全 文 ：收稿日期:2006-04-17
基金项目:南阳市科技攻关项目(2005PT064);南阳师范学院资助项目(ny tc2004k10)
作者简介:王正德(1963-),男 ,河南邓州人 , 讲师 ,本科 , 主要从事应用生物技术研究工作。
欧李茎尖分生组织培养与快速繁殖技术研究
王正德 , 庞发虎
(南阳师范学院生物系 ,河南 南阳 473000)
摘要:以欧李茎尖分生组织为外植体 ,研究了在培养基中添加不同的激素成分及不同浓度对不定
芽诱导 、继代增殖和生根培养的影响。结果表明:不定芽诱导的最佳培养基是 MS +6 -BA
0.4mg/L+IAA 0.5mg/ L;增殖培养的最适培养基为 MS+6-BA 0.3 mg/ L+IAA 0.4 mg/L;最
佳生根培养基是 2/3MS+IAA 0.5 mg/L。应用症状诊断和指示植物鉴定法进行病毒检测 ,平均脱
毒率为 73%。
关键词:欧李;组织培养;脱毒;快速繁殖
中图分类号:S662.5　　文献标识码:A 　　文章编号:1004-3268(2006)09-0097-03
Technology System for Stem-apex Meristem Culture and
Rapid Propagation of Prunus humilis
WANG Zheng-de , PANG Fa-hu
(Biolo gical Department of Nanyang Normal College , Nanyang 473000 , China)
Abstract:The influences of the factors such as composition and concentration of hormones in culture
medium upon adventit ious bud induct ion , shoot proliferation and roo ting w ere studied w ith the stem-
apex meristem of Prunus hum ilis as explant.The results show ed that the optimum medium for ad-
vent itious bud regeneration w as M S+6-BA 0.4 mg/ L +IAA 0.5 mg/L;the best culture medium
for shoot proliferation w as MS+6-BA 0.3 mg/L +IAA 0.4 mg/ L;the proper culture medium of
rooting w as 2/3M S+IAA 0.5 mg/L.And the average virus-free rate was 73%based on the semiolog-
ical diagnosis and plant indicato r identification.
Key words:Prunus hum ilis ;Tissue culture;Virus-f ree;Rapid propagation
　　欧李(Prunus humilis Bunge.)俗称山樱桃 ,属
蔷薇科李亚科李属(Prunus)落叶小灌木 ,原产我
国 ,在东北 、华北等地区 13 个省市均有分布[ 1～ 3] 。
欧李株高 0.5 ～ 1.5m ;早春开花 ,白色至淡红色 ,状
似樱花;果实红色 ,近球形。整株株型优美 ,可作庭
院和路旁绿化观赏植物 。其果实营养丰富 ,酸甜可
食 ,含有人体所必需的多种营养物质和微量元素 ,近
年来发现 ,其钙和铁的含量居所有水果之冠。据测
定 ,每 100g 果肉含钙 360mg ,铁 58mg ,被人们称为
“钙果”[ 4] ,是天然的补钙 、补铁佳品。欧李果仁入
药为“郁李仁”。欧李抗旱耐寒 、耐瘠薄 ,地下根系发
达 ,生长迅速 , 是水土保持 、退耕还林的优势植
物[ 5] 。欧李属赏 、食 、药 、生态多用途优良树种 ,因
此 ,市场苗木需求量日益增大。但在实际生产中 ,欧
李通常采用分株繁殖和扦插繁殖 ,繁殖系数都很低 ,
不能满足生产的要求。1987年以来 ,阎贤伟[ 6]等人
试图用组织培养方法快繁 ,目前已获部分成功。欧
李长期处于野生状态 , 根据李属植物带毒的情
况[ 7 , 8]和笔者长期对室外欧李苗木表征的观察 ,认
为至少存在苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、李坏死斑
