全 文 ：一种快速纯化相思子凝集素的方法
李小兵1 , 谢光洪1 , 张加力2 , 杨连玉2 , 张乃生1 , 王　哲1
(1.吉林大学畜牧兽医学院 ,长春 130062;2.吉林农业大学动物科技学院 ,长春 130118)
摘　要:介绍了一种快速提取 、纯化相思子凝集素(Abrus agglutinin , AGG)的方法。以 Sepharose 6B(琼脂糖凝
胶)为亲和层析介质 , 结合Hiload 26/60 Superdex 75 凝胶层析柱 ,粗提物经 2步层析分离纯化 , 获得了高纯度
的AGG。 SDS-PAGE 电泳时其相对分子量约为 65.4 kD , 凝集兔红细胞的最小浓度约为 0.5 μg/mL , LD50为
3.6 mg/ kg。采用该方法可从相思豆中快速制备高纯度 AGG。
关键词:相思子凝集素;纯化;亲和层析;凝胶过滤
中图分类号:R392.2;Q949.751.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2008)03-0272-04
A Rapid Purification Method for Abrus Agglutinin
LI Xiao-bing1 , XIE Guang-hong1 , ZHANG Jia-li2 , YANG Lian-yu2 , ZHANG Nai-sheng1 , WANG
Zhe
1
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine , Jilin University , Changchun 130062 , China ;
2.College of Animal Science and Technology , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , Chi-
na)
Abstract:A rapidmethod for extracting and purifying abrus agglutinin from jequirity bean was presented.
Sepharose 6B affinity column and Hiload 26/60 Superdex 75 gel chromatography columnwere used to ob-
tain highly pure abrus agglutinin from the crude extracts of jequirity beans.The relative molecular weight
of abrus agglutinin ,measured by SDS-PAGE , was about 65.4 kD.The LD50 value was 3.6 mg/kg , and
it can agglutinate rabbit red cell at 0.5 μg/mL.This could be an optional method for the purification of
abrus agglutinin from abrus jequirity beans.
Key words:abrus agglutinin;purification;affinity chromatography;gel filtration
　　相思子凝集素(AGG)是存在于豆科植物相思
子(Abrus precatorius L.)种子(相思豆)中的一种低
毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP),小鼠半数致死量
(LD50)为 5 mg/kg , 毒性明显低于相思子毒素
(abrin , LD50=20μg/kg)[ 1-2] 。完整AGG的分子量
约为 134 kD ,是由 2条 A 链(AGG-A)和 2条 B链
(AGG-B)通过二硫键连接构成的异四聚体[ 1 ,3] 。
AGG的毒性不到 abrin的 1/100 ,但却具有与 abrin
相似的抗肿瘤活性 ,用 AGG制备免疫毒素(IT)可
望有更高的安全性[ 4-5] 。此外 , AGG 在非特异性
