全 文 ：培养基 、BA和复合添加物对
大花蕙兰增殖和分化的影响
刘明志 , 朱京育
(暨南大学生物工程学系 , 广东 广州 510632)
[ 摘 要] 研究了大花蕙兰在 KC(Kundson C)和White 培养基上 , 通过使用不同质量浓度 BA(0、
0.4、 1.0 mg/ L)与香蕉匀浆汁 、马铃薯匀浆汁 、胰蛋白胨和酵母提取物 4 种复合添加物的组合对大
花蕙兰原球茎增殖量和分化率的影响.结果表明 ,在原球茎增殖和分化方面 , KC 培养基明显优于
White培养基;在 KC 培养基上 , BA 对原球茎增殖和分化没有明显的促进作用 , 在White 培养基上
BA对原球茎增殖没有促进作用 ,但对原球茎分化具有一定程度的促进作用;4种复合添加物在 KC
和White 培养基上对原球茎增殖具有明显不同的作用 , 其中香蕉匀浆物的效果最好.4 种复合添加
物在KC 培养基上对原球茎分化无明显促进作用 , 但在White培养基上对原球茎分化具有一定程度
的促进作用.
[ 关键词] 大花蕙兰; 培养基; 6-苄氨基嘌呤; 复合添加物
[ 中图分类号] Q942.5 [文献标识码] A [文章编号] 1000-9965(2000)03-0100-06
兰属(Cymbidium)兰花大多为具地生根陆生兰 , 即通常所说的 “国兰” , 如春兰
(C.geogringii)[ 1 ,2] ,建兰(C.ensifolium)[ 1]等 ,深受我国人民的喜爱。少数为具气生根的种
类 ,如大花蕙兰 ,大花蕙兰因其具有大而奇特的花形 ,艳丽多彩的花色 ,花多且花期长以及素雅
的香味和富于观赏的叶而深受到国内外兰花爱好者的普遍欢迎 ,具有较大的市埸潜力.大花
蕙兰既包括原产于我国的种类 ,也包括来自于国外的“洋兰” ,其无性繁殖是通过原球茎(proto-
corm)实现的 ,这种途径类似于体细胞胚胎发生;而具地下根的陆生兰 ,其无性繁殖是通过形成
根状茎(rhizome)实现的 ,类似于器官发生.2种类型的兰花无性繁殖的方式不同 ,对培养基 、激
素等的要求也不同.
目前 ,就大花蕙兰的无性系快速繁殖而言 ,使用较多的培养基为Kundson C(KC)[ 3] ,VW[ 4] ,
MS[ 5]等 ,很少使用White[ 6]培养基.这些培养基的作用表现为促进增殖和分化 2个方面.各种
培养基在增殖和分化 2 方面的作用各不相同 ,如 MS培养基营养成分含量丰富 ,有利于增殖 ,
但并不适合于分化.虽然White培养基的营养成分含量低 ,有报道认为White 培养基的这种特
点有利于分化 ,但对于大花蕙兰原球茎的增殖和分化是否有促进作用还不清楚 ,或者说White
培养基对于原球茎分化的促进作用与原球茎增殖的关系需进一步探讨.在激素作用方面 ,在
大花蕙兰茎尖培养中 ,据报道高水平的 BA(6-苄氨基嘌呤)有利于原球茎诱导和增殖 ,而低水
平的 BA有利于原球茎分化[ 7 ,8].BA 是否对大花蕙兰原球茎增殖和分化具有同样作用需要进
一步研究.在复合添加物的使用方面 ,兰花无性系快速繁殖通常需要加入各种不同的复合添
[收稿日期] 1999-09-24
[作者简介] 刘明志(1963～ ),男 ,湖南岳阳人 ,副教授 ,博士.
第 21卷第3期
2000年 6月
暨南大学学报 (自然科学版)
Journal of Jinan University(Natural Science)
Vol.21No.3
Jun.2000
加物 ,如香蕉匀浆物 、马铃薯匀浆物和胰蛋白胨和酵母提取汁等.但是这些复合添加物对大花
蕙兰原球茎增殖和分化方面的作用及其与培养基和激素的作用关系还了解得很少.作者使用
KC和White 两种培养基 ,两种水平的 BA以及 4种复合添加物的进行组合配比实验 ,研究各种
组分在大花蕙兰原球茎增殖和分化方面的作用 ,并探讨增殖和分化的关系.
