全 文 ：分子植物育种，2009年，第 7卷，第 6期，第 1245-1253页
Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.6, 1245-1253
新思路、新技术、新方法
Novel Thinking & Technology
百合无毒化种球繁育关键技术
郑丽娜 刁义维 吴沙沙 吕英民 * 张启翔
北京林业大学园林学院,国家花卉工程技术研究中心,北京, 100083
*通讯作者, luyingmin@bjfu.edu.cn
摘 要 病毒对百合造成的危害是严重的，成为制约百合产业健康发展的瓶颈之一，进行百合无毒化种球繁
育关键技术研究具有重要意义。本研究以 5个感病百合品种种球为试材，应用愈伤组织培养(Ⅰ)、茎尖培养
(Ⅱ)、热处理结合茎尖培养(Ⅲ)、病毒唑结合茎尖培养(Ⅳ)、病毒唑加热处理结合茎尖培养(Ⅴ)五种脱毒方法进
行百合种球脱除病毒的研究。结果表明病毒唑加热处理结合茎尖培养方法最好，热处理结合茎尖培养和病毒
哇结合茎尖培养方法次之。
关键词 百合种球,脱毒,茎尖培养,热处理,病毒唑
Key Techniques of Virus-Free Lily Mother Bulbs Production
Zheng Lina Diao Yiwei Wu Shasha Lv Yingmin * Zhang Qixiang
College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, China National Floriculture Engineering Research Center, Beijing, 100083
* Corresponding author, luyingmin@bjfu.edu.cn
DOI: 10.3969/mpb.007.001245
Abstract The virus diseases can do great damage to lily and have become bottleneck for the development of lily
industry, therefore, it is very important and valuable to study the technique of virus-free lily bulbs. In this research,
bulbs of five lily variations were employed to be as experiment materials for reseaching the detection and elimination
technique of virus on lily bulb by using five virus deprivation methods, which are callus culture (Ⅰ), shoot tips
culture (Ⅱ), heat treatment combining with shoot tips culture (Ⅲ), virazole treatment combining with shoot tips
culture (Ⅳ) and shoot tips culture combining with ribavirin and heat treatment (Ⅴ). The results showed that shoot
tips culture combining with ribavirin and heat treatment would be the best method, and the heat treatment combin-
ing with shoot tips culture method and the method of virazole treatment combining with shoot tips come second. It
has important directive to homemading of lily bulbs in China
Keywords Lily bulbs, Virus-free, Shoot tips culture, Heat treatment, Virazole
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.007.001245
基金项目：本研究由国家林业局 948引进项目(2006-4-85)、国家林业局行业标准(2009-LY-004)和国家十一五科技支撑计划课
题(2006BAD01A1803)共同资助
百合(Lilium spp.)为百合科(Liliaceae)百合属(Lil－
ium)，重要切花，栽培品种多，种植面积日益扩大。我
国百合切花的商品化栽培历史较短，总体生产水平
和技术落后于荷兰、美国和日本等国家，目前主要依
靠进口种球进行生产(邢大洲等, 2009)。百合种球价
格昂贵，易感染病毒，特别是经多代自繁以后，病毒
积累、蔓延，加之缺乏严格的植物病毒检疫控制技
术，致使病毒在百合体内积累和蔓延，由于缺乏脱毒
优质种源，国内自繁种球病毒病感染率高达 80%，一
