全 文 ：药材与资源
云南桃儿七遗传多样性的 DALP分析
吴 刚1, 2 ,虞 泓2 ,崔光芬2*
( 1 中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南 万宁 571533; 2 云南大学生命科学学院
生态遗传学实验室,云南 昆明 650091)
摘 要:目的 进行药用植物桃儿七 Sinopodop hy llum hex andrum 的遗传多样性研究, 为桃儿七资源的保护和开
发利用提供分子遗传理论基础。方法 对 6 个桃儿七居群进行 DALP 分析, 利用 PopGene 1 31 软件分析遗传多
样性相关数据, UPGMA 方法聚类, 结合 T reeview 软件生成树状图。结果 筛选 5 对引物组合, 扩增共产生 150 条
DNA片段, 其中 104 条谱带具有遗传多态性, 占 69 33% , 平均每组引物扩增所得多态条带为 20 8, 6 个居群平均
多态百分率为 14 22%。6 居群总的观察等位基因数 N a 为1 693 3, 平均1 142 2; 总的有效等位基因数 N e 为
1 417 1, 平均1 083 8;基因多样性指数 H 为0 244 3, 平均0 048 8; 总的 Shannon 多样性指数 I 为0 364 3, 平均
0 073 0; 居群总的基因多样性 H t 为0 244 3,居群内基因多样性 H s 为0 048 7。基因分化系数 Gs t为0 800 5,即遗
传变异有 80 05%发生在居群间, 19 95%发生在居群内,居群每代迁移数 Nm 为0 124 6。结论 桃儿七居群间存
在较大的遗传分化,基因流受到阻碍, 这与桃儿七的繁育系统和生存环境紧密相关。
关键词:桃儿七; DALP ;遗传多样性
中图分类号: R282 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 06-0951-05
DALP Analysis on genetic diversity of Sinopodop hyllum hexandrum in Yunnan Province
WU Gang1, 2 , YU Hong2 , CU I Guang- fen2
( 1 Spice and Bever age Crops Research Institute, Chinese Academy of T ropical Ag ricultural Science, Wanning 571533,
China; 2 Laborat ory of Ecolog ical Genetics, Co llege of L ife Science, Yunnan Univ ersity , Kunming 650091, China)
Abstract: Objective T o study the genet ic div ersity o f Sinop od op hy l lum hexandr um so as to pro vide
basic mo lecular g enet ic evidence for protect ing and explo it ing the resource o f S hexandrum Methods Six
populat ions of S hex andrum were analyzed by DALP molecular markers To make up the genet ic div ers-i
ty correlation data by PopGene 1 31 sof tware and cluster by UPGMA method, and establish the dendro-
g ram. The tr ee w as subsequent ly v isualized w ith T reev iew sof tw are Results Five primer g roups w ere
screened and a total of 150 DNA fragments w ere amplif ied, among which 104 w ere polymorphic, i e the
percentag e of polymorphic bands ( PPB) w as 69 33% , the average number of DNA polymorphic band am-
plif ied by each primer g roup w as 20 8 and the aver age PPB was 14 22% In the six populat ions, the total
observed number o f alleles ( N a) w as 1 693 3 and the average N a w as 1 142 2; T he total effect ive number