免疫治疗 、细胞表面糖链结构研究 、探索细胞发
育 、衰老 、分化 、癌变细胞膜上糖链的变化等方面
也有广泛用途[ 5-6] 。高纯度的 AGG 对于其活性及
应用研究具有十分重要的意义 。为此 ,本研究选
用Sepharose 6B作为亲和层析介质 ,以具有更高分
辨力的 Superdex 75 预装柱作凝胶过滤层析 ,探讨
一种快速制备高纯度 AGG的方法。

通讯作者
基金项目:吉林大学博士科研启动基金项目(2006)
作者简介:李小兵 ,男 ,博士 ,讲师 ,研究方向:动物营养代谢病与中毒病 ,动物影像诊断技术。
收稿日期:2007-04-26　　修回日期:2007-11-10
吉林农业大学学报　2008 ,30(3):272 ～ 275 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验材料　相思豆购自云南昆明云南农
业大学附近农贸市场 ,经云南植物研究所鉴定为
豆科藤本植物相思子(Abrus precatorius L.)的种
子 ,即相思豆。
兔红细胞由吉林大学农学部畜牧兽医学院营
养代谢病研究室分离制备;abrin-a由吉林大学农
学部畜牧兽医学院营养代谢病研究室提纯并经上
海基康生物公司质谱鉴定确认 。
1.1.2　主要试剂 　Sepharose 6B 琼脂糖凝胶 、
Hiload 26/60 Superdex 75凝胶过滤预装柱 ,Amer-
sham Phamacia公司产品;丙烯酰胺 、甲叉双丙烯酰
胺 、低分子量标准蛋白 、β-巯基乙醇 、D-半乳糖均
为Sigma 公司产品;BCA 蛋白总量测定试剂盒 ,
Pierce公司产品;试验用水为超纯水;其它试剂为
进口分装或国产分析纯。
1.1.3　仪器 　核酸蛋白纯化装置 ,上海青蒲沪
西仪器厂;核酸蛋白检测仪 , Backman DU -640
型;电泳仪及垂直板电泳槽 ,Bio-Rad公司产品。
1.2　方法
1.2.1　制备粗毒　参照文献[ 2 , 5]方法 ,相思豆
去壳 ,取种仁 100 g ,于 500 mL 50 g/L冷醋酸溶液
中4℃浸泡过夜 ,以 1万 r/min匀浆后 ,置 4 ℃冰
箱1 h ,脱脂纱布滤去残渣 ,1万×g 低温(4℃)离
心20 min ,上清用(NH4)2SO4 分级沉淀 ,取 35%～
95%饱和度(NH4)2SO4 分级分离 ,所得沉淀溶于
少量 5 mmol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)中 ,透析除盐 ,
上清液即为AGG与 abrin粗提物。
1.2.2　纯化方法　在文献[ 1-2 , 4]方法基础上略
作改进 。Sepharose 6B琼脂糖凝胶亲和柱用 PBS
(5 mmol/L ,含 0.2 mol/L NaCl , pH 8.0)充分平衡
后 ,将粗提物以 1 mL/min 的速度上样 ,上样完毕
再以上述平衡用 PBS洗脱 ,直至 OD值低于 0.05 ,
换用含 0.2 mol/L D-半乳糖的 PBS 洗脱 ,收集蛋
白峰 ,PEG20000浓缩后再对10 mmol/L PB透析除
去盐和 D-半乳糖 。取透析产物以 0.5 mL/min上
样于 Superdex 75 凝胶层析柱 ,以上述 PBS 洗脱 ,
按蛋白峰收集 ,用 PEG20000浓缩后透析脱盐 ,小
量分装后-20 ℃冻存 。
1.2.3　SDS-PAGE分析及相对分子量测定　参
照文献[ 7] 方法 ,按 Laemmli 不连续缓冲液系统
SDS-PAGE电泳 ,积层胶浓度为 50 g/L ,分离胶
浓度为 120 g/L ,AGG 及 abrin-a 用含 β-巯基乙醇
的加样缓冲液处理 2 h 后 ,分别与未经 β-巯基乙
醇处理的 AGG 及 abrin-a 作 SDS -PAGE 电泳分
析 ,以 Fairbanks[ 8]报道的方法测定相对分子量。
1.2.4　毒性测定　昆明种小白鼠 36只 ,雌雄各
半 ,体重(18±2)g ,随机设置 6 个剂量组:1.0 ,
2.5 ,5.0 ,7.5 ,10.0 ,15.0 mg/kg ,每组 6只鼠 ,毒素
