全 文 ：收稿日期:2010-08-09.
基金项目:江苏省高校自然科学基金项目(06KJB180045).
作者简介:南程慧(1982-),男 ,博士研究生 ,主要从事植物资源及植物分类研究;＊通讯作者:王贤荣(1966-),女 ,博士 ,教授 ,主要从事植
物分类学和植物资源学研究.
迎春樱组培无菌外植体获得方法初探
南程慧 ,王贤荣＊ ,汤庚国 ,顾　宇
(南京林业大学 森林资源与环境学院 ,江苏 南京 210037)
摘要:迎春樱种子具有休眠作用 , 赤霉素处理可有效打破迎春樱种子的休眠作用 ,促进其快速萌发;三种无菌
外植体获得方法中 ,以光照培养箱培养 30 ～ 40d的迎春樱沙床苗作为外植体最为理想 , 平均诱导率为 65.0% ～
68.3%;其次为不同浓度 GA处理的 MS培养基诱导形成的无菌苗 , 由此种方法形成的无菌苗进行芽的诱导 , 诱导
率在 90%以上 , 污染极少 ,但无菌苗诱导困难 ,浪费种子及培养基;当年生带腋芽茎段不适宜作为外植体进行芽的
诱导 , 诱导率极低且后期外植体污染严重 , 可采用当年生带顶芽茎段进行芽的诱导;前期高浓度的 BA刺激 , 后期适
当减少培养基中 BA的含量可有效诱导迎春樱丛芽的分化.
关键词:迎春樱;组培;外植体;诱导
中图分类号:S322.3 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2010)03-0251-05
PreliminaryStudyonSterileExplantsofCerasusDiscoidea
NANCheng-hui, WANGXian-rong＊ , TANGGeng-guo, GUYu
(ColegeofForestResourcesandEnvironment, NingjngForestyUniversity, Ningjing210037, China)
Abstract:TheseedsofCerasusdiscoideahavethedormantcharacteristics, andGAtreatmentcouldefec-
tivelyremovetheseeddormancyandpromotetheseedgermination.Ofthethreemethodsofobtaining
sterileexplants, thesandbedseedlingisthebestwaytoobtiansterileexplants, whentheseedinggrowth
from30 to40 days, andtheaverageinductionrateisfrom65.0% to68.3%.Thebeterwayissterile
seedlingswhichcomefromdiferentconcentrationsofGAtreatment.Inducingsterileseedlingswiththe
method, theaverageinductionrateismorethan90%, butthesterileseedlingwasdificulttoinduceand
seedsandmediumandwasted.Thestemwithaxilarybudswerenotgoodexplants, havinglowinduction
rateandhighcontaminationrateonlategrowthstage.Terminalbudsweregoodexplants.Earlystimula-
tionofhighconcentrationsofBAandlatelowcanefectivelyinducethediferentiationofbuds.
Keywords:Cerasusdiscoidea;tissueculture;explants;induction
迎春樱(CerasusdiscoideaYǜ etLi)属蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)樱属(Cerasus),小乔木或乔
木 ,野外调查过程中发现部分单株树高可达 15m.伞形花序着花 1 ～ 3朵;总苞片褐色 ,倒卵状椭圆形;苞片绿
色 ,近圆形或扇形 ,果期宿存;萼筒管形钟状 ,外面被稀疏柔毛 ,萼片长圆形 ,平展或反折;花瓣椭圆形 ,先端两
裂;核果红色或紫红色.迎春樱花色粉红 ,先叶开放 ,为早春优质的观花植物.主要分布于我国的安徽 、浙江 、
江西 、福建等地 ,生于山谷林缘或溪边灌丛中 ,海拔 200 ～ 1 100m处 [ 1, 2] .
我国野生樱花资源丰富 ,但引种开发利用较少 ,仅有高盆樱(Cerasuscerasoides)、钟花樱(Cerasuscampan-
ulata)、野生早樱(Cerasussubhirtelavar.ascendens)等少数种或变种进行过繁殖利用方面的研究[ 3-10] .迎春
樱作为华东低海拔地区的早春观花树种 ,至今还未有引种繁殖利用方面的研究见诸报道 ,作者仅见南京中山
第 28卷第 3期　　　　 　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　Vol.28　No.3
2010年 9月　　　　　　　　JournalofHubeiUniversityforNationalities(NaturalScienceEdition)　　　　　　　　　Sep.2010
植物园 、南京梅花山 、杭州植物园 、武汉植物园及江西农业大学对其进行园林利用 ,且多属直接的野外成树移
植.为合理保护和开发利用野生迎春樱资源 ,丰富华东地区园林观赏树木种类 ,本实验进行了迎春樱组培无
菌外植体获得方法的初步研究 ,以期为迎春樱进一步的组培快繁提供依据.