of alleles ( N e) w as 1 417 1 and the average N e w as 1 083 8; T he to tal Neis g ene div ersity ( H ) w as
0 244 3 and the average H was 0 048 8; The total Shannons informat ion index ( I ) w as 0 364 3 and the
aver age I was 0 073 0; The total gene div er sity ( H t ) w as 0 244 3 while the gene diversity w ithin a popu-
lat ion ( H s) w as 0 048 7 T he coef f icient of g ene differ ent iat ion ( Gst) w as 0 800 5 betw een populations,
namely 80 05% genetic v ar iat ion occur ring betw een populations and the rest 19 95% w ithin populat ion,
and est imated gene f low ( Nm) w as 0 124 6 Conclusion The result indicats that S hexandr um has much
larger genet ic different iat ion among populat ions and gene flow has been blo cked. T his m ight be a result of
species breeding system and populat ion habitat
Key words: Sinop od op hy l lum hexandr um ( Royle) Ying; DALP; g enetic div ersity
951中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
* 收稿日期: 2008- 08-18 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30370156) ;国家科技基础条件平台项目( 2005DKA21000- 5-09)作者简介:吴 刚( 1981 ) ,男,硕士,主要从事植物生态遗传的研究,发表相关论文 2篇。
T el : 13876664969 E-mail: w ugang0225@ sina com
桃儿七 Sinopodophy l lum hex and rum ( Royle)
Ying 是小檗科鬼臼亚科桃儿七属多年生草本植物,
分布于喜马拉雅及邻近地区, 产于云南、四川、西藏、
甘肃、青海和陕西,生于林下、林缘湿地、灌丛中或草
丛中,海拔2 200~ 4 300 m。在国外, 主要分布于不
丹、尼泊尔、印度北部、巴基斯坦、阿富汗及克什米
尔[ 1, 2]。根茎、须根、果实均可入药,根茎能除风湿、
利气血、通筋、止咳; 果能生津理气、止咳化痰、麻木、
月经不调等症均有疗效[ 3]。且根和根茎中含有的鬼
臼毒素是合成多种抗癌药物的前体,是一种民间草
药,为我国的珍稀药用植物,属国家三级保护物种,
被列入中国珍稀濒危植物名录和中国植物红皮
书[ 4] 。DALP( direct amplif icat ion of length po ly-
morphisms, 直接扩增片段长度多态性)是 1998 年
由法国科学家 Desmar ais 发展起来的一种检测
DNA 多态性的方法。它是通过 AP-PCR 方法扩增
出不同长度 DNA 片段以检测 DNA 多态性的一种
分子标记技术 [ 5]。本实验对分布于云南滇西北的 6
个桃儿七居群进行了 DA LP 检测, 对其居群遗传多
样性和遗传结构进行分析, 为桃儿七的引种驯化、遗
传育种、繁殖栽培和规模化种植提供有用基础理论。
1 材料和方法
1 1 植物材料:本研究以桃儿七 6个居群为主要研
究对象, 同时选取川八角莲 Dysosma veit chii
( Hemsl et Wils ) Fu 1个居群为外类群, 均引种种
植于云南昆明英茂生物技术实验室保育基地,所用
实验材料由云南大学生命科学学院虞泓教授鉴定,
见表 1。
表 1 实验材料
Table 1 Materials in this study
物 种 居群产地 生 境 海拔/ m 备 注
桃儿七 S hexand rum 云南小中甸唐木纳村( tm ) 灌木丛下,林下* 2 100* 种子苗
云南小中甸民各村( mg) 田间空地* 2 100* 种子苗
云南中甸石卡山( tt ) 杜鹃、高山栎灌丛中 3 400 野生引种
云南小中甸南比次( zz) 田间空地* 2 100* 种子苗
云南中甸丫口( yy) 灌木丛下,沟边 3 300 野生引种
