全 文 ：·基础研究 ·
孔石莼凝集素蛋白基因的克隆与表达＊
郑璐平a, b, 谢荔岩a, 姚锦爱a, 钟伏弟a, 林奇英a, 吴祖建a, b＊ , 谢联辉a, b＊
(福建农林大学　a.病毒研究所;b.生物农药与化学生物学教育部重点实验室 , 福建 福州 350002)
摘　要:根据孔石莼(Ulvapertusa)凝集素(Lectin)蛋白 cDNA全长序列(GenBank登录号:AY433960)设计引
物 ,以其总 DNA为模板 , 采用 PCR技术扩增蛋白 DNA序列 , 经克隆 、测序获得基因序列。结果表明 , 孔石莼凝
集素蛋白(UPL)基因序列长约为 670 bp, 含有一个大小为 56 bp的内含子。此外 , 设计带酶切位点的引物 , 以
UPL-cDNA为模板 , 扩增其开放阅读框 ,并与表达载体 pGEX-2T连接 , 构建原核表达载体 pG2T-UPL, 并在大肠杆
菌 BL21(DE3)中成功表达大小约为 47 kD的目的蛋白。
关键词:孔石莼;凝集素;cDNA;基因克隆;原核表达
中图分类号:Q786
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2008)06-0762-06
CloningandExpressionofLectinGeneofUlvapertusa
ZHENGLu-pinga, b, XIELi-yana, YAOJin-aia, ZHONGFu-dia,
LINQi-yinga, WUZu-jiana, b＊ , XIELian-huia, b＊
(FujianAgricultureandForestryUniversitya.InstituteofPlantVirology;b.KeyLaboratoryof
BiopesticideandChemicalBiology, MinistryofEducation, Fuzhou350002, Fujian, China)
Abstract:BasedontheknowncDNAsequenceoflectinproteingeneofU.pertusa(GenBankaccessionnumber:
AY433960), apairofprimersweredesignedandusedtoclone, andsequencethelectinproteingenewithPCRtech-
niquebyusingthegenomicDNAofU.pertusaasthetemplate.Theresultsshowedthatthelectinproteingeneconsisted
of670 bp, witha56 bpintron.ApairofprimerswithrestrictionenzymesitesweredesignedtoamplifytheORFusing
thegenomiccDNAofU.pertusaasthetemplate.TheORFwasinsertedintotheexpressionvectorpGEX-2Tandapro-
teinwithmolecularweightof47 kDwassuccessfulyexpressedinEscherichiacoliBL21(DE3).
Keywords:Ulvapertusa;Lectin;cDNA;genecloning;prokaryoticexpression
　　凝集素(Lectin)是一类非免疫起源 、非酶的 、可
促使细胞凝集的蛋白或糖蛋白 ,其分子中含有一个
或多个可与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化的结
构域 ,对糖 、糖脂 、糖蛋白具有高度亲和性 ,并能专一
结合 [ 1] 。目前 ,凝集素已被应用于免疫学 、肿瘤 、生
殖生理和细胞生物学等诸多方面。
海藻石莼属作为一种潜在的 、可开发性的凝集
素来源 ,人们对石莼 (Ulvalectuca)凝集素进行了分
离纯化及部分性质研究 [ 2] ,而孔石莼(U.pertusa)作
为绿藻石莼属的一种 ,其资源十分丰富。 Hori[ 3]对日
第 17卷第 6期
2008年 12月 　　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA　　　　　　　　　　　Vol.17 No.6Dec.2008
＊ 收稿日期:2008-02-20;修回日期:2008-06-12