1 材料和方法
1.1 实验材料
(1)供试材料为大花蕙兰(Cymbidium grandiflorium)的原球茎培养物.
(2)本实验使用 2种培养基:一种为 Kundson C培养基 ,一种为 White 培养基.2种培养基
均分别含有 3%蔗糖 、0.3%活性碳 、0.8%琼脂.根据实验需要在培养基中加入不同浓度的 BA
和4种复合添加物.
1.2 实验方法
(1)培养基 、BA和复合添加物对原球茎增殖的影响:在 Kundson C培养基和White 培养基
中分加别加入两种水平的 BA(0.4 mg/L 和 1.0 mg/L)和 4种不同的复合添加物(100 g/L 香蕉
匀浆物 ,100 g/L马铃薯匀浆物 ,1000 mg/L胰蛋白胨 ,200 mg/L酵母提取物).以不含激素和复
合添加物的Kundson C和White培养基作为对照.实验时 ,将原球茎培养物切成约2 mm 大小 ,
接种于各种组合的培养基中 ,每种组合的培养基配 2瓶(各25 mL),每瓶的接种量为15 ,即表 1
和表 2中各种处理的接种量为 30 ,以此为基数统计实验数据并进行分析.原球茎的增殖量和
增殖率的计算是以接种物培养 1个月后的统计数据来计算 ,方法见(3).
(2)培养基 、BA和复合添加物对原球茎分化的影响:实验方法同(1).原球茎的分化率和
分化量是以接种物培养 3个月后的统计数据来计算 ,方法见(3).
(3)数据分析:原球茎增殖的计算.由于本实验中所使用的大花蕙兰原球茎培养物不同
于愈伤组织或一般的胚性愈伤组织 ,其增殖除在早期形成少量愈伤组织外 ,这些愈伤组织随后
分化形成原球茎.因此对于原球茎的增殖以质量或体积来计量都不是很合理 ,另一方面以质
量或体积来计算原球茎的增殖在实际操作中难度较大 ,而且增加了污染的可能性.因此在本
实验中 ,原球茎的增殖量是以每个接种物经培养一个月后所形成的原球茎的个数的平均值来计
算.原球茎的增殖率是以配比组合中原球茎的增殖量减去对照组的原球茎的增殖量除以对照
组的原球茎的增殖量的百分比的平均值表示.
原球茎分化的计算.原球茎的分化包括两个指标 ,一是接种的原球茎培养物在培养 3个
月后 ,伴随着其数量的增加 ,其中必然有一部分出现茎叶的分化 ,以出现茎叶分化的接种原球
茎培养物的个数占总的接种原球茎培养物的个数的百分比的平均值表示原球茎的分化率 ,另
一个指标是原球茎的分化量 ,它是以每个接种的原球茎培养物经 3个月后出现茎叶分化的原
球茎的个数的平均值表示.
2 结果与分析
2.1 培养基 、BA和复合添加物对原球茎增殖的影响
大花蕙兰原球茎接种在含有不同BA浓度和不同复合物的KC和White培养基中经一个月
101第 3期 刘明志等: 培养基 、BA 和复合添加物对大花蕙兰增殖和分化的影响
的培养后 ,统计原球茎的增殖量 ,结果见表 1.
表 1 在 KC 和White培养基上 BA和复合添加物对原球茎增殖的影响1)
培 养 基 无激素 0.4 mg/ L BA 1.0 mg/L BA 总增殖量 总增殖率/ %
KC
无添加物(对照) 5.31 1.72 6.57 13.60 —
香蕉匀浆物 6.61 8.57 10.50 25.68 88
马铃薯匀浆物 6.14 1.20 5.29 13.63 0.2
胰蛋白胨 9.66 2.37 11.19 23.22 71.3
酵母提取物 7.01 3.56 6.89 17.46 28
总增殖量 34.73 17.42 40.44 =93.59 —
总增殖率/ % — -50 16 — —
White
无添加物(对照) 3.07 3.81 3.69 10.57 —
香蕉匀浆物 6.14 6.33 8.28 20.75 96
马铃薯匀浆物 4.87 4.83 5.14 14.84 40
胰蛋白胨 6.57 3.16 3.11 13.64 29
酵母得取物 3.75 2.09 2.33 8.17 -23
总增殖量 24.20 20.22 22.55 =66.97 —
总增殖率/ % — -16.4 -7.0 — —
1) 增殖量:原球茎数/接种物;增殖率:(配比组合的原球茎增殖量-对照组原球茎增殖量)/对照组原球茎增殖量×
100%
从表 1可以看出 ,在含各种复合添加物和不同水平 BA的各种配比组合中 ,除含 0.4 mg/L
BA和马铃薯匀浆物的组合外 ,KC 培养基上各种组合的原球茎的总增殖量明显高于White培
养基 ,表明 KC 培养基更适合原球茎的增殖.