云南中甸碧塔海( bb) 田间空地* 2 100* 种子苗
川八角莲 D ve it chi i 云南嵩明阿子营乡( cc) 林下* 2 100* 野生引种
* 为引种地(云南英茂生物技术实验室保育基地)的生境和海拔
* H abitat and alt itu de of int roduct ion place ( Inmol Laboratory of Biotech nology of Yunnan )
1 2 方法
1 2 1 总 DNA 的提取: 基因组 DNA 提取采用
CT AB法。每株取 0 5 g 新鲜的叶片, 提取的 DNA
用琼脂糖凝胶电泳检测、DNA 标定, 利用 Kodak
Image Station 440CF 凝胶成像分析系统分析并标
定到 20 ng/L 备用。
1 2 2 PCR扩增:从 6个居群中各取出 2份 DNA
样品进行预实验,选出 5组能获得清晰条带的引物
组合: PR2-P221; RP2-P222; PR2-P235; PR2-237;
PR2-P241,引物组序号与序列见表 2。
表 2 DALP 引物组序号与序列
Table 2 Sequences of DALP primer groups used
引 物 引物号 序列( 5~ 3)
选择性引物 DALP221( P221) GTTTTCCCAGTCACGA CGC
DALP222( P222) GTTTTCCCAGTCACGA CGT
DALP235( P235) GTTTTCCCAGTCACGA CCAC
DALP237( P237) GTTTTCCCAGTCACGA CAGA
DALP241( P241) GTTTTCCCAGTCACGA CTCAG
反向引物 DALPR2 ( PR2 ) A ACA GCTATGACCATGA
反应体系: 采用 20 L 反应体系, 其中模板
DNA 60 ng , 2 L 25 mmol/ L M gCl2 ( Taq酶配套) ,
2 L 10 Buffer( T aq 酶配套) , 1 L 2 5 mmol/ L
dNTPs(上海生工分装) , 4 L 0 5 U/ L T aq 酶
( Shanghai Promega ) , 1 L 5 pmo l/ L 选择性引物
(上海生工合成) , 3 L 5 pmol/ L 反向引物(上海生
工合成) , 引物序列见表 2。本研究采用反向引物
PR2 分别与 5个选择性引物组合进行 DALP 扩增。
扩增程序: 使用 PE9700 扩增仪 (美国 PE 公
司)。95 预变性 5 min, 94 变性 30 s, 50 退火
30 s, 72 延伸 1 min,共 35个循环。最后, 72 延
伸 10 m in 完成整个 PCR扩增。
产物检测: 扩增产物在 1 T BE, 1 0%的琼脂
糖凝胶中电泳,溴化乙锭染色, Kodak凝胶成像系统
照像,检测 DALP 带型, 后再进行聚丙烯酰胺凝胶
电泳及银染。
1 2 3 聚丙烯酰胺电泳: 5%非变性聚丙烯酰胺凝
胶(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺比例为 29 1) , 上
样量 5 L (样品与 6 上样缓冲液比例为 5 1)。
电泳条件: Bio-Rad垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)
800 V、150 min。
1 2 4 DALP 银染:采用快速银染法,参照王海英
的方法[ 6] 。
952 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
1 2 5 数据处理: 根据 DALP 指纹图谱(图 1)中
Mark的相对分子质量标准估计扩增条带的相对分
子质量,每个样品的扩增带按有或无记录, 有赋值
为 1, 无赋值为 0, 得到原始数据表征矩阵, 弱带及
重复性不好的条带不予统计。利用 PopGene 1 31
软件计算各居群的多态位点百分率( PPB)、Shannon
多样性指数( I )、观察等位基因数( N a)、有效等位基
因数( N e)、Neis基因多样性指数( H )、总基因多样
性( H t )、居群内基因多样性( H s)和居群间基因分
化系数( Gst)等相关指标, 并进行 U PGMA 聚类分
析,结合 T reeview 软件生成树状图。
2 结果
2 1 遗传多样性:桃儿七 6 个居群, 5组 DALP 引
物扩增得到 150条清晰条带, 部分 DALP 指纹示意
图见图 1, 平均每组引物扩增条带数为 30, 其中 104
条为多态条带,平均每组引物扩增所得多态条带为
20 8。6个居群的平均多态条带比率、总的多态条
带比率、各居群 PPB 值、总的观察等位基因数 N a、
平均 N a、总的有效等位基因数 N e、平均 N e、Neis
基因多样性指数 H、平均 H、总的 Shannon多样性
指数 I、平均 I 等,见表 3。
