全 文 ：·资源与利用·
收稿日期:2013 － 03 － 28
基金项目:国家自然科学基金(编号:30860161) ;云南省教育厅科学研
究基金(编号:2011 Y 212)。
作者简介:陈名红(1974 －) ，男(土家族) ;副教授，研究方向:植物分子
生物学;E-mail:cmhkm@ yahoo． com． cn。
通讯作者:李成云(1964 －) ，男，博士，教授，研究方向:植物分子生物
学;E-mail:li． chengyun@ gmail． com。
百合种质资源 ISSR标记研究的引物筛选
陈名红1，2， 李 玉1， 熊华斌1， 刘 多1， 李成云2
(1．云南民族大学民族药资源化学国家民委 －教育部重点实验室， 昆明 650031;
2．云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室， 昆明 650201)
The Screening of Primers for the Germplasm Resources of Lilium with ISSR Markers
CHEN Ming-hong1，2，LI Yu1，XIONG Hua-bin1，LIU Duo1，LI Cheng-yun2
摘要:为筛选出适合于百合种质资源 ISSR 标记研究的有效引
物，利用 58 个 ISSR引物，对百合属的卷丹、川百合、西伯利亚
和索邦进行 PCR扩增，共筛选出 11 条多态性丰富、条带清晰且
可重复性好的有效引物，11 条引物在 4 个样品中共扩增出 125
条 DNA带，其中 108 条为多态性带，占总扩增带数的 86． 4%，
平均每个引物扩增出 11． 4 条带。该研究结果为应用 ISSR 标
记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研
究奠定了基础。
关键词: 百合属;ISSR标记;引物;筛选
中图分类号: Q 949． 71 + 8． 23 文献标志码: A
文章编号: 1001 － 4705(2013)07-0056-03
ISSR是由 Ziekiewicz 等［1］于 1994 年基于 SSR 标
记创建来的一种新型分子标记技术，其基本原理就是
在 SSR的 3或 5端加锚 1 ～ 4 个随机核苷酸作为引
物，对两侧具有反向排列 SSR 的一段 DNA 序列进行
扩增，然后进行电泳、染色，根据所读取的谱带有无及
相对位置差异，来分析不同样品间 ISSR 标记的多态
性。由于 ISSR标记技术结合了 RAPD 和 SSR 技术的
优点，实验操作简便快捷、重复性高、稳定性好、成本较
低、所揭示的遗传多态性十分丰富，因此，ISSR 技术已
被广泛应用于植物遗传多样性、系统发育、品种鉴定、
基因定位、遗传作图等研究中［2 ～ 6］。
百合(Lilium spp．)是单子叶植物亚纲百合科(Lil-
iaccae)百合属(Lilium)植物的总称，为多年生鳞茎草
本植物，具有很高的药用、食用和观赏价值。中国境内
百合属种质资源极为丰富，且特有种很多，据调查，中
国约有 47 个种 18 个变种，占世界百合总数的 50%以
上，其中有 36 个种 15 个变种为中国所特有;中国也是
世界百合起源的中心，具有十分悠久的栽培历史，早在
1 400 多年前就有人工栽培的记载［7］。虽然百合作为
药用、食用及观赏用的重要花卉利用的历史已十分悠
久，但其分子遗传学方面的基础研究还较为滞后，目前
针对百合开展遗传分子标记研究的报道甚少，主要是
以 RAPD标记技术研究野生百合居群遗传多样性为
主［8 ～ 10］。为便于更有效地利用 ISSR 标记技术对百合
种质资源进行遗传分析，本研究以卷丹、川百合、西伯
利亚和索邦为供试材料用于引物筛选，旨在为应用
ISSR标记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种
分子鉴别等研究打下基础。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
本实验所用的材料为卷丹、川百合、西伯利亚和索
邦。采取新鲜幼嫩无病虫害的叶片，放入塑料封口袋，
硅胶干燥后备用。
1． 2 基因组 DNA的提取
采用改良的 CTAB 法提取基因组 DNA，具体步骤
为:取 0． 2 g硅胶干燥的叶片，在液氮中迅速研磨成细
粉末后转入 1． 5 mL 离心管中;加入 600 μL 65 ℃预热
的 2 × CTAB 提取缓冲液(2% CTAB，W/V，1． 4 mol /L
NaCl，20 mmol /L EDTA，pH = 8． 0，100 mmol /L Tris-
HCl，pH =8． 0，2% β-巯基乙醇 V /V) ，迅速混匀，置于
65 ℃水浴 1 h，期间每隔 10 ～ 15 min 摇动 1 次;冷却，
4 ℃ 12 000 r /min离心 10 min;取上清液，加入等体积
的氯仿 ∶异戊醇(24 ∶ 1) ，振荡混匀 10 min;12 000 r /
min离心 10 min;取上清液，加入 3 /4 体积的异丙醇，
混匀后 － 20 ℃静置 30 min;10 000 r /min 离心 5 min，
70%乙醇洗 3 次;自然风干后加 30 ～ 50 μL 1 × TE
(10 mmol /L Tris-HCl，1 mmol /L EDTA) ，室温静置 2 h，