般发病率在 40%~50%，二代种球的带毒率在 90%以
上，由此造成百合种性退化、植株生长势衰弱、产量
下降、品质变劣等一系列问题(郑丽娜等, 2009)。采用
生物、物理、化学方法等途径来防治病毒危害收效甚
微，给百合产业造成巨大的经济损失。因此，建立稳
定的病毒检测体系以及行之有效的病毒脱除体系，
培育和推广无毒种球，对解决目前百合生产中存在
的问题具有重要的意义(郑丽娜等, 2009)。
自 1896年 Stewart描述百合的坏死条纹以来，相
继报导了百合病毒病原 14种，类菌原体 1种，其中主
要病毒有 3种：百合无症病毒(Lily symptomless virus,
LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus, CMV)和
百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)，这些病毒对
百合叶片、鳞茎及贮藏器官造成伤害，从而影响百合
的植株生长发育和切花、鳞茎产量，影响花色，降低
品质(沈淑琳, 1996)。
通过对已感病植株的病毒脱除技术研究，探索
稳定的病毒脱除和无毒繁殖的方法，培养脱毒种球，
恢复种性，对最终提高百合产业化生产安全性具有
重要的实际应用价值，开发脱毒种球生产技术是实
现百合种球国产化的关键。应用于植物病毒脱除的
方法很多，主要有热处理法、茎(根)尖培养脱毒法、抗
病毒药剂法、愈伤组织培养脱毒等，另外,花药培养
法、花芽培养法、胚珠培养法、茎(根)尖微体嫁接等也
用于植物脱毒。单一的脱毒处理技术一般难以完全
脱除病毒,或需较长时间,多种脱毒技术的综合运用
成为生产无毒百合种球的首选。
本研究从明确主要危害病毒种类的基础环节入
手，对感病百合植株应用 5种技术进行脱除病毒的
研究，建立培育百合脱毒原种种球的技术体系，旨在
寻找百合病毒脱除行之有效的系统方法，对实现我
国百合种球国产化具有重要的指导意义。
1材料与方法
1.1材料
本研究种球系从购自云南的 60个品种中(规格
12~14 cm和 14~16 cm)，选取以下 5个百合品种：东方
百合杂种系 3个品种：‘西伯利亚’(‘Siberia’,规格周径
14~16 cm)、‘索邦’(‘Sorbonne’,规格周径 14~16 cm)、
‘元帅’(‘Acapulco’,规格 12~14 cm)。OT百合杂种系 2
个品种：‘耶罗林’(‘Yelloweed’,规格周径 12~14 cm)、
‘木门’(‘Conca Dor’,规格周径 12~14 cm)。
1.2愈伤组织培养脱毒
外植体用中性洗涤剂(洗涤灵)洗净，凹凸不平处
以及鳞片缝隙处用软毛刷将污物洗净，在流水中冲洗
30 min以上；进入无菌接种室，在超净台上，用 75%乙
醇浸泡 30 s后用 0.1%的升汞浸泡 10~15 min，其中加
1~2滴土温；无菌水冲洗 7~8次，每次 3 min，最后吸干
水分。将鳞片四周切除，中间部分切成 0.4 cm×0.4 cm
的方形小块，接种至初代培养基(MS+6-BA 1.0 mg/L+
2,4-D 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)上，进行暗培养，观察
其生长状况。
30 d以后，在外植体腹面切口处形成不规则的
黄绿色或绿色愈伤组织，再分化出乳白至嫩黄色半
透明或不透明的小突起，小突起 14 d左右发育成带
叶的小鳞茎，小鳞茎由 4~5个小鳞片抱合在一起。取
此嫩叶做病毒检测鉴定其脱毒情况。
1.3组培苗茎尖培养法脱毒
组培苗茎尖培养法包括一次茎尖培养和二次茎
尖培养法。从百合种球直接剥取茎尖做脱毒培养，用
剩余的中部鳞片的下部为外植体接种，培养成苗做
二次茎尖脱毒。
1.3.1一次茎尖培养
取经低温处理抽芽(芽长 4~8 cm)的鳞茎，从茎节
处切下，剥除全部外部鳞片，仅留长度 2~3 cm的球芯，
用中性洗涤剂冲洗干净后，在流水中冲洗 30 min；在
超净台上蒸馏水洗涤 3次，每次 1min，投入 0.1%升汞
中消毒 5 min，然后用无菌水冲洗 5次，每次 3 min，用
灭菌滤纸吸干表面水分。在带有测微尺的解剖显微
镜(Olympus, SZx10)下用手术刀和解剖针剥取带有
1~2 个叶原基的茎尖分生组织，长度为 <0.2 mm，
0.2~0.5 mm 、0.5~0.8 mm、0.8~1.0 mm 的茎尖薄片，
每个品种接种 30 个，用解剖针置于培养基 (MS+
6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L)中，温度（20±1）℃，
遮光，进行暗培养。28 d开始膨胀，产生愈伤组织。转
接到MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L
的培养基上，相同条件下再培养 28 d，分化出不定
芽，形成无根苗。将分化出的小苗，修剪叶片，转接到
MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培养基上，培
养一个月，分化出带有小鳞茎的新苗。取组培苗的小
叶进行病毒鉴定。
1.3.2二次茎尖培养法
鳞片培养 40 d左右，开始出现膨胀，形成愈伤组