基金项目:福建省科技厅重大项目(2000H004, 2001Z127)
作者简介:郑璐平(1983— ),女 ,硕士 ,实习研究员 ,主要从事植物病毒学研究 。(电话)0591-83769704;(电子邮箱)
lupingz@126.com
＊通讯作者:吴祖建 , (电子邮箱)wuzujian@126.com;谢联辉 , (电子邮箱)fjxlh@126.com
本海域 53种海藻凝集素活力研究发现 ,孔石莼等 14
种海藻凝集素对兔 、马 、绵羊 、鸭 、鸡 、人 (A、B、O、
AB)的红细胞有血凝活力 ,但未进行相关性质的研
究 ;Rogers[ 4]报道了唾液糖蛋白对孔石莼凝集素活性
具有抑制作用;王盛等 [ 5]对福建沿海部分海藻进行
了筛选 ,并对绿藻孔石莼凝集素的性质 、活性和分离
纯化等进行了较为详细的研究 ,发现该凝集素蛋白
具有抗烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)特
性 ,该蛋白在 pH 6.0 ～ pH8.0范围内活性较高 ,
80 ℃仍可保持 50 %的活性 ,具有较高的热稳定性 。
与陆生植物凝集素不同 ,其凝集活性可被一些蛋白
质所抑制 ,对植物病毒 TMV抗性机制也可能与对病
毒粒体的凝集作用有关 ,并对纯化的蛋白进行了 N
端序列测定 ,发现可能是一种新的凝集素。此外 ,王
盛等 [ 6]还首次克隆获得孔石莼凝集素 cDNA全长序
列 (GenBank登录号:AY433960),为 1 084 bp,其中
起始密码子上游 5 非编码区为 124 bp,编码区 612
bp,编码 203个氨基酸 ,在终止密码子下游 ,还包含
有长 348个碱基的 3非编码区 ,其中包括 22个腺苷
酸的 poly(A),但是孔石莼凝集素 (UPL)的基因结
构 、功能位点等方面的许多问题尚不清楚。因此 ,在
此基础上 ,本研究进一步扩增孔石莼凝集素的蛋白
基因 ,并进行表达 ,以期为凝集素的结构和功能研究
提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　供试菌种和海藻
供试海藻孔石莼采自莆田沿海 ,采回后用清水
洗去藻体表面附生物 ,编号分装后置于 -70℃保存备
用 。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21(DE3)由
本所保存 。
1.2　酶和试剂
限制性内切酶及其它工具酶 、总 RNA抽提试剂
盒购自上海生工生物工程有限公司 , DNA提取试剂
盒为杭州维特洁生物技术有限公司产品 ,克隆载体
pMD18-TVectorSystems为大连宝生物公司产品 ,表
达载体 pGEX-2T购于 Promega公司。
1.3　孔石莼凝集素总 RNA和总 DNA的提取
提取方法参照总 RNA抽提试剂盒说明书和
DNA提取试剂盒说明书。
1.4　PCR鉴定
根据孔石莼凝集素 (UPL)cDNA序列 ,设计合成
引物 ,用于 PCR扩增 , PCR所用引物如表 1。
表 1　研究中所用到的引物
Tab.1　Primersusedinthisstudy
引物名称
PrimersName
引物序列
PrimerSequences
酶切位点
RESite
重组子
Constructs
UPL-D1(-118+)
UPL-D2(-749-)
UPL-EP4(-124+)
UPL-EP5(-737-)
5 -CGCAAGCATGATCAACATCCTTC-3
5 -TACAGCCATGGCCTTATCCAGGT-3
5 -GCGGATCCATGATCAACATCCTTCATGTG-3
5 -GCGAATTCTTATCCAGGTCGGGGGTGAT-3
BamHI
EcoRⅠ
pMD18T-UPL-D12
pG2T-UPL-EP45
1.4.1　凝集素 DNA片断(UPL-D12)的 PCR扩增
取 1 μLDNA模板 ,引物 UPL-D1、UPL-D2各 2 μL,
TaqDNA聚 合 酶 0.5 μL, dNTPs(10 mmol/L)
0.5 μL, 10 ×PCR缓冲液 2.0 μL, 加无菌水至总体
积为 20 μL。
PCR扩增条件:95 ℃预变性 4 min, 按程序
(95 ℃ 45 s, 58 ℃ 60 s, 72 ℃ 100 s)扩增 30个循
环 , 72 ℃延伸 10 min,冷却至室温。
1.4.2　UPL蛋白(UPL-EP45)基因的 PCR扩增　
cDNA的合成:取 UPL-RNA3 μL, 与 1 μL3端引物