1　材料与方法
1.1　实验材料
2009年 5月采于安徽黄山桃花峰的迎春樱成熟果实 ,经堆沤软化后 ,水洗干净;果核室温下于光亮处阴
晾一周;装入密封塑料袋中 ,置于 3℃左右冰箱中低温冷藏备用.
2010年 5 ～ 8月于南京中山植物园采集迎春樱当年生半木质化嫩枝作为实验材料.
1.2　实验方法
1.2.1　沙床苗外植体实验　检测低温冷藏 10个月的迎春樱果核千粒重 、生活力等指标;随机选取迎春樱带
内果皮种子 ,打破内果皮 ,取出种子作为实验材料;自来水冲洗 30min后 , 70%酒精浸泡 30s, 0.2%HgCl2溶
液浸种 3min,无菌水冲洗 5 ～ 6次后 ,浸泡 30min,除去残余 HgCl2;用不同浓度的 GA(分子式 C19H22O6 ,分子
量 346.37)溶液浸种 6h后 ,将处理好的迎春樱种子置于经过 120℃高温消毒过的培养皿沙床中 ,沙床用对应
浓度的 GA溶液润湿 [ 11] ;在温度为 15℃,光照强度为 1500 ～ 2 000lx,黑暗 8h,光照 16h的光照培养箱中进行
种子发芽实验 ,观测记录不同时间的发芽生长情况.每种 GA处理 3个重复 ,每个处理 100粒种子 ,未经 GA
浸泡的作为对照试验.迎春樱种苗生长 40d左右具有两片真叶时开始组织培养实验.
参照闫道良 、荣冬青钟花樱 、野生早樱培养基的配置方法 [ 5, 7, 8] ,配置 MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L的
启动培养基 ,其中 pH为 5.8,蔗糖 30g/L,琼脂粉 7g/L;将生长 30、40、50、60d具有两片真叶的迎春樱沙床苗
于超净工作台上 ,剪去幼根 ,无菌水冲洗 3遍 , 70%酒精浸 30s后 , 0.2%HgCl2溶液浸泡 3min,取出种苗 ,无
菌水冲洗 5 ～ 6遍;将每个材料剪成带子叶和带真叶的茎段接种于配好的培养基上 ,每种处理接种 30瓶 ,每
瓶 2个茎段.培养室中观测记录外植体启动 、污染等情况.
1.2.2　种胚外植体实验　按照沙床苗外植体种子检测 、消毒方法对迎春樱种子进行处理 ,去除 GA溶液处
理 [ 12-15] ;分别配置 MS+GA0.05g/L、MS+GA0.1g/L、MS+GA0.15g/L、MS+GA0.2g/L的启动培养基 ,以
不添加任何生长调节物质的 MS培养基作为对照 ,每个处理 20瓶 ,每瓶接种 3粒种子(pH、蔗糖 、琼脂粉同沙
床苗实验);培养室中观测记录不同时期种胚的发芽 、污染等情况.
1.2.3　茎段外植体实验　于 5、6、7、8月份分别采集迎春樱当年生嫩枝 ,剪去枝条上的叶片后 ,用洗衣粉洗
去枝条上的污渍;将枝条剪成 2 ～ 3cm带腋芽的茎段 ,其中 5、6、7月份接种材料均为当年生带腋芽茎段 , 8月
份接种材料一部分为当年生带顶芽茎段 ,其余为腋芽茎段;于自来水下冲洗 3 ～ 4h后作为实验外植体;将外
植体在 70%酒精中浸泡 30s, 0.2%的 HgCl2中浸泡 15min,无菌水冲洗 5 ～ 6遍后 ,用无菌滤纸吸干表面的水
分;将消毒后的材料剪成 1.5 ～ 2cm的茎段 ,接种于 MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L启动培养基上每次接种
30瓶 ,每瓶 2个茎段;培养室中观测记录不同时期种胚的启动 、污染情况[ 5-8] .
1.3　培养条件
培养温度为 23±2℃;日光灯照明 ,光照强度为 1500 ～ 2 000lx;每天光照 16h.
