全 文 ：第 5卷第 2期
1998年 6月
中 国 水 产 科 学
JOURNAL OF FISHERY SC IENCES OF CHINA
Vol.5 No.2
Jun.1998
海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度＊
袁有宪 曲克明 辛福言
(中国水产科学研究院黄海水产研究所 ,青岛 266071)
摘 要 本文通过正交试验 ,研究确定了铜 、锌 、锰 、钼 、钴 、镍为牟氏角毛藻(Chaeto-
ceros mul leri)和金藻(Isochrysis galhana)培养的必需元素 ,并确定了最佳浓度 ,依次为(1 ～
5)×10-8 、10-9 、(5 ～ 10)×10-8 、(1 ～ 5)×10-8 、10-7 ～ 10-9 、10-9mol/L。它们应用于牟氏
角毛藻和金藻的培养 ,可使细胞浓度和叶绿素浓度分别提高 20.4%～ 43.2%和 19.7%～
25.6%。本文的研究结果较著名的 M -f/2配方增加了镍 ,并对其他的五种元素的浓度进
行了修订。铜 、钼 、钴的浓度和 M -f/2配方基本相同;锰的浓度低约 1个数量级;锌的浓度
低约 2个数量级 。
关键词 微量元素 ,单胞藻 ,海水养殖
收稿日期:1996-04-22
＊中国水产科学研究院科研基金项目。
海水育苗过程中 ,植物饵料特别是单细胞藻类的培养繁殖是育苗成功与否的关键环节
之一 。在单胞藻培养体系中 ,施用氮磷等常量元素提供了必要的营养来源 ,但随水体中原有
的必需微量元素的消耗 ,微量元素将成为浮游植物生长繁殖的限制因素 。在对虾养殖生产
中 ,大多数放养者放苗前进行了施肥肥水 ,但所施的主要为氮肥和少量磷肥;另一方面 ,倘若
缺少某些微量元素 ,不仅会导致浮游植物数量减少 ,也会造成浮游植物种群组成发生变化。
一旦有益种群受到抑制 ,非有益种繁殖起来 ,将会导致养殖动物的营养不良或病害发生。
在农业 、林业生产中 ,为补充土壤 、水中微量元素的不足 ,从 70年代开始就进行了微量
元素肥料的研究 ,先后出现了种类繁多的微量元素肥料及多种施肥方式[ 1 ,2 , 4] 。对海洋浮游
植物而言 ,一般认为铁 、铜 、锌 、锰 、钼 、钴 、镍是必需微量元素[ 7 ,11] ;尽管人们认识微量元素
对浮游植物的重要性已有较久的历史[ 3 , 9 , 10] ,但是作为养殖生产用的微量元素商品肥料尚
未出现;另一方面 ,随海洋环境的变迁和养殖新品种的开发利用 ,对这些微量元素所需的浓
度也在发生变化 。所以 ,本文从海水中微量元素对海水育苗常用的两种单胞藻牟氏角毛藻
(Chaetoceros mulleri)和金藻(Isochry sis galhana)的必需性入手 ,研究了铜 、锌 、锰 、钼 、钴 、镍
在海水单胞藻培养液中的最佳浓度 。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
牟氏角毛藻和金藻藻种为本所环境保护研究室保存 。实验用水取自青岛麦岛近海 ,盐
度 30 ～ 31 ,pH 8.1。海水经沉淀 、沙滤 ,装入聚乙烯塑料桶中备用。
硫酸铜(CuSO4·5H2O)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、硫酸锰(MnSO4·H2O)、氯化钴(CoCl2·
6H2O)、硫酸镍(NiSO4·6H2O)、钼酸钠(NaMoO7·2H2O)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。硝酸
钠 、磷酸二氢钾 、柠檬酸铁 、硅酸钠 。所用试剂为分析纯或化学纯 。
1.2实验方法
在 250 ml三角烧瓶中 ,加适量海水 ,加入量根据藻种密度而定 ,使最终体积为 200ml。
营养盐浓度N∶P∶Fe(∶Si)为 30∶2∶0.5(∶1)mg/L 加一定量混合微量元素试验液 ,每组平行 3
个样 。温度保持(24±1)℃。用4只并列 40W日光灯为光源 ,光照为4 000lx(用江苏沛县测
光仪器厂产 ZD-Ⅲ型照度计测量)。光照时间昼:夜为 10:14。每日随机调换三角瓶并摇
动 2 ～ 3次 。每日取样计数 ,用 UV-365自计分光光度计(日本岛津),在 530nm 或 550nm
处 ,用 1cm 比色皿以海水为参比测量吸光值 ,通过校正曲线换算出细胞浓度 。叶绿素的测