2 2 遗传分化及聚类分析:计算得桃儿七总的基
图 1 桃儿七 DALP 指纹图谱示意图
Fig 1 DNA Fingerprints of DALP from S hexandrum
表 3 桃儿七居群 DALP 遗传多样性
Table 3 Analysis of DALP genetic diversity in populations of S hexandrum
物种 居群 样本数 多态条带 多态条带比率/ % N a N e H I
桃儿七 tm 10 18 12 00 1 120 0 1 067 3 0 039 6 0 059 8
mg 10 25 16 67 1 166 7 1 110 8 0 063 5 0 093 5
t t 10 30 20 00 1 200 0 1 115 7 0 067 6 0 101 4
zz 10 15 10 00 1 100 0 1 054 5 0 032 7 0 049 7
yy 10 24 16 00 1 160 0 1 119 6 0 065 5 0 094 6
bb 10 16 10 67 1 106 7 1 035 1 0 023 6 0 039 0
均值 10 2133 14 22 1 142 2 1 083 8 0 048 8 0 073 0
总计 60 104 69 33 1 693 3 1 417 1 0 244 3 0 364 3
川八角莲 cc 5 19 12 67 1 126 7 1 086 0 0 049 6 0 073 0
居群产地见表 1
Populat ion hab itat seen in T able 1
因多样性指数 H t 为0 244 3, 居群内多样性指数
H s 为 0 048 7, 居群 间基因分 化系数 Gst 为
0 800 5,存在较大的遗传分化。居群每代迁移数
Nm为0 124 6。桃儿七有 80 05%的遗传变异来自
居群之间, 19 95%来自居群内, 居群间的分化极其
显著。供试的桃儿七 6个居群被聚为 2个类群: 群
中,小中甸唐木纳村居群( tm)和小中甸南比次居
群( zz)先聚合,再和其他 2个居群聚为大类群;群
953中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
由中甸丫口居群( yy )和中甸碧塔海居群( bb)组成。
作为外类群的川八角莲在聚类图上明显与桃儿七分
开。各居群遗传距离的 U PGMA 聚类见图 2。
图2 桃儿七 6个居群及川八角莲1 居群 UPGMA聚类图
Fig 2 Dendrogram of six populations of S hexandrum
and one population of D veitchii by UPGMA
3 讨论
遗传多样性是物种避免灭绝而长期生存的前
提,种内遗传多样性或变异愈丰富,物种对环境变化
的适应能力就愈强, 其进化的潜力就越大[ 7]。
桃儿七主要以自花授粉为主,偶发生异花授粉,
从花出土到开花结束只要 3~ 4 d[8]。本研究结果表
明,这特殊的繁育体系在很大程度上影响了桃儿七居
群的遗传变异式样,所检测的 6个居群总的 PPB值
为69 33%,居群平均 PPB水平为 1422%。
用分子标记检测遗传变异的方法很多,在以往的
研究中发现,同一物种采用不同的方法检测其遗传多
样性会得到不同的结果,这种差异是由所采用的检测
方法本身的灵敏度和其他一些因素决定的[ 9]。王海
英[ 6]在对丽江山慈菇的遗传研究中发现, DALP分子
标记所检测到遗传多样性明显比 RAPD分子标记检
测到的要多。云南桃儿七居群的多态位点百分率和
肖猛[ 10]对四川的桃儿七居群检测出来的结果差不
多,都呈现较低的遗传多样性; 而云南桃儿七居群总
的PPB大于肖猛[ 10]检测得出的结果, 这可能是检测
方法和不同地区采样综合造成的。
居群基因流较小时( Nm< 1) , 有限的基因流会
加大居群之间的遗传分化。因此, 往往当 Nm 减小
时, Gst值就会升高。在遗传分化研究中发现, 桃儿
七居群每代迁移数 Nm 仅为0 124 6,而居群基因分
化系数 Gst达到了0 800 5。肖猛[ 10]发现四川的桃儿
七居群出现了遗传分化, 居群间的分化大于居群内
的分化。本实验研究表明云南桃儿七居群间分化剧
烈, 居 群之间 的基 因交流 受到 较大 的阻 碍
(Nm< 1) ,检测结果也从分子水平上进一步验证了
马绍宾和胡志浩 [ 11]从生态学上研究得出的结论, 桃
儿七是一种自花授粉植物,居群间基因流动不是很
有效,一些桃儿七居群表现出多型性。
近几年,随着人们对桃儿七用途的增加,其药用
需求量越来越大。特别是利用其所含的鬼臼毒素作
为合成抗癌药物原料以后, 人们对其大规模挖掘,对
桃儿七的破坏极大。在桃儿七被大规模挖掘的地
方,残存的个体避难到难以被人们挖掘的灌木丛、树
根丛和石缝中生存, 导致了遗传漂变等不利因素的
发生。田英等[ 12] 在对宁夏六盘山野生桃儿七资源
调查时得出:野生桃儿七在该地区已成为濒危物种。