用生理盐水配成 ,腹腔注射后连续观察 7 d ,试验
结果用药理学改良寇氏法[ 9]计算 LD50 。
1.2.5　血凝活性测定　按照文献[ 10]方法制备
兔红细胞悬液 ,并在 96 孔“V”型血凝板上测定
AGG血凝活性 。AGG(1 mg/mL)用磷酸盐缓冲
液—生理盐水倍比稀释后 ,各取 25 μL 加入血凝
板 ,再加入 2%兔红细胞悬浮液 25 μL ,振荡混匀
后室温放置1.5 ～ 2.0 h ,肉眼观察血凝情况 。
1.2.6　浓度测定　采用 BCA蛋白质总量测定试
剂盒 ,以标准试管法测定 AGG 的浓度 。测得的数
据以 SPSS软件进行分析 ,以吸光度值为横坐标 、
蛋白质浓度为纵坐标绘制标准曲线并拟合回归方
程 ,根据吸光度值计算AGG的浓度。
2　结　果
2.1　相思子凝集素纯化结果
Sepharose 6B亲和层析产物经过10mmol/L的
PBS充分平衡后 ,经 Superdex 75凝胶过滤分离得
到 1个明显的蛋白峰(F1)和 1个较小的蛋白峰
(F2)(图 1)。SDS-PAGE 电泳分析结果表明:F1
在变性SDS-PAGE电泳时仅有 1条带 ,经 β-二巯
基乙醇处理后 F1分解成 2条带(图 2:1.粗提物
经 Sepharose 6B 琼脂糖凝胶亲和层析产物;
2.abrin-a;3.未经 β-二巯基乙醇处理的 F1;
4.蛋白质Marker;5.经 β-二巯基乙醇处理后的
F1;6.abrin-a)。
图 1　凝胶过滤洗脱曲线
Fig.1.Elution curve of gel filtration
273李小兵等:一种快速纯化相思子凝集素的方法
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
图 2　纯化产物 SDS-PAGE分析
Fig.2.SDS - PAGE analysis of purification products
2.2　分子量测定结果
参照文献[ 8]报道的方法 ,蛋白质 Marker 及
样品经SDS-PAGE电泳分离后 ,以标准蛋白质相
对分子量的对数值为纵坐标 、迁移率为横坐标 ,用
SPSS软件进行分析 , 得回归方程:Y =5.018 -
0.955X , R=0.980 1。根据多肽链迁移率 ,计算出
此时 F1的相对分子量为 65.4 kD ,经 β-巯基乙醇
处理后 , 得到相对分子量分别为 32.2 kD 和
34.5 kD 的 2 条多肽链 , 与文献报道的相思子
AGG的分子量相似[ 2-3] 。
2.3　毒性试验结果
第1 ～ 2 d 小白鼠行为未见明显异常 ,第 3 d
剂量大的动物静卧 ,精神沉郁 ,眼睑下垂 ,严重者
闭眼 ,持续 12 ～ 24 h死亡。较低剂量组出现症状
较晚 ,一般在第 5 d出现 ,以后陆续死亡 ,注射毒
素后 3 ～ 6 d为死亡高峰期 , 7 d内未死亡的小白
鼠可 以恢 复。经 改 良寇 氏法 计 算 LD50 为
3.6 mg/kg ,明显低于 abrin毒性 ,而与相思子 AGG
毒性相似[ 1] 。
2.4　血凝活性测定结果
测定结果表明 , F1 作 1∶2 048 倍稀释(约
0.5 μg/mL)后 ,仍可凝集兔红细胞(表 1),血凝活
性明显高于 abrin ,而与文献报道的相思子AGG血
凝活性相似[ 2] 。
表 1　AGG血凝活性的测定
Table 1.Hemagglutination activity of abrus AGG
稀释倍数
Dilution multiple
1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1 024 1∶2 048 1∶4 096
AGG + + + + + + + + -
2.5　BCA法浓度测定结果
经 SPSS 软件分析 , 得曲线回归方程:Y =
634.35X +83.42X2 , R2 =0.999 8。将样品管
OD562 nm值代入曲线回归方程后 ,计算出所纯化得
到的AGG浓度为 3.15 mg/mL。
3　讨　论
Sepharose 6B与 Sepharose 4B同为传统的偶联
琼脂糖介质。因其具有疏松的网状结构 、亲水性
强 、理化性质稳定 、非特异性吸附极低 、回收率高