织，转接到MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养
基中，培养室温度(25±1)℃，遮光，进行暗培养。
培养 30 d左右，可见从愈伤组织上分化出不定
芽，形成无根苗。剥取无根苗的茎尖即新生芽顶端白、
亮的生长点进行二次脱毒培养。将其转入MS+NAA
0.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L培养基中，温度(20±1)℃，避
光培养 28 d后取嫩叶进行病毒检测。
1.4热处理+茎尖培养
设备是光照培养箱，正式试验前设置 10 d的预
热处理试验，材料为种球，热处理后再剥茎尖培养。
取经过 4℃低温催生芽长 4~8cm的种球，剥去
百合无毒化种球繁育关键技术
Key Techniques of Virus-Free Lily Mother Bulbs Production 1246
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
外层鳞片，留带有 3~6个内层鳞片的鳞茎盘，随后置
于光照培养箱(光照强度 1 500~2 000 Lx)，30℃、35℃
和 40℃下依次各预处理 3 d后，选择表现正常的个体，
置入光照培养箱中采用两种热空气处理法：(1) 变温
处理：每天经 38℃光照 16 h和 25℃黑暗 8 h热空气
处理2周、4周、6周、8周后，切取 0.6~0.8 mm的茎尖
接于分化培养基上培养；(2)恒温处理：38℃下，光照培
养 12 h/d，处理 4 d，剥取茎尖接于分化培养基上培养。
1.5病毒唑处理+茎尖处理
根据采用 UL9(34)均匀正交试验设计，利用正交设
计助手Ⅱ (专业版) 3.1进行试验安排。病毒唑浓度，茎
尖长度以及处理时间各设 3个水平，共 9组处理，每个
处理 30 个茎尖。将常规组培苗切取 0.5~0.8 mm、
0.8~1.2 mm 和 1.2~1.5 mm 茎尖接于鳞片诱导最佳
培养基加病毒唑(virazole) (3mg/mL, 6mg/mL, 9mg/mL
三个梯度)的培养基上，分别统计处理 15 d、30 d、45 d
后的成活率。观察茎尖的生长情况，统计成活率，选
取一定数量测定脱毒率。结果通过直观分析、方差分
析、多重比较分析进行综合比较。
1.6热处理+病毒唑处理+茎尖培养
利用正交设计助手Ⅱ(专业版) 3.1进行试验安排。
病毒唑浓度，茎尖长度以及热处理时间 3个处理各设
3个水平，共 9组处理，每个处理 30个茎尖。观察茎尖
的生长情况，统计成活率，选取一定数量测定脱毒率。
结果通过直观分析、方差分析以及多重比较分析进行
综合比较。
选取经过低温处理、芽长 4~8 cm的种球，剥去
外层鳞片，留带有 3~5个内层鳞片的鳞茎盘，放入培
养箱中预处理后，每天经 38℃ 16 h光照和 25℃ 8 h
黑暗热空气处理 4周，选择表现正常的个体，剥取
0.4~0.8 mm、0.8~1.2 mm和 1.2~1.5 mm的茎尖接于分
化培养基加病毒唑(virazole) (3mg/L, 6mg/L, 9mg/L三
个梯度)的培养基上培养 15 d、30 d和 45 d后分别统计
其成活率，从中选取各品种 30个样品进行脱毒检测。
1.7数据分析
试验采用单 /多因子试验设计及正交设计，并采
用 Microsoft Office Excel 及 SPSS 统计分析软件进
行数据的计算和统计分析。
2结果与分析
2.1愈伤组织培养脱毒
接种 15 d左右，部分接种形成愈伤组织(图1A)，
转接两次之后，愈伤组织诱导产生小鳞茎(图 1B)，这
是鳞片愈伤组织途径；而另外的鳞片无愈伤组织产
生，在接种 30 d后，产生不定芽(图 1C)，继代一次可以
直接形成小鳞茎，这是鳞片不定芽再生途径。总体来
看，5个品种的百合愈伤组织均可分化出小鳞茎，也都
有脱毒苗成功，但是存在比较明显的差异。从每个指
标上单独来看(图 2)，污染率方面，总体在 15%~28.3%
之间，在组培操作规定的污染率范围之内，证明此方
法实验室可行性比较强；分化率方面，总体在 53.3%~
68.3%之间，证明筛选的诱导分化培养基比较合适，
‘西伯利亚’、‘索邦’、‘元帅’的分化率大于‘耶罗林’和
‘木门’，证明了东方百合比 OT系列的分化率较高，这
可能与其基因分化型不同导致的产生愈伤组织的能
力不同有关；脱毒率方面，总体偏低，在 31.7%~46.7%
之间，效果不理想，说明此途径用于脱毒试验上不太
合适，暂不能成为百合脱毒的有效途径。但是这种脱
毒方式还是有其自身的优点的，可考虑与其他脱毒
方法结合使用或通过多次继代培养来获取脱毒苗。
该试验结果表明，从品种来看，5个品种在此脱毒途
径上的适用性从高到低依次是：‘西伯利亚’、‘索
邦’、‘木门’、‘耶罗林’、‘元帅’。
2.2组培苗茎尖培养法脱毒
2.2.1茎尖大小的影响
不同大小茎尖接入培养基后，21 d后部分成活
茎尖开始膨大(图 3A)，而有的因为失水而变褐，枯死。
培养 2个月左右，存活茎尖有的分化成芽(图 3B)，部
分膨大形成愈伤组织(图 3C)，经过两次转接，70 d后
茎尖再生出小苗。从图 4可以看出，成活率与茎尖大
小呈明显的正比例关系，剥取茎尖的大小与茎尖成
活率成正比，茎尖越大，茎尖生长越早，培养成活越
