02%、0.05%、0.1%和0.5%的秋水仙素溶液中分别
浸泡24h、48h和72h。用无菌水清洗后接种到芽诱
导培养基上培养。不定芽长出后切取新生芽转入壮
苗及生根培养基，培养成苗待检测。
1.3多倍体的鉴定
以诱导后出现表型变异的新生芽作为多倍体的
初筛群体。鉴定方法采用根尖染色体计数并结合气
孔特征进行。
染色体鉴定：切取根尖观察10个具有分裂相的
细胞，多倍性细胞达8个以上者视为多倍体，多倍性
细胞为1~7个视为嵌合体，0个视为二倍体。
气孔鉴定：取相同培养状态下的二倍体、四倍体
组培苗的展开叶片50片，撕取叶片下表皮制片，然
后显微观察测量气孔大小及密度。
2结果与分析
2.1在培养基中添加秋水仙素
组培苗鳞片在预培养0d、7d、13d和15d后，
接种在添加了不同浓度秋水仙素溶液的培养基上，
对照7d后鳞片基部陆续产生淡黄色的芽点，处理
13d后鳞片基部开始出现芽点，芽点进一步发育成
为肉眼可见的不定芽。观察统计后发现，预培养7d
的鳞片在秋水仙素浓度为0.1%和0.2%的培养基上
死亡率均最高(图1)。这说明鳞片在预培养7d时正
图1共培养处理后鳞片的死亡率
Figure1Mortalityofbulbscalesafterculturetreatment
处于芽分化的关键时期，因此秋水仙素对其伤害最
为严重。在对小芽进行壮苗及生根培养后，共获得
448株小鳞茎，发现叶色浓绿，叶片较厚且脆而易断
(图2A)；叶表粗糙，叶形改变(图2B)；鳞片没有鳞瓣
(图2C)；玻璃化苗(图 2D)；新生芽愈伤化(图 2E)以
及鳞茎内部腐烂(图 2F)等植株变异类型共 40株，
变异率为8.93%，经多倍体鉴定得到2株二倍性和
四倍性细胞共存的嵌合体，没有发现多倍体植株(表
1)。在对嵌合体的变异部分分离培养后，没有获得多
倍体。
图2诱导处理后出现的表型变异
注:A:叶色较深,叶片较厚;B:叶表粗糙,叶形改变;C:鳞茎无
鳞片 (左为变异鳞茎,右为正常鳞茎);D:鳞茎玻璃化;E:芽愈
伤化;F:鳞茎内部腐烂
Figure2Phenotypevariationafterinductiontreatment
Note:A:Deepcolourandthickleaf;B:Scabrous-leaf,shape
change;C:No-scaleseedling,leftisvariationandrightisnormal;
D:Vitrifiedseedling;E:Calusbud;F:Decomposedseedling
292
东方百合Siberia多倍体诱导及其细胞学鉴定
PolyploidyInductionandCytologicalIdentificationinOrientalLilySiberia
表1共培养处理后百合鳞茎表型变异
Table2Phenotypevariationoflilybulbletsafterculturetreatment
处理编号
TreatmentNo.