等优点 ,常被用作凝胶过滤介质 ,也是良好的亲和
层析载体。相比之下 ,Sepharose 6B含糖浓度相对
较高 ,结构相对致密 ,有更大的吸附容量和分离范
围。此外 ,由于 abrin 及 AGG 对半乳糖及半乳糖
类似物有特殊的亲和力 , 可与 Sepharose 6B 或
Sepharose 4B的糖基结合 。正是利用这个特性 ,在
早期 AGG 或 abrin 纯化时 , 大多首 先采用
Sepharose 4B进行亲和层析 ,然后再结合 DEAE-
Cellulose离子交换层析和 Sephadex G -150 或
SephadexG-100等凝胶过滤层析进一步分离纯
化 ,通常需要 34 步才能得到较纯的 AGG。李丽
琴[ 11]采用酸化 Sepharose 4B 亲和层析和 DEAE-
Sepharose FF 阴离子交换层析 2 步法得到 2 种
abrin(P1 、P2)和 1种AGG(P3),方法明显简化 ,但
由于离子交换层析特异性相对较差 ,所制备的
AGG纯度尚有待提高 。Liu[ 1] 、Tahir[ 12] 等人分别
在Sepharose 4B和Sepharose 6B 亲和层析之后 ,进
一步采用 Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化 ,制
备得到纯度较高的AGG 。
本研究采用在 Sephares 6B琼脂糖亲和层析
后 ,结合高分辨力的Hiload 26/60 Superdex 75预装
柱凝胶过滤层析 ,从相思豆中成功分离到一种纯
度较高的大分子蛋白 F1。SDS-PAGE电泳时 ,未
经 β-巯基乙醇处理的 F1 的相对分子量为
65.4 kD ,而经 β-巯基乙醇处理后分解为 2个相对
分子量分别为 32.2 kD和 34.5 kD的多肽链 ,与文
274　　　吉林农业大学学报　2008年 6月
Journal of Jilin Agricultural University 2008 , June
献报道的 AGG 相符[ 2-3] 。提示 SDS-PAGE 电泳
时 ,受十二烷基磺酸钠(SDS)影响 ,异四聚体结构
的AGG二硫键被部分打开 ,以类似 abrin的异二
聚体(由 1条 AGG-A链和 1 条AGG-B链构成)形
式存在 。AGG 经 β-巯基乙醇处理后分子中二硫
链被完全解开 ,分解为2条AGG-A链和2条AGG-
B 链 。此外 , 较低的小鼠急性毒性(LD50 =
3.6 mg/kg)及较高的血凝活性(0.5 μg/mL)也与
文献报道的相思子AGG性质相符[ 1-3] ,表明 F1即
为目标蛋白 AGG。由此可见 ,采用 Sepharose 6B
亲和层析和 Superdex 75凝胶过滤层析 2步法 ,可
从相思豆中快速制备得到高纯度的相思子AGG。
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(上接第 258页)
谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨)分
析 ,籽粒含粗蛋白质 10.71%, 粗脂肪 4.66%,粗
淀粉 70.77%,赖氨酸 0.26%,容重 745 g/L。
4　栽培制种要点及适种范围
4.1　栽培制种要点
在北方春玉米区一般 4月下旬播种 ,选择中
等肥力以上地块种植。该品种为稀植型品种 ,适
宜种植密度 4.5 ～ 5.0万株/hm2。施足农家肥 ,种
肥一般施用磷酸二铵 150 ～ 200 kg/hm2 ,硫酸钾
100 ～ 150 kg/hm2 ,尿素50 ～ 100 kg/hm2 ,大喇叭口
期追施尿素300 kg/hm2 。
4.2　适种范围
该品种抗性突出 ,适应性广 ,吉林省吉林 、白
城 、通化 、延边等中早熟区域均可种植。
参考文献:
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275李小兵等:一种快速纯化相思子凝集素的方法
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University