容易。接种长度为 0.8~1.0 mm的茎尖，成活率最高
可达到 96%，0.5~0.8 mm 的茎尖，平均成活率有
83%，0.2~0.5 mm的茎尖，平均成活率有 65%，小于
0.2 mm的茎尖只有 25.2%能够培养成活；脱毒率与
茎尖大小呈明显的反比例关系，3种病毒的脱除难易
程度从小到大依次为 LSV>LMoV>CMV (图 5)。茎尖
小于 0.2 mm的脱毒效果最好，其次为 0.2~0.5 mm，大
于 0.8 mm几乎无法脱毒。所以综合成活率及脱毒率
两个指标来看，用茎尖进行百合脱毒时，茎尖的大小
最好在 0.2~0.5 mm之间，不能小于 0.2 mm，否则不
易成活，由于剥离的茎尖小，需在解剖镜下操作，操
作难度大，而且接种后微小茎尖难以成活，脱毒率也
较低；不要大于 0.5 mm，否则达不到脱毒目的。
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DOI: 10.3969/mpb.007.0012451247
图 3百合茎尖培养
注: A:茎尖培养 1个月; B:茎尖诱导产生不定芽; C:茎尖培养
2个月
Figure 3 The shoot tip culture of lily bulbs
Note: A: Shoot tip cultured after one month; B: Adventitious bud
induced from shoot tip; C: Shoot tip cultured after two months
图 2 5个品种污染率、分化率及脱毒率的比较
注:污染率=1-成活率
Figure 2 The comparation of survival rate, differentiation rate and
virus-free rate of five varieties
Note: Contamination rate=1-Survival rate
图 5茎尖大小对 LSV, LMoV, CMV脱除率的影响
注: LSV:百合无症病毒; LMoV:百合斑驳病毒; CMV:黄瓜花
叶病毒
Figure 5 The influence of shoot tip size to the virus-free rate of
LSV, LMoV, CMV
Note: LSV: Lily symptomless virus; LMoV: Lily mottle virus;
CMV: Cucumber mosaicvirus
图 4茎尖大小对 5个品种成活率的影响
Figure 4 The influence of shoot tip size to the survival rate
图 1百合鳞片不定芽再生过程
注: A:鳞片诱导出愈伤组织; B:愈伤组织诱导产生小鳞茎; C:
鳞片产生不定芽
Figure 1 The reactivation process of adventitious bud of lily scales
Note: A: Callus induced from scales of lily; B: Bulblets induced
from callus; C: Adventitious bud induced from scales
2.2.2一次培养茎尖及二次培养茎尖效果比较
二次培养与一次培养的效果明显不同(图 6)，据
调查观察，二次培养经两次脱毒的茎尖在接种培养
后 20 d内开始萌动，基部稍增大并形成少量愈伤组
织，茎尖颜色逐渐变绿并逐渐伸长，叶原基发育成可
见小叶，进而形成带正常叶的小苗；而一次培养的小
茎尖则需培养 30 d才开始萌动。经二次脱毒培养的
图 6 5个品种两种茎尖培养方式的成活率比较
注:一次茎尖培养: 0.2~0.4mm;二次茎尖培养: 0.4~0.6 mm
Figure 6 The comparation of the survival rate of five variaties by
two shoot tip excising mode
Note: One time shoot tip culture: 0.2~0.4 mm; Two times shoot
tip culture: 0.4~0.6 mm
百合无毒化种球繁育关键技术
Key Techniques of Virus-Free Lily Mother Bulbs Production 1248
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茎尖的成苗率都高于 75%，污染率比较低，证明此法
实验室可行性好。病毒检测结果显示，二次脱毒处理
后的小苗脱毒率都在 75%以上，这说明在百合茎尖
组培繁殖中，较大的茎尖容易分化成苗，二次脱毒处
理后污染率降低，且脱毒率也能达到生产要求。
2.2.3不同茎尖灭菌剂及处理时间的影响
由于茎尖比较幼嫩，容易在灭菌环节中受到毒
害而丧失活性，所以消毒剂及其剂量、消毒时间的选
择对灭菌效果很重要，试验中本着最低消毒效用浓
度，适当延长灭菌时间的宗旨进行灭菌试验。
从表 1看，4种灭菌剂不同的处理时间对结果影
响显著，对所有的灭菌剂而言，在各不同灭菌时间处
理中，随着灭菌时间的延长，污染率呈下降趋势，失活
率呈上升趋势，高达 25%，严重影响再生。成活率呈抛