使 DNA充分溶解;每管内加 1 mg /mL的 RNA酶 1 μL，
37 ℃下消化30 min，65 ℃水浴处理 10 min 使酶失活，
－ 20 ℃保存备用。
·65·
第 32 卷 第 7 期 2013 年 7 月 种 子 (Seed) Vol． 32 No． 7 Jul． 2013
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2013.07.068
表 1 实验所用的引物及其序列
引物 序列(5 ～ 3) 引物 序列(5 ～ 3) 引物 序列(5 ～ 3)
UBC 801 ATATATATATATATATT UBC 827 ACACACACACACACACG UBC 853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT
UBC 802 ATATATATATATATATG UBC 828 TGTGTGTGTGTGTGTGA UBC 855 ACACACACACACACACYT
UBC 804 TATATATATATATATAA UBC 829 TGTGTGTGTGTGTGTGC UBC 856 ACACACACACACACACYA
UBC 805 TATATATATATATATAC UBC 831 ATATATATATATATATYA UBC 857 ACACACACACACACACYG
UBC 807 AGAGAGAGAGAGAGAGT UBC 832 ATATATATATATATATYC UBC 858 TGTGTGTGTGTGTGTGRT
UBC 808 AGAGAGAGAGAGAGAGC UBC 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC UBC 859 TGTGTGTGTGTGTGTGRC
UBC 809 AGAGAGAGAGAGAGAGG UBC 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA UBC 861 ACCACCACCACCACC
UBC 810 GAGAGAGAGAGAGAGAT UBC 837 TATATATATATATATART UBC 862 AGCAGCAGCAGCAGC
UBC 811 GAGAGAGAGAGAGAGAC UBC 838 TATATATATATATATARC UBC 867 GGCGGCGGCGGCGGC
UBC 812 GAGAGAGAGAGAGAGAA UBC 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT UBC 873 GACAGACAGACAGACA
UBC 814 CTCTCTCTCTCTCTCTA UBC 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC UBC 876 GATAGATAGACAGACA
UBC 815 CTCTCTCTCTCTCTCTG UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG UBC 877 TGCATGCATGCATGCA
UBC 816 CACACACACACACACAT UBC 843 CTCTCTCTCTCTCTCTRA UBC 878 GGATGGATGGATGGAT
UBC 818 CACACACACACACACAG UBC 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC UBC 879 CTTCACTTCACTTCA
UBC 819 GTGTGTGTGTGTGTGTA UBC 845 CTCTCTCTCTCTCTCTRG UBC 880 GGAGAGGAGAGGAGA
UBC 820 GTGTGTGTGTGTGTGTC UBC 846 CACACACACACACACART UBC 881 GGGTGGGGTGGGGTG
UBC 821 GTGTGTGTGTGTGTGTT UBC 847 CACACACACACACACARC UBC 890 VHVGTGTGTGTGTGTGT
UBC 822 TCTCTCTCTCTCTCTCA UBC 849 GTGTGTGTGTGTGTGTYA UBC 895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC
UBC 824 TCTCTCTCTCTCTCTCG UBC 850 GTGTGTGTGTGTGTGTYC
UBC 825 ACACACACACACACACT UBC 852 TCTCTCTCTCTCTCTCRA
1． 3 PCR反应与电泳检测
反应体系为:10 × PCR buffer 2． 5 μL、40 ng 模板
DNA、2． 0 mmol /L Mg2 +、1． 5 U TaqDNA 聚合酶、0． 8
μmol /L引物(参照哥伦比亚大学公布的 ISSR 引物序
列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物
及其序列见表 1)、200 μmol /L dNTPs，总体积为 25 μL;
扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min，