肖猛[ 10]也发现四川的一 些桃儿七居群受人为干扰
较为严重,生境受到破坏, 桃儿七被大量采挖,残存
的植株生长细弱,居群遗传多样性较低。虽然本次
对云南桃儿七居群的调查并未发现大规模采挖, 但
是丫口居群和南比次居群都受到人为放牧的影响;
石卡山地区由于修建风景区使该桃儿七居群受到人
为干扰严重。
研究表明虽然桃儿七在物种水平上具有丰富的
遗传多样性和进化潜力, 但在居群水平上出现遗传
多样性较低的情况,也许因其是自花授粉植物, 也可
能由于在局部地区过度采集或者不合理的开发, 使
其遗传结构和遗传多样性的丰富度遭到严重的威
胁,如果不尽快实施保护策略,可能会直接造成资源
的枯竭, 以及在局部区域的濒危。因此对桃儿七野
生居群的保护迫在眉睫,对桃儿七生长的地方, 可以
通过制定法规条例来增进和提高民众保护环境的意
识,禁止人为破坏等措施进行保护。而对一些破坏
地残留的居群, 要恢复和加强居群的生活力。根据
群落学调查研究结合桃儿七的分子变异式样,桃儿
七居群间分化强烈, 所以在对桃儿七种质资源进行
迁地保护时,要尽可能多地采集不同生境的居群,每
个居群要采集一定的个体,一些小居群也要有一定
的采样策略,才能最大限度地维持种内遗传多样性
水平,这也是持续利用遗传资源的前提和基础。
参考文献:
[ 1] 应俊生 八角莲属和桃儿七属(新属)研究 [ J] 植物分类学
报, 1979, 17( 1) : 17-23
[ 2] 虞 泓 珍稀植物桃儿七 [ J] 植物杂志, 1999, 3: 6- 7
[ 3] 应俊生 中国植物志 [ M ] 第 29 卷 北京: 科学出版社,
2001
[ 4] 傅立国 中国植物红皮书 [ M ] 北京: 科学出版社, 1991
[ 5] Desmarais E, Lanneluc I, Lagnel J Direct am plif ication of
length polym orphism s ( DAL P) , or how to get an d character-
ize new genet ic mar kers in many sp ecies [ J] Nuc le ic Ac id s
R es, 1998, 26( 6) : 1458- 1465
[ 6] 王海英, 虞 泓, 李南高, 等 云南丽江山慈菇遗传多样性
的 DALP 分析 [ J] 云南植物研究, 2005, 27( 2) : 156-162
[ 7] 邹喻苹, 葛 颂, 王晓东 系统与进化植物学中的分子标记
[ M ] 北京: 科学出版社, 2001
[ 8] 马绍宾, 徐正尧, 胡志浩 桃儿七繁殖生物学研究 [ J ] 西北
954 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
植物学报, 1997, 17( 1) : 49-55
[ 9] 李 昂, 葛 颂 植物保护遗传学研究进展 [ J ] 生物多样
性, 2002, 10( 1) : 61- 71
[ 10] 肖 猛 濒危植物桃儿七的遗传多样性研究 [ D] 成都: 四
川大学, 2006
[ 11] 马绍宾, 胡志浩 桃儿七分布格局与生态适应的初步研究
[ J] 武汉植物学研究, 1996, 14(1) : 47- 54
[ 12] 田 英, 郭 帅, 彭 励, 等 宁夏六盘山濒危植物桃儿七
的生存现状及保护对策研究 [ J] 农业科学研究, 2006, 27
( 2) : 82-85
见血封喉内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究
戴文君1 ,张秀环1 ,黄贵修2 ,戴好富1 ,梅文莉1*
( 1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南 海口 571101; 2 中国热带农业科学院
环境与植物保护研究所, 海南 儋州 571737)
摘 要:目的 分离和鉴定见血封喉 Antiar is tox icar ia 根韧皮部中的内生真菌, 并检测其抑菌活性。方法 以金
黄色葡萄球菌 Staphy lococcus aur eus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 methicillin- resistant S tap hy lococcus aureus
( MRSA )和白色念珠菌 Candida albicans 作为指示菌, 采用杯碟法对内生真菌发酵上清液进行抑菌试验。结果
从见血封喉根的韧皮部中分离出 6 株内生真菌,经形态鉴定分属于聚端孢霉属( T r ichothecium LK ex Fr )、枝顶
孢霉属( A cr emonium LK ex Fr )和丝核菌属(R hiz octonia DC ex F r )。其中内生真菌 J6 的发酵上清液对 MR-
SA 有抑菌活性, 抑菌圈直径为 18 mm。结论 首次对见血封喉内生真菌进行了研究, 内生真菌 J6 对 MRSA 有明