物线性变化。综合考虑来看，最适合的灭菌组合为 2%
次氯酸钠 15 min，其次为 0.1%氯化汞灭菌 5 min，既
降低了污染率，外植体又不失活，而且灭菌时间适宜。
2.3热处理+茎尖培养
不同预处理温度对成活率的影响不同，预热处理
一周后，90%以上的‘西伯利亚’、‘索邦’，85%以上的
‘元帅’、‘耶罗林’和‘木门’球芯表现正常，进入热处理。
2.3.1变温处理
5个品种在不同温度处理条件下表现不同(表 2)，
其中‘耶罗林’和‘木门’的成活率比‘西伯利亚’、‘索
邦’、‘元帅’高，说明 OT系列比东方百合耐热性稍
好，其中，成活率最高的是‘耶罗林’，5个品种对温度
变化的敏感程度由弱到强依次是‘耶罗林’、‘木门’、
‘西伯利亚’、‘索邦’和‘元帅’。
变温处理球芯后，处理4周的球芯表现最好，选
表 1不同灭菌处理的成活率、污染率及失活率
Table 1 The ratio of survival, pollution and inactivation of different germicidal treatment
灭菌剂
Sterilant
0.1%氯化汞
0.1% HgCl
3%过氧化氢
3% H2O2
2%次氯酸钠
2% NaClO
漂白粉
Bleaching powder
5 min
80
78
75
72
10 min
70
74
80
75
15 min
-
70
85
80
20 min
-
-
75
70
5 min
15
20
25
28
10 min
12
17
17
26
15 min
-
12
10
12
20 min
-
-
10
5
5 min
5
2
0
0
10 min
18
9
3
4
15 min
-
18
5
8
20 min
-
-
15
25
成活率(%)
Survival rate (%)
污染率(%)
Contamination rate (%)
失活率(%)
Inactivation rate (%)
表 2变温处理的球芯成活率
Table 2 The survival rate of bulb with variable heat treatment
编号
Coding No.
1
2
3
4
5
品种
Variety
‘西伯利亚’
‘Siberia’
‘索邦’
‘Sorbonne’
‘元帅’
‘Acapulco’
‘耶罗林’
‘Yelloweed’
‘木门’
‘Conca Dor’
2周
Two weeks
100
100
100
100
100
成活率(%)
Survival rate (%)
4周
Four weeks
83
79
87
80
80
6周
Six weeks
57
57
53
60
57
8周
Eight weeks
37
33
30
40
43
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择各品种种球热处理 4周再剥取四种规格的茎尖，
研究变温处理结合茎尖大小对脱毒率和成活率的影
响(表 3)。
变温处理，5个品种的表现差异不显著，随着处
理时间的拉长，成活率逐渐降低，几乎是直线水平递
减，处理 8周时，成活率仅有 34.8%。3种病毒来看，
CMV的脱除率最高，LSV次之，LMoV最低，这与 3
种病毒的钝化温度不同有关，CMV超过 25℃即有明
显的抑制作用，比较容易通过热处理脱除，30℃时对
LSV的抑制作用大于 LMoV，在东方百合杂种系列
的 3个品种中都体现了这一典型特点，但是在 OT系
列却无差别，可能与杂种系本身种性有关，东方杂种
系的病毒较 OT系列更容易通过变温热处理脱除。综
合成活率和脱毒率，如果只感染了 CMV，选择每天
经 38℃光照 16 h和 25℃黑暗 8 h热空气分别处理 4
周即可，若又感染了 LSV、LMoV，要延长至 6周才能
达到理想的脱毒效果。
2.3.2恒温处理
在采用热处理脱毒这一技术时，处理温度、时间
以及环境湿度都是比较重要的考虑因子，其基本原
则以能脱去病毒并能保证半数以上处理植物，能恢
复正常生长的处理温度、时间和湿度为最佳处理方
案。由于百合病毒钝化温度一般要求达到 38℃，采用
30~38℃交替变温处理既有利于缓解高温对植株的伤
害，也能有效抑制病毒繁殖，茎尖培养成功率较高。本
研究将温度范围调整为 25~38℃，脱毒效果较好。
恒温处理以后剥取 3种规格的茎尖成活率与变
温处理的相差不大(表 4)，但是脱毒效果差距明显，
表 3变温处理的茎尖脱毒率及成活率
Table 3 The survival rate and virus-free rate of variable heat treatments on five varieties
品种
Variety
‘西伯利亚’
‘Siberia’
‘索邦’
‘Sorbonne’
‘元帅’
‘Acapulco’
‘耶罗林’
‘Yelloweed’
‘木门’
‘Conca Dor’
成活率(%)
Survival rate (%)
83
87
83
77
77
百合无症病毒
LSV
80
70
80
80
70
黄瓜花叶病毒
CMV
80
90
80
80
80
百合斑驳病毒
LMoV
70
80
70
70
80
脱毒率(%)
Virus-free rate (%)
编号
Coding No.