在KC 和White培养基上 ,与不含BA的对照组相比 , BA对原球茎增殖不表现促进作用 ,除
含 1.0 mg/L BA的 KC培养基外 ,原球茎的增殖率均比不含 BA的对照组低.但总的来说 BA
对原球茎的增殖不具有促进作用.是否更高水平的 BA(大于 1.0 mg/L)有利于原球茎的增殖
需要进一步研究.
复合添加物对原球增殖的作用在两种培养基上的促进作用既有相似之处 ,又有差异.香
蕉匀浆物在两种培养基上均表现出明显的促进作用 ,马铃薯匀浆物在 KC培养基上并不表现
明显的促进作用 ,但在White 培养基上却表现出仅次于香蕉匀浆物的促进作用 ,胰蛋白胨在
KC培养基上表现出仅次于香蕉匀浆物的促进作用 ,但在White 培养基上却比马铃薯差 ,酵母
提取物在 KC培养基上对原球茎的促进作用比马铃薯好 ,但在White 培养基上却比不加任何添
加物的对照组差 ,表现出抑制作用.
2.2 培养基 、BA和复合添加物对原球茎分化的影响
原球茎接种物在含不同激素和 4种复合添加物的 KC 和White 培养基上经培养 3个月后
计算原球茎的的分化率和分化量 ,结果见表 2.
102 暨南大学学报(自然科学版) 2000 年
表2 在 KC 和White培养基上 BA和复合添加物对原球茎分化率的影响1)
培 养 基 无激素分化率/ %分化量
0.4 mg/L BA
分化率/ %分化量
1.0 mg/ L BA
分化率/ %分化量
平均分
化率/ %
总分
化量
KC
无添加物 81.82 2.28 62.5 1.36 50.0 1.83 65.1 5.47
香蕉匀浆物 55.56 2.20 65.4 1.82 60.0 2.11 60.3 6.13
马铃薯匀浆物 52.00 1.54 54.2 1.38 79.27 2.26 61.8 5.18
胰蛋白胨 54.17 1.31 78.3 2.56 28.0 1.71 53.5 5.58
酵母提取物 63.63 2.21 60.9 2.43 48.0 1.25 57.5 5.89
平均分化率或总分化量 61.44 9.54 64.3 9.53 53.1 9.16
White
无添加物 0 0 0 0 26.9 1.57 8.9 1.57
香蕉匀浆物 12.0 1.67 18.2 1.50 44.4 1.17 24.9 4.34
马铃薯匀浆物 25.0 1.40 43.5 2.1 47.8 1.18 38.8 4.68
胰蛋白胨 0 0 25.0 1.50 64.3 1.06 29.8 2.56
酵母提取物 8.00 1.50 — — — — — —
平均分化率或总分化量 9.0 4.57 21.65 5.1 45.85 4.98
1) 分化率:已分化的原球茎数/总接种原球茎数×100%;分化量:已分化的原球茎数/接种物 ,即每个接种物上所形成原球
茎数目的平均值
从表 2可以看出 ,在无添加物和含添加物的 KC 培养基上 ,从平均分化率上来看 ,不含激
素的培养基上的原球茎平均分化率比含低水平 BA 的原球茎的平均分化率弱低 ,但高于高水
平BA的原球茎平均分化率;但从总分化量上看 ,不含激素的培养基上的原球茎总分化量与低
水平 BA无明显差异 ,但高于高水平 BA.可见 ,高水平 BA不利于原球茎分化.此外 ,原球茎的
最高分化率是不含 BA和复合添加物的 KC培养基.它表明原球茎的分化不需要 BA的作用.
在White 培养基上 BA所具有的作用却相反 ,含有BA和复合添加物的培养基的原球茎的平均分
化率明显高于不含激素组合的原球茎的平均分化率 ,总分化量也弱高于不含激素的组合.这表
明 BA对原球茎的分化效果依赖于培养基.