病毒(PNRSV)和李矮缩病毒(PDV)的危害。上述
病毒可通过无性繁殖进行传播 ,影响其生长和果实
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河南农业科学
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2006.09.036
产量 、质量 。目前 ,未见欧李无毒苗组织培养有关的
报道。一般认为 ,活跃的分生组织是病毒尚未到达
的部位[ 9 ,10] ,笔者在前期欧李幼茎组织培养的基础
上 ,采用茎尖分生组织培养的方法 ,对获得欧李的无
病毒植株的途径进行了研究和探讨 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
2003年秋 ,选取生长正常 ,初步表现带病毒症
状的(用指示植物方法确认 ,见 1.6)一年生分株繁
殖苗待用(盆栽),株高 0.5m 左右 。由南阳阳光花
木公司提供。
1.2　培养基配方
以MS为基本培养基加蔗糖 30 g/L 、琼脂7 g/L
(前期)或 5.5 g/L(生根),固体培养 。
茎尖成活培养基为 MS +6 -BA 0.5mg/L +
IAA 0.3mg/L 。
茎尖分生组织启动培养基分别采用 MS +6-
BA 0.7 mg/L , MS +6-BA 0.4 mg/L +IAA 0.5
mg/ L ,MS+6-BA 0.4 mg/L +IAA 0.3 mg/L。
继代培养基为 MS+6-BA 0.5 mg/L ,MS+6
-BA 0.3 mg/L +IAA 0.4 mg/L , MS +6-BA
0.3 mg/ L+IAA 0.2 mg/ L。
生根培养基分别采用 2/3MS+IAA 0.7 mg/L ,
2/3M S+IAA 0.5 mg/L , 2/3MS+IAA 0.3 mg/ L。
1.3　茎尖处理
①选取长势好的枝 ,剪取枝端约 1.5 cm 长的幼
茎 ,剪去肉眼可见叶片 ,置烧杯中加入少许洗衣粉 ,
以缓流自来水冲洗 25 min;在超净工作台上以 75%
酒精浸泡 35 s ,然后用 0.1%HgCl2(加 2滴吐温)浸
泡约 3 min ,无菌水冲洗 3 ～ 5 遍 ,至不再有泡沫泛
起 ,取出置无菌纸上吸干表面水分。 ②超净工作台
上切取前期幼茎培养的试管增殖苗的 1 cm 左右幼
芽。
1.4　茎尖剥离和培养
在超净工作台上解剖镜下用解剖针剥除顶芽及
部分已展开的叶原基 ,切取 0.3 ～ 0.4 mm 带 1 ～ 2
个叶原基的分生组织 ,迅速接种在茎尖成活培养基
上培养。
1.5　培养条件
温度(25±2)℃, pH 值为 5.8 ,前期光照 1 500
～ 2 000 lx ,13 h/d;生根光照调至2 500 ～ 3 000 lx ,8
～ 10 h/d。
1.6　脱毒效果检测
采用表观症状诊断和指示植物鉴定对茎尖组培
苗进行病毒检测 。以巴西牵牛(Ipomoea setosa)、黄
瓜和桃(GF305)的实生苗为指示植物 。方法:表观
症状诊断 ,即全面观察试管苗长相长势 ,将长势弱 ,
叶片黄化 、黄脉和叶小 、有枯斑等症状明显的带毒苗
除去;指示植物鉴定 ,即在温室内(以防止携病毒昆
虫感染)用灭菌细昆虫针轻刺指示植物的初展叶(2
～ 3片),挤滤出初代培养的待检脱毒苗的幼嫩茎叶
的汁液 ,沾接在针刺部位。用无菌水作对照 ,试验重
复 3次 ,于接种后第 2 ～ 4周 ,每天观察叶有无褪绿
斑 、枯斑和坏死的斑点产生及产生的数量和叶有无
畸形 。只要 3种指示植物检测合计有 1种症状 ,即
剔出。
1.7　脱毒试管苗获得
经上述方法检测确信无病毒的继代培养苗继续
增殖培养。
1.8　试管苗的炼苗 、移栽
在温室内逐步打开已生根的培养瓶盖 ,炼苗7 d
左右移出试管苗 ,洗掉根际培养基 ,移栽到经 0.3%
硫酸铜溶液消毒的通透良好的培养土中培养 ,保持
温度 20 ～ 25 ℃,湿度 80%左右 , 1周后逐渐降低湿
度和提高光强 ,1个月后带土团移栽 ,深度以所带土
团低于表土 1 cm 为宜 。
2　结果与分析
2.1　不同外植体的筛选
据观察 ,欧李茎尖组织培养未见外植体褐化现
象 ,这有利于及时排出污染。培养 5 d即开始膨大
逐渐形成愈伤组织 , 20 d左右确认成活后接入初代
培养基培养 。茎尖成活培养中 ,总成活率偏低 ,采用
春季自然生长的茎尖接种 ,成活率显著高于试管苗
茎尖 ,且后期苗健壮(表 1)。
表 1　不同外植体成活率
外植体 接种数(个)