2　结果与分析
2.1　GA处理对迎春樱种子休眠的影响及沙床苗组培外植体的选择
迎春樱带内果皮种子于 3℃低温条件下干藏 10个月后 ,种子生活力为 97.6%,说明低温干藏有利于迎
春樱种子保存.对赤霉素处理过的迎春樱种子进行沙床发芽试验发现 ,经赤霉素处理种子 6d后胚根伸出 ,
对照试验未有胚根伸出;10d时赤霉素处理过种子发芽率分别为 58.3%、61.7%、58.3%、65%(见表 1),对
照试验未有种子发芽 ,仅有 8.3%的种子有露白现象;20d左右时 ,对照实验开始有部分种子发芽 ,发芽率为
5.0%;40d时四种赤霉素浓度处理过种子发芽率接近最大值 ,分别为 86.7%、86.7%、91.7%、96.7%,对照
试验仅为 10.0%,此时多数种苗具有 2片对生真叶 ,未发芽种子及露白种子不再生长 ,对照试验及赤霉素浓
度分别为 0.05、0.1g/L的处理种子形成的种苗开始有所污染 , 60d时所有处理及对照试验材料污染加剧.
根据以上试验结果可知 ,迎春樱种子具有休眠特性 ,仅有低温无法有效打破迎春樱种子的休眠作用;对
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　 　 　　第 28卷
表 1　不同 GA浓度处理沙床苗发芽观测结果
Tab.1　Theobservationsofsandbedseedlings
germinationwithdiferentconcentrationsofGA
GA浓度/g· L-1 观测项目
处理时间
10d 20d 30d 40d
平均发芽率 /% 58.3 83.3 86.7 86.7
0.05 平均露白率 /% 18.3 3.3 3.3 3.3
平均污染率 /% 0.0 0.0 0.0 1.7
平均发芽率 /% 61.7 75.0 85.0 86.7
0.1 平均露白率 /% 8.3 5.0 3.3 3.3
平均污染率 /% 1.7 1.7 1.7 15.0
平均发芽率 /% 58.3 85.0 91.7 91.7
0.15 平均露白率 /% 16.7 5.0 3.3 5.0
平均污染率 /% 0.0 0.0 0.0 0.0
平均发芽率 /% 65.0 85.0 95.0 96.7
0.2 平均露白率 /% 13.3 3.3 0.0 0.0
平均污染率 /% 0.0 0.0 0.0 0.0
平均发芽率 /% 0.0 5.0 8.3 10.0
0(对照实验)平均露白率 /% 8.3 5.0 3.3 3.3
平均污染率 /% 0.0 0.0 0.0 1.7
表 2　不同生长时期沙床苗外植体接种 15d时污染 、分化结果
Tab.2　Theresultsofpolutionanddiferentiationwith
differentgrowthperiods, sandbedseedlingson15days
时间 实验材料 接种数 /个 污染数 /个 污染率 /% 分化数 /个 诱导率 /%
带子叶茎段 30 7 23.3 19 63.3
30d未带子叶茎段 30 4 13.3 22 73.2
总计 60 11 18.3 41 68.3
带子叶茎段 30 7 23.3 19 63.3
40d未带子叶茎段 30 8 26.7 20 66.7
总计 60 15 25.0 39 65.0
带子叶茎段 30 15 50.0 13 43.3
50d未带子叶茎段 30 14 46.7 15 50.0
总计 60 29 48.3 28 46.7
带子叶茎段 30 20 66.7 9 30.0
60d未带子叶茎段 30 25 83.3 5 16.7
总计 60 45 75.0 14 23.3
低温干藏种子进行不同浓度赤霉素处理后 ,迎春樱种
子发芽率显著提高 ,且随着赤霉素浓度的提高发芽率
逐渐提高 ,以 0.2g/L赤霉素处理过的迎春樱种子发
芽率最好 , 40d时可达 96.7%(如图 1),未经赤霉素
处理的对照实验 ,种子发芽迟缓 ,且发芽率极低 ,据此
说明赤霉素处理可有效打破迎春樱种子的休眠作用 ,
促进其快速萌发.
从表 2实验结果可知 ,具有两片左右真叶的迎春
樱沙床苗于不同生长时期接种在 MS+BA1mg/L+
NAA0.1mg/L培养基上 ,培养 15d时 ,芽的诱导及污
染情况存在差别.光照培养箱培养 30 ～ 40d的迎春
樱沙床苗 ,芽的诱导率较高 ,带子叶外植体和未带子
叶外植体诱导情况近相等;用生长 30、40d的沙床苗
做外植体 ,生长 15d时平均诱导率在分别为 68.3%、
65.0%, 且污染率相对较低 , 平均污染率分别为
18.3%、25.0%;用光照培养箱培养 50d的迎春樱沙
床苗作外植体 ,接种后芽的诱导率开始下降 ,污染率
明显升高;光照培养箱培养 60d的沙床苗作外植体 ,
接种材料培养 15d时污染严重 , 平均污染率达
75.0%.对 MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L培养基培
养一段时间的无菌材料进行相同培养基转接 ,转接后
生长 40d,从叶腋分化出 1 ～ 3个 ,高 2 ～ 3cm的丛芽
(如图 2).