CK
1
2
3
4
5
6
7
8
叶粗糙
Scabrous-leaf
seedlings
0
2
0
2
2
5
3
3
0
无鳞瓣
No-scaleseedlings
0
1
0
7
0
5
1
2
0
叶厚
Thicker-leaf
seedlings
0
0
0
1
0
0
0
1
1
玻璃化
Vitrifiedseedlings
0
0
0
0
0
1
3
0
0
变异苗总数
Tatalofvariations
0
3
0
10
2
11
7
6
1
嵌合体
Mixploids
0
0
0
1
0
0
0
1
0
多倍体
Polyploids
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2.2直接浸泡
百合鳞片在不同浓度的秋水仙素溶液中浸泡
后，均出现有不同程度的受伤、萎蔫乃至死亡的现
象。当秋水仙素浓度达到0.5%时，即使是短时间24h
的浸泡也能使鳞片死亡率达到100%；当浸泡时间为
72h时，0.1%的秋水仙素溶液就可使鳞片死亡率达
到100%。因此在利用秋水仙素浸泡处理百合鳞片
时，处理浓度应控制在0.5%以下，处理时间应低于
72h。随着秋水仙素浓度的增加和浸泡时间的延长，
百合鳞片平均死亡率升高(图3)。经秋水仙素溶液浸
泡处理过的鳞片在接种初期生长缓慢，接种17d后
鳞片基部才出现淡黄色芽点，芽点出现时间较对照
延迟约10d。芽点进一步发育而成的小鳞茎出现了
不同程度的表型变异，共获得846个由不定芽发育
而成的小鳞茎，其中出现表型变异的有212株，变异
图3浸泡处理后鳞片的死亡率
Figure3Mortalityofbulbscalesaftermarinatingtreatment
变异苗数
No.ofvariation
叶粗糙
Scabrous-leafseedlings
无鳞瓣
No-scaleseedlings
叶厚
Thicker-leafseedlings
玻璃化
Vitrifiedseedlings
矮壮
Shorterandstrongerseedlings
愈伤化
Calusseedlings
变异苗总数
Tatalofvariations
嵌合体
Mixploids
多倍体
Polyploids
率为25.06%。对所有出现表型变异的鳞茎实施多倍
体鉴定后发现嵌合体36株，多倍体共4株(表2)，36
株嵌合体的变异部位分离培养后未获得多倍体。
处理
Treatment
CK
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
13
4
1
6
1
0
23
5
0
2
11
0
1
2
3
0
17
1
0
3
16
0
2
1
2
0
21
3
0
4
10
1
1
1
0
0
13
5
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CK
0
0
0
0
0
0
0
0
0
6
16
3
1
1
2
1
24
4
0
7
16
0
2
1
2
0
21
6
1
8
23
0
1
0
0
0
24
5
3
9
11
2
2
0
1
1
17
5
0
10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CK
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11
0
0
0
0
0
0
0
0
0
12
0
0
0
0
0
0
0
0
0
13
0
0
0
0
0
0
0
0
0
14
0
0
0
0
0
0
0
0
0
15
0
0
0
0
0
0
0
0
0
表2浸泡处理后百合鳞茎表型变异
Table2PhenotypevariationofLilybulbletsaftermarinatingtreatment
293
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
2.3染色体鉴定
对初步鉴定为多倍体的4株试管苗扩繁、继代3
次后形成19株，分别切取根尖进行染色体计数分析
(表3)。除17号因植株状态导致根尖分裂相细胞数目
较少而未达到50个细胞外，其余18株中的四倍性细
胞(染色体数目为2n=4×=48,图4A、4B)所占比例均达
到了90%以上，可以确定为稳定的同源四倍体。除大
部分细胞染色体数目为48条外还存在染色体数目为
24条的二倍性细胞(图4C)以及染色体数目为14、20
和31条等非整倍性的细胞(图4D)，少数试样中还发