51． 8 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共 35 个循环;最
后 72 ℃延伸 8 min。ISSR-PCR扩增产物在 1． 5%琼脂
糖凝胶上，于 3 ～ 5 V /cm 的电场中电泳 1 h，在凝胶成
像系统中观察、照相并记录。
2 结果与分析
2． 1 ISSR标记的引物筛选结果
本实验共利用 58 个 ISSR引物分别对 4 个样品即
卷丹、川百合、西伯利亚和索邦基因组 DNA 进行 PCR
扩增，根据照相记录，筛选出清晰且可重复的在 4 个样
品中都有扩增带的引物，最终筛选出 11 条多态性丰
富、条带清晰、重复性好的有效引物即 UBC 811、UBC
814、UBC 820、UBC 825、UBC 835、UBC 842 、UBC 843、
UBC 844、UBC 857、UBC 880、UBC 895。筛选出的 11
个引物在 4 个样品中的 PCR扩增图谱见图 1、2。
2． 2 ISSR标记数据统计及扩增结果
分别读取筛选出来的 11 个引物的扩增产物 ISSR
条带，结果如表 2。由表 2 可知，11 个引物在 4 个百合
样品中共扩增出 125 条 DNA条带，其中 108 条为多态
性条带，占总扩增总条带数的 86． 4%，平均每个引物
扩增的带数为 11． 4 条。扩增条带数最多的引物为
UBC 814 和 UBC 820，均达到了 14 条，扩增条带最少的
引物为 UBC 842 和 UBC 857，扩增出的条带均为 8 条。
其中，多态性最高的为 UBC 814、UBC 843 和 UBC 844，
均达到 100%，最低的为 UBC 857，仅有 62． 5%。
表 2 11 个引物在 4 个样品中的扩增结果
引物 序列(5 ～ 3) 扩增
带数
多态性
带数
多态率
(%)
UBC 811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 10 7 70
UBC 814 CTCTCTCTCTCTCTCTA 14 14 100
UBC 820 GTGTGTGTGTGTGTGTC 14 13 92． 86
UBC 825 ACACACACACACACACT 12 10 83． 33
UBC 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 12 10 83． 33
UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 8 7 87． 5
UBC 843 CTCTCTCTCTCTCTCTRA 11 11 100
UBC 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 13 13 100
UBC 857 ACACACACACACACACYG 8 5 62． 5
UBC 880 GGAGAGGAGAGGAGA 11 10 90． 91
UBC 895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC 12 8 66． 67
一般来说，在大部分样品中不能产生 DNA扩增带
的引物，说明与该类种质基因组 DNA 的同源性较低，
在对种质资源遗传多样性的 ISSR 研究中不宜用作合
适的引物，而通常筛选出能在所有样品中产生清晰、可
重复的 DNA扩增带的引物用于正式的种质资源遗传
·75·
资源与利用 陈名红 等:百合种质资源 ISSR标记研究的引物筛选
多样性大规模材料的 ISSR标记研究［11］。为验证本实
验所筛选出的引物的有效性，我们分别用这 11 个引物
对 23 份百合种质材料进行了 ISSR-PCR 扩增，扩增结
果不仅多态性丰富，而且条带清晰、重复性好，说明本
研究筛选出的引物对百合 ISSR-PCR 扩增是有效的、
可靠的。图 3 为引物 UBC 835 对 23 份百合种质材料
的 ISSR-PCR扩增图谱。
M:Marker DL 2 000;1:卷丹;2:川百合;3:西伯利亚;4:索邦
图 1 引物 UBC 811、UBC 814、UBC 820、
UBC 825、UBC 835 的 ISSR-PCR扩增结果
M:Marker DL 2 000;1:卷丹;2:川百合;3:西伯利亚;4:索邦
图 2 引物 UBC 842、UBC 843、UBC 844、UBC 857、
UBC 880、UBC 895 的 ISSR-PCR扩增结果
M:Marker DL 2 000;1 ～ 23:23 份百合种质材料。
图 3 引物 UBC 835 的 ISSR-PCR扩增结果
3 结 论
运用 ISSR标记技术时，由于每个引物并不适合于
所有物种，因此对引物的筛选是非常必要的，筛选出多
态性强，可重复性好的引物是整个实验成功的关
键［11］。本实验以卷丹、川百合、西伯利亚和索邦为供
试材料，从 58 个 ISSR引物中成功筛选出 11 条多态性
丰富、条带清晰且可重复性好的有效引物，11 条引物
共扩增出 125 条 DNA带，其中 86． 4%为多态性带。为
应用 ISSR标记技术快速、准确地进行百合属植物遗传
多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了基础。
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