UPL-EP4 (10 pmol/L)混合 , 95 ℃水浴处理 7 min,
迅速冰浴 5 min, 再加入 5 ×MuLV反转录酶缓冲液
2.5 μL, 10 mmol/LdNTPs0.5 μL, M-MuLV反转录
酶 0.5 μL, RNasin0.5 μL, 无菌水 4.0 μL, 37 ℃水
浴处理 90 min, 95 ℃水浴 3 min。
PCR反应 :取 1 μLcDNA模板 , 引物 UPL-EP4、
UPL-EP5各 2 μL, TaqDNA聚合酶 0.5 μL, dNTPs
(10 mmol/L)0.5 μL, 10 ×PCR缓冲液 2.0 μL, 加
无菌水至总体积为 20 μL。
PCR扩增条件 :95 ℃预变性 4 min, 按程序
(95 ℃ 60 s, 55 ℃ 60 s, 72 ℃ 90 s)扩增 30个循环 ,
72 ℃延伸 10 min,冷却至室温 。
1.5　克隆与测序
将上述两 个 PCR产物回收 , 并与克隆 载体
763第 6期　　　　　　　　　　　　郑璐平等:孔石莼凝集素蛋白基因的克隆与表达　　　　　　　　　　　
pMD18-T进行连接 、转化 ,得到重组质粒 pMD18T-
UPL-D12和 pMD18T-UPL-EP45,序列由上海博亚生
物技术有限公司测定。
1.6　UPL蛋白基因在大肠杆菌 BL21中的表达
重 组 质 粒 pMD18-T-UPL-EP45 经 EcoRⅠ 和
BamHⅠ双酶切 ,与经同样处理的表达载体 pGEX-2T
连接 ,转化 E.coliDH5α,筛选得到重组质粒 pG2T-
UPL-EP45 ,将质粒转入 BL21中 ,从转化平板上挑取
含重组质粒的菌落 ,接种于含 100 μg/mLAmp的 LB
液体培养基中 , 37 ℃振荡培养至 OD600 =0.6左右 。
培养液中加入 IPTG至终浓度为 1 mmol/L,继续振荡
培养 3 h。取 1mL菌液于 Eppendorf管中 ,在台式微
量离心机上 13 000 r/min离心 1 min。收集菌体 ,悬
浮于 50 μL10 mmol/LTris-HCl, pH8.0缓冲液中。
取适量蛋白上样溶液 ,加适量 2 ×SDS-PAGE上
样缓冲液 ,混匀后于 100 ℃加热 3 min,上样电泳 。
电泳条件为 :5 %的浓缩胶 , 13 %分离胶 ,电泳缓冲
液为 Tris-甘氨酸缓冲液 ,恒压 200 V, 电泳至溴酚兰
指示剂离凝胶底部 2 cm左右停止电泳 。电泳结束
后 ,用考马斯亮蓝染色液染色 ,脱色液脱色后的凝胶
在 IS-1000数据成像系统中处理。
2　结果与分析
2.1　UPL-DNA的序列
2.1.1　凝集素蛋白 DNA序列(UPL-D12)的 PCR
扩增与克隆　以 UPL总 DNA为模板 , UPL-D1/UPL-
D2为引物 ,扩增目的基因 ,结果如图 1所示 ,发现泳
道 1有一条大小约为 670 bp特异性条带 ,与预计的
目的片断大小一致。将该片断回收 ,连接到 pMD-
18T载体上 ,该载体大小为 2 692 bp,插入目的片断 ,
获得重组质粒 pMD18T-UPL-D12,大小为 3 362 bp,
将其进行 BamHⅠ /HindⅢ双酶切 ,酶切产物大小应为
670 bp。结果如图 2所示 ,其中泳道 1和泳道 2为两
个不同的重组质粒 ,酶切后 ,发现泳道 2有大小为
670 bp的条带 ,说明该质粒是含有插入目的片断的
重组子 ,而泳道 1的重组质粒未成功插入目的片断。
2.1.2　凝集素蛋白的 DNA序列分析　应用生物
学分析软件 DNAMAN,对凝集素蛋白 DNA序列与
cDNA序列 (GenBank登录号:AY433960)进行比较
分析(上行为 cDNA序列 ,下行为 DNA序列 ),发现
凝集素蛋白存在一个 56 bp长的内含子 (图 3,斜体
为 ORF序列)。
2.2　UPL蛋白基因(UPL-EP45)的扩增与克隆
以 cDNA为模板 , UPL-EP4 /UPL-EP5为引物 ,扩
增 UPLORF基因 ,结果如图 4所示 ,泳道 1、2均有大
小约 630 bp特异性的染色带 ,与预计的目的片断大
小一致 。将该 产物回 收 , 连 接到 pMD18-T载 体
上 , pMD-18T大小为 2 692 bp,插入目的片断 , 获得
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重组质粒 pMD18-T-UPL-EP45,大小为 3 322 bp,将其