污染率
(%)
褐化率
(%)
成活数
(个)
成活率
(%)
栽培株茎尖 50 8 0 33 67
试管苗茎尖 50 0 0 12 27
　　通过外观筛选和指示植物测试 ,取自栽培和取
自试管的茎尖分生组织脱毒率在 73%～ 77%没有
显著差别 。因此 ,后期增殖培养采用栽培苗茎尖培
养体系 。
2.2　茎尖分生组织启动培养基的筛选
由表 2可以看出 ,初代培养 5 d后 ,愈伤组织出
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2006年第 9期
现绿色芽点 ,接着长出幼芽;25 d后 ,丛芽长至 3 ～ 5
cm ,试验中初代培养最适培养基为 MS+6-BA 0.4
mg/ L +IAA 0.5 mg/L。
表 2　培养基对启动不定期芽萌发的影响
培养基
芽始萌
动期
(d)
萌发率
(%) 芽长势
MS+6-BA 0.7mg/ L 8 61 芽长势不整齐 ,有部分黄苗
MS+6-BA 0.4 mg/ L
+IAA 0.5 mg/ L 5 86
芽较粗状 ,
色绿光泽好
MS+6-BA 0.4 mg/ L
+IAA 0.3 mg/ L 7 73 长势较好
2.3　继代培养基的筛选
切取初代培养幼茎 1.5 cm 左右侧芽 ,转移至继
代培养基继代培养 , 4 d 后新侧芽萌动 ,6 d后开始
生长 ,25 d后新枝长至 2 ～ 3 cm 。由表 3可知 ,继代
增殖较好的培养基为 MS+6-BA 0.3 mg/L +IAA
0.4 mg/ L。
表 3　培养基对芽外植体增殖的影响
培养基
10d平均
芽数
(芽/株)
25d平均
芽数
(芽/株)
芽长势
MS+6-BA 0.5 mg/ L 0.62 3.1 长势较好
MS+6-BA 0.3 mg/ L
+IAA 0.4 mg/ L 0.92 4.6 长势壮色绿
MS+6-BA 0.3 mg/ L
+IAA 0.2 mg/ L 0.65 3.7 长势不齐色淡
2.4　生根培养
选取健壮的芽切成 1.5 cm 左右的茎段 ,接入生
根培养基 ,7 d后根尖萌动 , 15 d 后生长迅速。同一
培养基中 ,壮芽生根量显著高于弱芽。由表 4可知 ,
较好的生根培养基为 2/3 MS +IAA 0.5 mg/ L ,在
此培养基上 ,根系较粗壮且部分有侧根 。
表 4　培养基对生根率的影响
培养基
15d平均
根数
(条)
30d平均
根数
(条)
35d总生
根率
(%)
根长势
2/ 3MS+IAA 0.7 mg/ L 0.8 2 34 粗
2/ 3MS+IAA 0.5 mg/ L 1.5 4 72 长且粗壮
2/ 3MS+IAA 0.3 mg/ L 0.7 2.1 35 长
2.5　脱毒效果检测与移栽
试验表明 ,巴西牵牛初展叶片接种后反应敏感 ,
接种带病毒汁液 10 d后即出现症状 ,20 d后症状明
显 ,侵染点形成数目不等的典型的局部褪绿斑;黄瓜
接种 10 d左右表现为黄绿色褪绿斑或花叶 ,有些是
开始出现叶脉褪绿 ,逐渐发展成为系统花叶;桃叶反
应为暗绿色凹陷斑或褪绿斑驳畸形叶 ,节间短 ,但
时间延后。检测结果表明 ,脱毒率达 73%,成活率
达 81%。
3　讨论
1)上述各培养基配方是在前期研究的基础上
经初筛选后确定的 。
2)由于脱毒所需茎尖外植体小而脆弱 ,采自前
期试管苗茎尖分生组织成活率低 ,可能是芽内营养
水平低 ,生理状况弱于栽培苗茎尖 ,因而其成活率显
著低于栽培苗茎尖分生组织 。
3)观察表明 ,影响欧李试管苗生根的主要原因
是苗细弱 ,这可能与欧李试管苗在继代培养中分化
系数高 、大量丛生芽竞争体内有机物和培养基养分
所致有关 ,目前 ,这一方面研究仍在进行和探讨之
中 。
4)适当降低生根阶段培养基的琼脂用量 ,即降
低培养基的固相程度 ,可使生根提前(2 ～ 4 d)并提
高生根率(3%～ 5%),使后期洗根更容易 ,也不易伤
根 ,提高成活率。本研究表明 ,较适宜的琼脂用量是
5.5 g/L ,既不影响整体培养过程 ,又使生根更容易 。
5)本研究进行脱毒检测时仅用了表观症状诊
断和指示植物检测 ,但通过 1年多对移栽苗观测证
明 ,3种植物监测结果趋向一致 ,证明效果可靠 ,指
示植物鉴定结合表观症状诊断检测病毒简便易行 、
成本低 ,是基层单位适用的方法。脱毒苗与未脱毒
苗相比较 ,明显还苗快 ,营养生长旺盛 ,开花多而整
齐 ,结果量和果实品质情况还有待今后进一步研究。
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