1
2
3
4
5
表 4恒温处理茎尖脱毒率及成活率
Table 4 The survival rate and virus-free rate of homeothermia treatments on five varieties
品种
Variety
‘西伯利亚’
‘Siberia’
‘索邦’
‘Sorbonne’
‘元帅’
‘Acapulco’
‘耶罗林’
‘Yelloweed’
‘木门’
‘Conca Dor’
成活率(%)
Survival rate (%)
90.0
82.5
80.0
87.5
82.5
百合无症病毒
LSV
75
70
70
75
75
黄瓜花叶病毒
CMV
75
80
75
70
70
百合斑驳病毒
LMoV
75
75
70
65
75
脱毒率(%)
Virus-free rate (%)
编号
Coding No.
1
2
3
4
5
百合无毒化种球繁育关键技术
Key Techniques of Virus-Free Lily Mother Bulbs Production 1250
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 5病毒唑处理+茎尖处理的结果分析
Table 5 The analysis of virazole combining with shoot tips culture
试验号
Test No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
茎尖大小
Shoot tip
size
1 (0.5~0.8 mm)
1
1
2 (0.8~1.2 mm)
2
2
3 (1.2~1.5 mm)
3
3
130.99
185.25
143.39
63.77
56.31
79.86
54.56
病毒唑浓度
Concentration
of ribovirin
1 (3 mg/mL)
2 (6 mg/mL)
3 (9 mg/mL)
1
2
3
1
2
3
144.50
95.29
223.64
45.26
28.39
48.78
6.99
处理时间
Handling
time
1 (15 d)
2 (30 d)
3 (45 d)
2
3
1
3
1
2
136.54
79.27
140.48
58.31
53.47
49.65
12.24
空列
Blank
column
1
2
3
3
1
2
2
3
1
169.76
104.17
128.73
54.50
65.12
40.13
28.39
处理个数
No. of
treatments
30
30
30
30
30
30
30
30
30
脱毒率(%)
Virus-free
rate (%)
70
80
50
80
80
50
60
80
60
成活率(%)
Survival
rate (%)
52
84
92
63
69
94
47
79
76
证明变温处理脱毒效果比恒温处理好，大多实验也
都证明不耐高温的品种采用变温热处理为好。从 3
种病毒的脱除率来看，温度变化对 CMV的影响最
显著。成活率与茎尖大小呈正比，0.2~0.4 mm的成
活率比不经热处理时的(67%)低很多，表明热处理
对植物的损伤在这一水平影响显著，因此，茎尖培养
结合热处理脱毒，最佳组合是变温处理变温每天经
38℃光照 16 h以及 25℃黑暗 8 h热空气处理 4周之
后剥取 0.4~0.6 mm的茎尖培养，恒温 37℃下，光照培
养 12 h/d，处理 4周，后剥取 0.2~0.6 mm的茎尖培养。
探索适宜的预处理温度及时间来提高植物材料的成
活率和脱毒率将使得该方法的应用前景更加广泛。
2.4病毒唑处理+茎尖处理
病毒唑的抑制作用在>4 mg/L时开始见效，在
12 mg/L时效果明显，但此时较小的茎尖成活率很低。
病毒唑对 CMV的有较强的抑制作用，茎尖培养获得
无毒苗的难易程度与感染病毒种类及其在顶端生长
点周围浓度高低有直接关系，本试验的结果也证明了
这一点，在病毒唑含量大于 4 mg/L，规格小于 1.0 mm
的茎尖组合中，30 d培养期时所有组合中 LMoV都
被脱除，可能是因其分布距离顶端生长点较远，或浓
度较低；病毒唑浓度达到 8 mg/L时对 LSV的抑制作
用才体现出来；而 CMV在病毒唑浓度达到 12 mg时
才被脱除，说明 CMV更难受到病毒唑的抑制(表 5)。
综合各因子的各最佳水平，通过比较求得最优的
水平组合，确定最佳组合为病毒唑浓度 9 mg/mL、茎尖
大小 0.8~1.2 mm，处理 45 d，实验组合中以组合 6，即
病毒唑浓度 9 mg/mL、茎尖大小 1.2~1.5 mm，处理 15 d
最好。组合 6病毒唑浓度较高，但是茎尖大小适中，6
培养周期短，比较高效，且又能保证较高的脱毒率，
又可以兼顾较高的成活率和生长速度，且茎尖较大，
操作简单易行，符合实际生产需要。
2.5热处理+病毒唑处理+茎尖培养
根据表 8K值的大小，得知茎尖大小(A)、病毒唑
浓度(B)和培养时间(C)三个因素中，A因子以为 A2