现有些细胞的染色体数达到了90多条 (图4E、4F)。
对这些染色体数目多样化的细胞分析后认为，染色体
数目为14、20和31等非整倍性的细胞很可能是在压
片过程中染色体丢失所致；二倍性细胞的出现，说明
通过组织培养诱导获得的多倍体植株中仍然存在个
别未加倍细胞，但多次的继代培养已说明这些未加倍
细胞的存在并不影响四倍性细胞的分裂和生长。在3
号和18号植株中发现染色体数目多于90条染色体
的分裂相，对其染色体形态分析发现这些细胞并非更
高倍性的细胞，而是处于有丝分裂中期至后期的四倍
体细胞。由图4E可以看出，细胞中众多染色体明显的
排成两排，即将朝着细胞的两极分离，但细胞板尚未
形成，因此看起来酷似一个细胞。而由图4F可以看
出，距离较近的染色体形态和大小也几乎相同，这说
明细胞处于姊妹染色单体分离的时期。因此，不能将
这些细胞认为是更高倍性的细胞。
表3多倍体的倍性鉴定
Table3Theappraisalofpolyploidylevelaftermarinatingtreatment
株系号
NO.ofLines
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
观测细胞数
NO.ofobservedcels
61
76
53
90
102
69
83
95
137
86
68
66
81
46
49
72
13
83
86
≤23
2
1
1
3
2
1
1
1
1
1
2
24
2
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
24~48
1
1
1
1
1
3
1
48
61
72
49
88
101
67
81
93
133
84
64
65
80
42
46
71
12
81
83
≥49
2
1
四倍性细胞所占比例(%)
Percentageoftetraploidycels(%)
100
94.74
92.45
97.78
99.02
97.10
97.59
97.89
97.08
97.67
94.12
98.48
98.77
91.30
93.88
98.16
92.30
97.59
96.51
染色体数
NO.ofchromosome
图4诱变处理后细胞有丝分裂中期染色体数目
注:A,B:染色体数目为48条;C:染色体数目为24条;D:染色体数目为31条;E,F:染色体数目多于90条
Figure4Chromosomenumberofcelsduringmetaphaseofmitosisafterinductiontreatment
Note:A,B:48chromosomes;C:24chromosomes;D:31chromosomes;E,F:Morethan90chromosomes
294
2.4气孔鉴定
气孔密度及其保卫细胞的大小是鉴定二倍体与
多倍体的间接指标，我们分别对二、四倍体植株各50
个叶下表皮分别选取100个左右满视野的气孔进行
显微观察。四倍体叶下表皮气孔密度较二倍体的小，
而气孔保卫细胞较二倍体的大。统计结果表明：二倍
体平均气孔密度为32.88个/视野，四倍体为12.12
个/视野；二倍体气孔保卫细胞长×宽=546.51μm×
244.26μm，四倍体气孔保卫细胞长×宽=780.18μm×
380.19μm(数据为放大后的相对长度和宽度)。二倍
体与四倍体植株的叶下表皮气孔密度及气孔保卫细
胞长、宽差异均达到了极显著的水平。
3讨论
3.1诱变剂及诱变浓度和时间的选择
近年来许多研究者试图寻找能够替代秋水仙碱
的染色体加倍试剂，比如氨磺乐灵(oryzalin)、氟乐灵
(trifluralin)等。在百合中，仅有 vanTuy1等(1992)，
Takamura等(2002)研究了氨磺乐灵及 surflan(以氨
磺乐灵为主要活性成分的一种除草剂)诱导百合染色
体的加倍效果。vanTuy1等(1992)研究小组的研究结
果指出：浓度范围为0.001%~0.01%的氨磺乐灵和秋
水仙碱比较，有较高的加倍率，而对植物生长的抑制
作用较小。因此，作者认为，氨磺乐灵是秋水仙碱的
有效代用品。Takamura等(2002)的研究结果发现经
过 0.0075%的 surflan处理后，百合的多倍体率达
86.68%；试验还发现，低浓度的surflan(0.0025%)仍
然具有较好的诱导效果，而如果浓度过高(0.0125%)，
尽管其加倍率高，却会对百合植株生长产生明显的
毒害作用。从上述文献可以看出，虽然上述药剂作为