显的抑菌活性,其抑菌活性成分值得进一步研究。
关键词:见血封喉; 内生真菌;抑菌活性
中图分类号: R282 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 06-0955-03
Isolation, identification, and antimicrobial activity of endophytic fungi
from Antiar is toxicaria
DAI Wen-jun1 , ZHANG Xiu-huan1 , HU ANG Gu-i xiu2 , DAI Hao- fu1 , M EI Wen-li1
( 1 Inst itute of T r opical Bio science and Biotechno lo gy , Chinese Academy o f T r opical Ag ricult ur al Sciences,
H aikou 571101, China; 2 Env ir onment and P lant P rotection Institute, Chinese Academy
of T ropical Agr icultural Sciences, Danzhou 571737, China)
Abstract: Objective T o isolate and ident ify endophyt ic fung i f rom the phloem in the r oot o f A nt iari s
tox icar ia and detect the ant imicrobial act ivity of these st rains Methods S taphy lococcus aur eus, methici-l
l in-r esistant S taphy lococcus aureus ( MRSA) , and Candida albicans were selected as indicator s T he ant-i
m icrobial act ivit ies o f the fermentat ion f ilt rate of endophyt ic fung i w ere tested by cy linder plate method
Results Six endophy t ic fung i w er e isolated f rom the phloem in the r oot o f A tox icar ia. T hese st rains
w ere mo rphologically ident if ied to genus of T r ichothecium LK. ex Fr. , A cremonium LK ex Fr and Rhi-
z octonia DC ex Fr The fermentat ion f iltr ate of endophyt ic fungus J6 show ed the ant imicrobial act iv ity a-
gainst MRSA T he diameter of inhibit ion zone w as 18 mm Conclusion Its the f irst r eport about the en-
dophy tic fung i from A tox icaria Endophy tic fungus J6 exhibits st rong ant im icrobial act ivity against MR-
SA, its act iv e components are o f w orth to further study
Key words: A nt iari s tox icar ia ( Per s ) Lesch ; endophy tic fung i; ant imicrobial act ivity
植物内生真菌是指生长于植物的根、茎、叶等组
织和器官内的一类真菌, 是植物微生态系统中的重
要组成成分,在进化过程中与植物宿主建立了和谐
的共生关系, 其次生代谢产物十分丰富, 是新化合
955中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
* 收稿日期: 2008- 09-18 基金项目: 973计划前期研究专项( 2007CB116306) ;海南省自然科学基金资助项目( 30608) ;海南省自然科学基金指导性项目( 80671)作者简介:戴文君( 1984 ) ,女,湖北武汉人,硕士研究生,现主要从事微生物学研究。
T el : (0898) 66968572 E-mail: daishu19842003@ yahoo. com. cn
* 通讯作者 梅文莉 T el: ( 0898) 66988061 E- mai l: meiw enli@ yahoo com cn