最佳，即茎尖大小以 0.8~1.2 mm为好，B因子以 B2
(6 mg/mL)为最佳，而 C因子以培养 15 d最好。极差
值越大的因子对指标影响越显著，总体来看，3个因
子的影响程度依次为 B>A>C (表 6)。
综合各因子的最佳水平，选出最佳组合为茎尖大
小 0.8~1.2 mm、病毒唑浓度 6 mg/mL、培养时间 15 d。
经观察病毒唑浓度小于 6 mg/mL时对组培苗的成活
率没有影响，这时成活率与茎尖大小成正比，说明经
过热处理之后，更低浓度的病毒唑结合更大规格的
茎尖即可脱去病毒。综合的脱毒途径越多，个途径之
间有机配合的比例越高，脱毒率、成活率以及研究的
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0012451251
百合无毒化种球繁育关键技术
Key Techniques of Virus-Free Lily Mother Bulbs Production
总效率都能保证，反而是单一因子的脱毒手段对技
术的要求更高。
可见，多种脱毒方式的有机结合，从很大程度上
提高了脱毒手段的实际操作性，对于技术的推广和
普及有实际意义。单一的脱毒处理技术或难以完全
脱除病毒，或需要较长的时间，2种或 3种脱毒技术
的组合使用正成为生产无毒百合种苗的首选。
3讨论
良好的脱毒技术应该具备以下 3个特点：具有
较高的脱毒率；具有较高的成活率:操作简便；对仪器
设备要求低，便于推广。本研究组织培养的条件与多
数前人研究不同，均为暗培养，是出于创造与种球自
然生长环境相同暗环境的考虑，光培养生产出的鳞茎
与生产用球质量相距甚远，主要表现为出瓶鳞茎呈现
绿色，移栽后鳞茎生长较慢。近年来随着技术的不断
更新，百合小鳞茎培养期采用黑暗环境、(25±1)℃的恒
温条件，以及培养基适当增加蔗糖浓度使其小鳞茎只
进行膨大生长而不长叶，通过半年时间的瓶内生长，
百合小鳞茎围径可长到 6.39 cm左右，小鳞茎呈现白
色，接近百合鳞茎地下生长的自然状态，这样的鳞茎
通过打破休眠处理后，可显著提高移栽成活率，暗培
养的小鳞茎增殖效果优于光培养。究其原因可能与光
对细胞分裂的抑制有关，或许与其自然习性有关。
3.1愈伤组织培养试管苗
愈伤组织培养试管苗污染率较低，实验室可行
性比较强，但是如何降低污染率，这有待进一步研
究；分化率为 62%，证明筛选的诱导分化培养基比较
合适；脱毒率总体偏低，用于脱毒试验上并不合适。
此外，愈伤组织在长期无性培养过程中，由于培养基
中激素、生长素物质的刺激影响，通常会发生体细胞
无性系变异。这种变异的范围和方向都是不定的，因
此对于无性繁殖作物而言，为了保持优良性状，一般
不采用此法。但是这种脱毒方式还是有其自身的优
点的，比如实验室可行性强、分化率控制性比较强、
周期较短，一次性成苗数量多等，其外植体来源广
泛，比如花丝、花瓣等都可采取此途径，所以在百合
上应用此法脱毒还是有进一步研究的价值和空间。
3.2茎尖培养
在本研究中，就茎尖接种的外植体大小、灭菌时
间及灭菌剂、激素配比等进行了具体研究，得到了因
子的最佳组合水平，首次根据种球大小进行适当规
格的茎尖剥取，采取二次脱毒法，都取得了实际成
效。试验表明茎尖越小，越难分化，组培苗长期暴露
在外，污染率也随之升高，而且剥取操作难度较大，
极易褐化，从病毒检测的结果看出，单纯的茎尖培养
脱毒效果不佳，单独用茎尖培养法很难脱毒 CMV，
表 6热处理+病毒唑处理+茎尖处理的结果分析表
Table 6 The analysis of shoot tips culture combined with ribavirin and heat treatment
试验号
Test No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
茎尖大小
Shoot tip
size
1 (0.4~0.8 mm)
1
1
2 (0.8~1.2 mm)
2
2
3 (1.2~1.5 mm)
3
3
19.69
50.25
13.39
3.77
6.31
3.86
4.56
病毒唑浓度
Concentration
of ribovirin
1 (3 mg/mL)
2 (6 mg/mL)
3 (9 mg/mL)
1
2
3
1
2
3
21.50
32.59
8.64
5.26
8.39
4.78
6.99
处理时间
Handling
time
1 (15 d)
2 (30 d)
3 (45 d)
2
3
1
3
1
2
69.70
19.27
14.48
8.31
5.47
9.65
2.24
空列
Blank
column
1
2
3
3
1
2
2
3
1
36.54
17.17
18.73
4.50
5.12
4.13
0.93
处理个数
No. of
treatments
30
30
30
30
30
30
30
30
30
脱毒率(%)
Virus-free
rate (%)
60
70
50
80
60
50
60
80
80
成活率(%)
Survival