秋水仙素的替代品在百合染色体加倍中也取得了一
定效果，但是其价格($550元/0.1g左右)高昂，对环
境也有一定的污染。同时与秋水仙素一样，嵌合体的
现象不能完全克服，真正同一倍性的多倍体出现的
频率同样并不高。因此我们仍选用传统的秋水仙素
作为多倍体诱变试剂。
秋水仙素浓度过高或处理时间过长会导致材料
受损、死亡；浓度太低处理时间过短又达不到诱变的
效果。因此，如何平衡诱变率和秋水仙素浓度及处理
时间的矛盾就成为诱导多倍体的技术关键。我们在
培养基中添加秋水仙素进行多倍体诱导时发现，预
培养7d的鳞片在秋水仙素浓度为 0.1%和 0.2%的
培养基上死亡率均最高。究其原因可能是由于接种
7d后的鳞片正好是芽分化的关键时候，此时对秋水
仙素处理的反应也最为敏感，因此死亡率高于其他
预培养时间。
共培养和直接浸泡鳞片法相比较，前者对鳞片
的伤害程度较后者要轻，具体表现在处理后鳞片的
死亡率较低，但是诱变效果却不如直接浸泡。培养基
中添加秋水仙素共培养后，不定芽表型变异率为
8.93%，获得嵌合体2株，没有获得同质多倍体；直接
浸泡后不定芽表型变异率为25.06%，获得嵌合体36
株，在秋水仙素浓度为0.05%浸泡时间为48h的处
理组合中获得四倍体小鳞茎3株，在秋水仙素浓度
为0.02%和浸泡时间为48h的处理组合中获得四倍
体小鳞茎1株。对其扩繁后的19个无性系进行反复
的根尖染色体计数分析后发现有18个无性系的四
倍性细胞所占比例均达到了90%以上，可以确定为
稳定的同源四倍体。因此，我们认为，利用百合鳞片
诱导多倍体时，采用秋水仙素溶液直接浸泡的方法
较好，且以0.05%的浓度和浸泡48h为最佳组合。
3.2多倍体的鉴定
材料经诱变处理后大多成为多倍体、二倍体和
嵌合体的混杂群体，如何高效而准确的将多倍体筛
选出来是多倍体育种过程的重要环节。多倍体因其
加倍后在基因剂量方面有所增加，故在表型方面与
正常的二倍体相比会出现很多差别之处。V!inl#
(2000)在诱导杜鹃多倍体的发现，多倍体较二倍体具
有花大、花期延长、叶片加厚、叶色加深等特点。我国
的郑思乡等(2004b;2005b)在诱导东方百合多倍体中
也发现，多倍体植株具有叶片异常肥厚狭长，叶片表
面粗糙，移栽田间后抽生叶片为圆形，颜色为深绿色
等特点。因此，我们将出现表型变异当作多倍体或嵌
合体的初筛指标，利用表型变异对诱导处理后的材
料进行初步筛选，然后再对“疑似多倍体”进行进一
步的鉴定。这样可以缩小筛选群体，减少工作量，避
免鉴定的盲目性。多倍体鉴定方法以根尖染色体计
数法最为可靠，因此我们对变异植株反复进行了根
尖染色体计数的分析，并以四倍性细胞所占比例高
于85%作为鉴定指标，筛选后得到了稳定的四倍体
东方百合组培苗。此外，基于多倍体的稳定性以及嵌
合体的分离等问题，我们认为，多倍体的鉴定工作应
该分多次、多代进行。
参考文献
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tion ofLiliumoriental hybrids, Xinan Nongye Daxue Xue-
bao (Journal of Southwest Agricultural University), 26(3):
260-263 (郑思乡,章海龙,董志渊,雷小云,胡秀,周丽娟,
2004,东方百合多倍体诱导及种球繁育的研究,西南农业
大学学报,26(3):260-263)
海南省具有影响因子期刊中《分子植物育种》排名第1
序号
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9
刊名
分子植物育种
热带作物学报
热带农业科学
海南大学学报（自然科学版）
华南热带农业大学学报
热带林业
中国热带医学
海南师范学院学报（自然科学版）
海南金融
影响因子
0.918
0.450
0.422
0.312
0.285
0.237
0.221
0.217
0.208
序号
10
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17
18
刊名
海南大学学报（人文社科版）
新东方
天涯
海南医学院学报
琼州大学学报
海南师范学院学报（社科版）
海南医学
世界热带农业信息
海南广播电视大学学报
影响因子
0.190
0.164
0.149
0.136
0.131
0.115
0.113
0.094
0.087
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