4种复合添加物在KC 和White 培养基上对原球茎的分化表现明显差异.在 KC培养基
上 ,不含复合添加物组合的原球茎的平均分化率比含复合添加物的原球茎的平均分化率高一
些 ,但在总分化量方面 ,复合添加物中除马铃薯匀浆物外 ,均比不含复合添加物的对照组高.
在White 培养基上 ,含复合添加物的组合的原球茎的平均分化率和总分化量(酵母提取物组合
因污染未除外)均比不含复合添加物的对照组高得多.
3 讨论
3.1 原球茎增殖和分化的计算方法
在原球茎增殖量方面 ,本研究以每个接种物上所形成的原球茎个数作为计算依据 ,就原球
茎的增殖量的计算来说是最为合理的.但是由于原球茎的发育状态不一致 ,有的原球茎处于
发育晚期 ,体积较大 ,有的原球茎处于发育早期 ,体积较小 ,但在计算增殖量方面是相同的 ,这
样在客观上不可避免地会出现误差.同时 ,使用肉眼计数时 ,也会出现人为的误差.此外 ,为
了便于比较分析 ,原球茎的增殖率以含 BA的组合与不含 BA的对照组的差值与对照组的百分
比来表示 ,或者以含复合添加物与不含复合添加物的差值的百分比表示 ,因此当原球茎的增殖
103第 3期 刘明志等: 培养基 、BA 和复合添加物对大花蕙兰增殖和分化的影响
量低于对照组时 ,出现了负值.它并不代表原球茎本身呈负增长 ,只表示原球茎的增殖低于对
照组.在原球茎的分化方面 ,要考虑分化率和分化量两者才是比较全面的.
3.2 培养基在原球茎增殖和分化中的作用
培养基在原球茎增殖和分化中的作用是显而易见的(见表 1和表 2).特别是对于原球茎
的分化而言 ,这种差异更加明显(见表 2).虽然在第 1个月统计时 ,含 0.4 mg/L BA和含有马
铃薯匀浆物的组合中 ,KC培养基上原球茎的增殖量弱低于White培养基 ,但是随着培养时间
的延长 ,上述两种组合中 ,KC培养基上原球茎增殖仍然高于White 培养基.由于KC培养基有
利于形成高质量的原球茎 ,而高质量的原球茎对于原球茎的分化起重要作用.这进一步证明
原球茎的增殖是分化的基础.
3.3 BA在原球茎增殖和分化中的作用
BA在兰花组织培养中无凝具有非常重要的作用 ,特别是在原球茎诱导方面.许多研究表
明原球茎的诱导需要较高的 BA质量浓度 ,如 BA可达到10 mg/L 甚至更高 ,但 BA对原球茎的
增殖和分化是否需要同样高质量浓度的 BA ,不同的研究者得到了各不相同的研究结果.一些
研究表明原球茎的增殖和分化并不需要高质量浓度的 BA ,甚至不需要 BA ,高质量浓度的 BA
可抑制原球茎的分化[ 7 , 8].实际上 ,原球茎的增殖与 BA无关 ,而依赖于培养基和复合添加物 ,
本实验也表明了这一点.在无 BA 的培养基上 ,原球茎增殖实际上与原球茎的切割有密切关
系 ,因为切割引起原球茎内源激素的变化 ,它可能是原球茎增殖的原因.在本实验中 ,对于原
球茎的分化而言 ,在 KC和White 两种培养基上 , BA的作用相反 ,在 KC 培养基上 BA表现出一
定程度的抑制作用 ,但在White培养基却表现出较明显的促进作用.可能原因是原球茎的分
化涉及到接种物和培养基 ,激素和复合添加物之间的复杂相互作用.