进行 BamHⅠ /EcoRⅠ双酶切 ,酶切产物大小应为 630
bp,结果如图 5泳道 2所示 ,并通过测序证明序列的
正确性。将该重组质粒用 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切 ,
M:蛋白质 markers;1, 3:重组菌 BL21/pG-UPL-EP45未诱
导;2, 4:重组菌 BL21/pG-UPL-EP45经 IPTG诱导
M:Proteinmolecularweightmarker;1, 3:uninducedrecombi-
nantstraininBL21/pG-UPL-EP45;2, 4:recombinantstrainin
BL21/pG-UPL-EP45 inducedbyIPTG
图 6　SDS-PAGE电泳
Fig.6　SDS-PAGEanalysisforfusionprotein
再与经同样处理的表达载体 pGEX-2T连接 , pGEX-
2T大小为 4 948 bp,插入大小约为 630 bp的片断后 ,
得到重组质粒 pG2T-UPL-EP45,大小为 5 578 bp,对
其进行双酶切鉴定 ,酶切产物大小应为 620 bp,结果
如图 5所示 ,泳道 1的质粒经酶切后大小为 620 bp,
证明目的片断准确插入到 pGEX-2T上 ,说明表达载
体构建成功。
2.3　融合蛋白的诱导表达
将重组表达载体转入 BL21(DE3)中 ,从转化平
板上挑取含重组质粒的菌落 ,进行诱导表达 , 由
pGEX-2T驱动表达的融合蛋白前半部为质粒本身编
码的谷胱甘肽转移酶 (GST),后半部为外源基因编
码的蛋白 。 GST蛋白分子量为 26 kD,而外源基因编
码的蛋白分子量约为 21 kD,故融合蛋白的分子量约
为 47 kD。结果如图 6所示 ,在目的大小的蛋白条带
处 ,诱导后比诱导前的染色明显加深了 。选取其中
一个表达菌株 ,对质粒进行序列测定 ,结果表明外源
基因准确地插入到载体的 BamHⅠ /EcoRⅠ位点 ,这说
明外源基因在大肠杆菌中实现了融合表达 。
3　讨论
自从雪花莲凝集素 (galanthusnivalisagglutinin,
GNA)被首次发现是植物生长调节的凝集素 ,它对叶
766　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 17卷
蝉 、蚜虫等同翅目害虫及线虫均有很好的毒杀作用 ,
对咀嚼式口器的害虫也有中等毒杀作用 [ 7-8] 。近年
的研究表明 ,许多植物凝集素对鳞翅目 、同翅目等害
虫及棉枯萎病菌 、绿色木霉等真菌和某些细菌也有
很好的防治作用 [ 9-10] ,凝集素被应用于抗病虫基因
工程 ,为抗病虫育种提供了新的途径 。本研究根据
凝集素蛋白 cDNA序列设计引物 ,保证了样品的一致
性 ,并成功得到相应的基因组 DNA序列。通过生物
信息软件对该序列与 cDNA序列进行对比分析 ,发现
凝集素蛋白含有一个大小为 56 bp的内含子 ,可能存
在两个功能结构域 ,为凝集素结构域拼接 、功能的预
测 、分析和研究提供理论依据。
同时 ,根据 UPL的 ORF序列设计引物 ,以 UPL-
cDNA为模板 ,扩增凝集素蛋白基因 ,并将其与表达
融合蛋白的 pGEX-2T载体连接 ,构建了原核表达体
系 ,在 37 ℃经 IPTG诱导得到大小为 47 kD的蛋白 ,
诱导时间以 2 h～ 3 h为佳。这为凝集素表达蛋白活
性的测定 ,筛选更高活性 、低毒性的功能蛋白打下了
基础 ,同时 ,为通过转基因途径来研究凝集素的抗
病 、抗虫的研究提供了良好的渠道 。
目前 ,对海藻的研究仍较为薄弱 ,主要问题是 :
一是海藻样品采集的不便 ,多数海藻的生物量不是
很大 ,且生长具有季节性 ,因此在研究材料的选择上
就有较高的要求 。二是相当于陆生植物叶 、茎中含
量的水平 ,海藻凝集素的收率就比较低 ,加上纯化方
法上的困难 ,限制了后面诸如理化性质 、生理功能及
应用的研究。因此 ,目前关于孔石莼凝集素的研究
仍是很有限 ,还有许多方面值得深入研究 ,如对表达
产物进行纯化以及进行抗血清的制备等 ,至于其基
因结构 、基因功能更值得探讨。因此 ,我们将进一步
克隆它的启动子并对其结构和功能进行研究 ,以及
对孔石莼凝集素蛋白进行重组改造研究并测定表达
蛋白的活性 ,以筛选更高活性蛋白 。
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