沙床苗是由经过消毒的迎春樱种子发育而成 ,各
部位器官幼嫩 ,且培养条件是在无菌的光照培养箱中
进行 ,获得的材料病菌较少 ,随着培养时间的延长 ,沙
床苗逐渐开始污染 ,光照培养箱培养 30 ～ 40d的迎
春樱沙床苗是较为理想的外植体材料;生长 50 ～ 60d
的迎春樱沙床苗由于自身感染病菌严重 ,作为外植体
接种后污染严重 ,已不适合作外植体材料.
图 1　GA浓度为 0.2g/L的 40d沙床苗 图 2　A处理增殖芽　　　　
Fig.1　ThesandbedseedlingswithGA(0.2g/L)on40days Fig.2　TheproliferationbudswithAtreatment
2.2　不同浓度 GA处理的 MS培养基对迎春樱幼苗分化的影响
GA处理过的 MS培养基可诱导成熟迎春樱种胚形成幼苗 ,不同 GA浓度处理的 MS培养基对迎春樱种
胚苗的诱导存在差别(如表 3), MS+GA0.05g/L培养基对种胚苗的诱导率相对较高 ,为 23.3%;对照实验
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第 3期　　　　　　　　　　　　　南程慧等:迎春樱组培无菌外植体获得方法初探　　　　　　　　　　　　　　　　
中迎春樱种胚苗的诱导率极低 ,仅为 3.3%,明显低于其它处理的诱导率;培养 25d时 ,几种处理种子污染严
重;未萌发种子于 25d时逐渐失去活力 ,丧失萌发能力.
表 3　不同 GA处理 25d时种胚分化结果
Tab.3　Thedifferentiationresultsofembryo
withdifferentconcentrations, GAon25 days
GA处理 接种数 /粒 污染数 /粒 污染率 /% 分化数 /粒 诱导率 /%
MS+GA0.05g/L 60 39 65.0 14 23.3
MS+GA0.1g/L 60 30 50.0 8 13.3
MS+GA0.15g/L 60 38 63.3 8 13.3
MS+GA0.2g/L 60 34 56.7 6 10.0
MS(对照试验) 60 26 43.3 2 3.3
表 4　MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L培养基对迎春樱芽诱导的结果
Tab.4　Theresultsofbuds, inductionwithMS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L
接种日期 接种数 /个 污染率 /% 褐化率 /% 诱导率 /%
2010-05-05 60 4.2 93.0 2.8
2010-06-05 60 80.0 18.9 1.1
2010-07-05 60 94.3 5.7 0.0
2010-08-05 60 25.0 45.0 30.0
表 5　不同处理 40d后芽苗的增殖结果Tab.5　Theresultsofproliferationwithdiferenttreatmenton40 days
处理号 接种数 /个 增殖芽苗总数 /个增殖系数 /%
A 20 44 2.2
B 20 329 16.5
C 20 116 5.8
本实验后期种子污染严重 ,未能很好反映不同浓度
GA的 MS培养基对迎春樱种胚苗诱导率的大小差异 ,但
与对照试验相比 ,赤霉素处理过的 MS培养基可有效打
破迎春樱种子休眠 ,促进其种胚苗的诱导 ,提高诱导率 ,
说明基本的 MS培养基不能有效打破迎春樱种子的休眠
作用 ,赤霉素处理可有效打破迎春樱种子的休眠作用 ,促
进其快速萌发 ,这与沙床苗发芽观测试验结果一致.用此
种方法获得的无菌苗进行芽的诱导 ,诱导率在 90%以
上.
2.3　迎春樱茎段外植体芽的诱导
由表 4可知 ,接种于 MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L培养基上的迎春樱带腋芽嫩枝茎段 ,培养 25d时观
测发现 ,芽的诱导率均较低 , 5月份芽的诱导率为 2.8%, 6月份为 1.1%, 7月份为 0;5月份接种材料污染率
较低 ,但褐化率高 ,为 93.0%, 6、7月份接种材
料的污染率明显提高 ,分为 80.0 %、94.3%,
褐化率也因此下降 ,分别为 18.9%、5.7%.8
月份诱导率为 30.0%,诱导丛芽发生茎段均
为带顶芽的材料 ,当年生带腋芽茎段未有丛芽
发生 ,污染 、褐化材料均为带腋芽茎段.