3.4 复合添加物在原球茎增殖和分化中的作用
4种复合添加物在原球茎的增殖和分化方面的差异较大.就原球茎的增殖而言 ,在KC和
White 培养基上 4种复合添加物对原球茎增殖的促进作用表现出明显差异 ,香蕉匀浆物在两种
培养基上已被证明是最适合原球茎增殖的添加物.马铃薯匀浆物在 KC培养基上对原球茎的
增殖作用却和对照组差不多 ,但在White 培养基上马铃薯匀浆物却对原球茎增殖具有一定程
度的促进作用 ,这可能是由于马铃薯匀浆物弥补了White培养基营养成分的不足.胰蛋白胨
在KC培养基上的促进作用比White培养基上的好一些 ,这可能涉及到复合添加物和培养基之
间的复杂相互作用.同样 ,酵母提取物在 KC 培养基上对原球茎增殖具有促进作用以及它在
White 培养基上对原球茎增殖的促进作用甚至比对照组差的事实也表明了培养基和复合添加
物之间的这种复杂的相互作用.所以复合添加物是否对原球茎增殖具有促进作用要根据具体
情况具体分析.
在KC和White培养基上的 4种复合添加物对原球茎的分化也表现出明显差异 ,在 KC培
养基上 ,除香蕉匀浆物的组合中原球茎的分化量稍高于对照组外 ,在香蕉匀浆物组合中的原球
茎的分化率 ,以及其它组合中原球茎的分化率和分化量均比对照组低 ,说明在 KC 培养基上复
合添加物对原球茎的分化不具有促进作用.但在White培养基上复合添加物比对照组的原球
茎的分化率和分化量高得多.在两种培养基上所出现的相反的结果表明 ,由于White 培养基
本身营养成分不足而不利于原球茎的分化 ,复合添加物之所以能促进White 培养基上的原球
茎的分化在于复活添加物弥补了White营养成分的不足 ,由于 KC培养基本身有利于的球茎的
104 暨南大学学报(自然科学版) 2000 年
分化 ,因而复合添加物对原球茎分化的促进作用不能够表现出来.
[参考文献]
[ 1] WANG X.Tissue culture of Cymbidium:Plant and flower induction in vitro[ J] .Lindleyana , 1988 , 3(4):184.
[ 2] SHIMASAKI K , UEMOTO S.Rhizome induction and plantlet regeneration of Cymbidium goeringii from flower bud
cultures in vitro[ J] .Plant Cell , Tissue and Organ Culture , 1991 , 25:49.
[ 3] KNUDSON L.Nutrient studies of orchids[ J] .Bot Gaz , 1951 , 112:528.
[ 4] VACIN E F , WENT F W.Some pH changes in nutrient solutions[ J] .Bot Gaz , 1976 , 110:435.
[ 5] MURASHIGE T , SKOOG F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[ J] .Physi-
ol Plant , 1962 , 15:473.
[ 6] WHITE P R.The Cultivation of Animal and Plant Cells[ M].2nd ed.New York:Ronald Press , 1963.
[ 7] 谷祝平 , 颜廷进.大花蕙兰茎尖组织培养及其形态建成的研究[ J].实验生物学报 , 1989 , 22:149.
[ 8] GU Z , HIGAKI P C , NISHIDA M M , et al.The effects of benzyladenine , 2 , 4-dichlorophenoxyacetic acid , and in-
doleacetic acid on shoot-tip culture of Cymbidium[ J] .Lindleyana , 1987 , 2(2):88.
The influence of medium , 6-benzyl aminopurine and complex
on protocorm propagation and differentiation of Cybidium grandiflorium
LIU Ming-zhi , ZHU Jin-yu
(Dept.of Biotechnology , Jinan University , Guangzhou 510632 , China)
[ Abstract] The difference in the extent of propagation and the rate of differentiation of the protocorm
derived from Cymbidium grandiflorium effected by different complex combinations of BA(6 -benzyl
aminopurine)with each of the four kinds of substances banana homomixer , potato homomixer , tryptone
and yeast extract , in Kundson C(KC)and White s medium was investigated.Experimental results indi-
cated that the KC medium had obvious advantages on protocorm propagation and differentiation comparing
with White s medium.BA inKC medium didn t have obvious effects on promotion of protocorm propaga-
tion and differentiation , but it was not so in White s medium.Although BA in White s medium played
no role in promotion of protocorm propagation , but it elevated protocorm differentiation.Four complexes
in KC and White s medium showed different effects in promotion of protocorm propagation.Banana ho-
momix was the best of the four homomixers.In protocorm differentiation , no effect was ovserved for all
four complexes in KC medium , but in White s medium promotions were recorded to some extents.
[ Key words] Cymbidium grandiflorium; medium; 6-benzyl aminopurine; complexes
105第 3期 刘明志等: 培养基 、BA 和复合添加物对大花蕙兰增殖和分化的影响