rate (%)
60
87
92
78
85
91
69
83
67
1252
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
LSV和 LMoV这三种病毒。
茎尖培养的优点是不需要复杂的设备和实验条
件，有较高的成活率，是所有植物脱病毒方法中最常
用的一种(马平霞, 2006)。茎尖的大小是影响茎尖培养
脱毒效果及成活率的主要直接因子。在适宜的培养条
件下，茎尖的大小与茎尖的存活率呈正相关，而与脱
毒效率呈负相关。因此茎尖的大小要求小到足以能根
除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。采用二
次脱毒茎尖可以剥到 0.8~1.0 mm，具有简便、易掌握、
速度快、分化率高、脱毒率高、污染率低等特点。百合
组培繁殖在以小鳞茎或珠芽为外植体进行茎尖培养
的过程中，茎尖分生组织消毒困难、容易污染，且操作
繁琐。今后的研究中，应切取适宜长度的茎尖，改进切
取方法，既能提高脱毒率又能提高茎尖成活率。
3.3茎尖培养结合热处理
茎尖培养结合热处理能显著提高脱毒效果，脱毒
率最高可达 80%，变温比恒温处理的效果好，在成活
率方面变温处理比恒温处理高 5%，二者相差不大，但
是脱毒效果差异达到显著水平，最大差异为黄瓜花叶
病病毒和百合斑驳病毒，均为 27%，而百合无症病毒
23%。因此，茎尖+变温处理具有脱毒率高，操作难度
较低，所用设备简单，成活率较高的优点，是一种比较
理想的脱毒方法。缺点是高温对百合的伤害极大，导
致热处理后百合的成活率降低。因此，寻找适宜的预
处理温度和处理时间来提高植物材料的成活率和脱
毒率将使得该方法拥有更广泛的应用前景。
3.4茎尖培养+病毒唑的脱毒
效果比较理想的茎尖培养+病毒唑的脱毒，简便
易行，但是如何选择茎尖大小规格、病毒唑浓度及适
宜的处理周期是两个重要因子，本研究得出了最优
组合，可以提供更多的脱毒方式。对于未完全脱除的
组培苗，其病毒的浓度较原来有所降低，可通过继续
使用病毒唑或延长培养周期、多次继代来彻底脱除
病毒。总之，病毒唑的浓度过高会阻碍茎尖的生长，
降低成活率，浓度过低又起不到阻碍病毒的作用。茎
尖培养结合病毒唑的脱毒效果与病毒唑浓度、茎尖
大小及培养周期有关，还受到病毒的种类、含量与分
布的影响，所以进行病毒的定位定量研究，有助于了
解病毒的分布特点和传播规律，对于这种脱毒方法
的研究有重要意义。
3.5热处理+病毒唑处理+茎尖培养
热处理+病毒唑处理+茎尖培养是本研究中最理
想的脱毒方式，根据病毒唑浓度、茎尖大小以及处理时
间三个因素三个水平对脱毒效果的影响，筛选最佳组
合为茎尖大小 0.8~1.2 mm、病毒唑浓度 6 mg/mL、培养
时间 15 d。
参考文献
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Thesis for M.S., Northwest Normal University, Supervisor:
Zhao Q.F., pp.33-34 (马平霞, 2007, 西伯利亚百合脱毒及
病毒检测,硕士学位论文,西北师范大学,导师:赵庆芳,
pp.33-34)
Shen S.L., 1996, Lily virus disease and test, Zhiwu Jianyi (Plant
Quarantne), 10(4): 223-226 (沈淑琳, 1996,百合病毒病及
其检验,植物检疫, 10(4): 223-226)
Xing D.Z., Diao Y.W., Wu S.S., Lv Y.M., and Zhang Q.X., 2009,
Screening of introduced new lily cultivars, Zhongguo Keji
Lunwen Zaixian Jingpin Lunwen (Highlights of Sciencepa-
per Online), 2(16): 1687-1694 (邢大洲,刁义维,吴沙沙,吕
英民,张启翔, 2009,引进百合新品种的筛选研究,中国科
技论文在线精品论文, 2(16): 1687-1694)
Zheng L.N., Diao Y.W., Wu S.S., Lv Y.M., and Zhang Q.X.,
2009, Detection of three kinds of lily mother bulb virus by
using RT-PCR techniques, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecu
lar Plant Breeding), 7(5): 948-953 (郑丽娜,刁义维,吴沙沙,
吕英民,张启翔, 2009,三种百合种球病毒 RT-PCR检测,
分子植物育种, 7(5): 948-953
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0012451253