迎春樱枝叶幼时毛被明显 ,叶缘腺体分泌
粘液 ,易沾染病菌 , 5、6、7、8月份获得的带腋芽茎段外植体难以像钟花樱 、野生早樱一样获得较好的丛芽诱
导效果 ,褐化率 、污染率较高 ,不适宜作为芽诱导的外植体材料.而正在生长的带顶芽茎段 8月份尚能有效诱
导丛芽发生 ,说明迎春樱的丛芽发生与外植体的幼嫩程度有关 ,带顶芽茎段可作为迎春樱的外植体材料.
2.4　迎春樱丛芽增殖培养
将前两种试验方法获得的无菌材料分别进行继代转接 ,其中一处理转接至 MS+BA1mg/L+NAA0.1
mg/L培养基上 ,培养 40d时进行观测记录 ,记为处理 A;另一种先转接至 MS+BA6mg/L+NAA0.05mg/L的
培养基上培养 10d后 ,再转接至 MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L培养基上 , 30d时观测记录分化结果 ,记为
处理 B;第三种直接种至 MS+BA6mg/L+NAA0.05mg/L培养基上 , 40d时观测记录诱导分化结果 ,记为处
理 C.
由表 5可知 , A处理增殖系数最小 ,为 2.2%,增殖芽数
量少 ,但芽苗叶形正常 ,生长健壮(如图 2);B处理增殖系数
最大 ,达 16.5%,增殖芽苗数量极多 ,但部分芽苗成莲座状 ,
叶片卷缩(如图 3);C处理芽苗介于 A、B之间 ,增殖系数为
5.8,增殖芽叶腋处又有丛芽 ,芽苗前期生长较快 ,后期生长缓
慢 ,芽苗较生长较弱 ,叶片浅黄绿色(如图 4).
3种处理均能不同程度诱导分化出丛芽 ,说明迎春樱丛芽的增殖诱导相对较容易;B处理中 ,前期培养
基中 BA含量较高 ,后期降低 ,增殖芽数最多 ,据此推测前期高浓度的 BA刺激对迎春樱丛芽的诱导有利;C
处理前期芽苗增殖明显 ,后期芽苗生长变弱 ,叶色发黄 ,据此推测含有高浓度 BA的 MS培养基 ,对迎春樱丛
芽的诱导有利 ,但对其正常生长不利.因此 ,迎春樱丛芽的诱导可采用前期高浓度的 BA刺激诱导丛芽 ,后期
减少 BA含量进行增殖壮苗的方法来诱导分化.
3　结论与讨论
低温干藏可有效保存迎春樱种子 ,但不能有效打破其休眠;不同浓度赤霉素浸泡 6h的迎春樱种子于沙
床培养 40d后 ,以 0.2g/L浸泡过的种子发芽率最高 ,达 96.7%;接种于含有不同浓度赤霉素的 MS培养基
上的迎春樱种子 ,可有效诱导出完整幼苗 ,但此种方法污染率高 ,诱导率低;两种赤霉素处理方法均说明迎春
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　 　 　　第 28卷
樱种子具有休眠作用 ,赤霉素处理可有效打破迎春樱种子的休眠作用 ,促进其快速萌发.
图 3　B处理增殖芽 图 4　C处理增殖芽
Fig.3　TheproliferationbudswithBtreatment Fig.4　TheproliferationbudswithBtreatment
3种外植体获得方法中 ,以光照培养箱培养 30 ～ 40d的迎春樱沙床苗作为位外植体最为理想 ,平均诱
导率为 65.0% ～ 68.3%;不同浓度 GA处理的 MS培养基诱导形成的无菌苗 ,由此种方法形成的无菌苗进行
芽的诱导 ,诱导率在 90%以上 ,污染极少 ,但此种方法前期无菌苗难以获得 ,诱导无菌苗时污染严重 ,启动困
难 ,浪费种子及培养基;用当年生嫩枝的带腋芽茎段为外植体 ,诱导率最低 ,污染严重 ,不宜作为组培外植体
材料 ,而以当年生带顶芽幼嫩茎段为外植体 ,芽的诱导发生容易 ,为理想的外植体取材部位.
本实验 B处理具有较高的增殖系数 ,丛芽诱导显著 ,因此 ,迎春樱丛芽的诱导可采用前期高浓度的 BA
刺激诱导丛芽 ,后期减少 BA含量进行增殖壮苗的方法来诱导分化 ,具体的激素配比还需进一步的研究.
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第 3期　　　　　　　　　　　　　南程慧等:迎春樱组培无菌外植体获得方法初探