定用 UV-365自计分光光度计 ,按文献[ 8]进行。用正交试验法安排并设计铜 、锌 、锰 、钼 、
钴 、镍的试验浓度 ,根据试验因子和水平选用了 L 25(56)正交表 ,并用方差分析评估实验结
果。试验因子及水平设计见表 1 。
表 1 试验因子及水平
Table 1 Experimental factors and their levels
元素
Element
水平/(mol·L -1) Level
1 2 3 4 5
元素
Element
水平/(mol·L -1) Level
1 2 3 4 5
Cu 10-9 10-8 5×10-8 10-7 10-6 Mo 10-9 10-8 5×10-8 10-7 10-6
Zn 10-9 10-8 10-7 5×10-7 10-6 C0 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6
Mn 10-9 10-8 5×10-8 10-7 10-6 Ni 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6
2 实验结果
2.1 正交试验结果
试验结果见表 2 、表 3 。以吸光度为评估指标 ,对所得的试验数据进行了直观分析。对
角毛藻 , 各个因子水平 Cu(2)、Zn(1)、Mn(3)、Mo(3)、Co(2)、Ni(2)最好;对金藻 Cu(3)、Zn(1)、
Mn(4)、Mo(2)、Co(4)、Ni(2)最好 。F 检验结果见表 4 、表 5 。结果表明 , 6种微量元素对角毛藻
影响作用的大小顺序为 Cu>Mn>Zn>Ni>Co >Mo;对金藻为 Cu>Mn>Ni>Mo>Zn>
Co 。
2.2 验证结果
为得到一种能够通用的微量元素配方并验证其正确性 ,本研究将角毛藻和金藻得到的
最好水平分别配成配方 1和配方 2 ,并取得两组最好水平平均值配制成配方 3(表 6),分别
用于角毛藻和金藻的培养实验 。结果表明(表 7 、表 8),对角毛藻 ,配方 3明显好于配方 1和
2 ,生长至第4d时 ,细胞浓度提高8.8%;第8d时 ,提高19.4%;第 9d时 ,提高20.4%。对金
藻 ,配方 1和 3好于配方 2 ,生长至第 7d时 ,使用配方 3 ,细胞浓度提高 11.5%;第 8d时 ,提
高29.2%;第 10d时 ,提高 43.2%。但是使用配方 1第10d提高了52.8%。可以看出 ,使用
配方 1和使用配方 3 ,在第 8d前基本无差别。故配方 3可以作为通用型配方使用 。
46 中 国 水 产 科 学 5 卷
表 2 微量元素在角毛藻培养中的作用正交试验结果及直观分析
Table 2 Results of orthogonal test of microelement for C.mulleri culture and direct analysis
试验号
No.
水平 Levels 吸光度 A
Cu Zn Mn Mo Co Ni
角毛藻(第 5d)
C.mu ller i (A-0.490)×100 0 合计
1 1 1 1 1 1 1 0.479 0.482 0.476 -11 -8 -14 -33
2 1 2 2 2 2 2 0.536 0.504 0.520 46 14 30 90
3 1 3 3 3 3 3 0.488 0.490 0.476 -2 0 -14 -16
4 1 4 4 4 4 4 0.480 0.469 0.481 -10 -21 -9 -40
5 1 5 5 5 5 5 0.502 0.506 0.483 12 16 -7 21
6 2 1 2 3 4 5 0.497 0.528 0.502 7 38 12 57
7 2 2 3 4 5 1 0.520 0.520 0.502 30 30 12 72
8 2 3 4 5 1 2 0.485 0.486 0.497 -5 -4 7 -2
9 2 4 5 1 2 3 0.486 0.499 0.494 -4 9 4 9
10 2 5 1 2 3 4 0.480 0.465 0.451 -10 -25 -39 -74
11 3 1 3 5 2 4 0.510 0.542 0.526 20 52 36 108
12 3 2 4 1 3 5 0.510 0.487 0.491 20 -3 1 18
13 3 3 5 2 4 1 0.503 0.500 0.489 13 10 -1 22
14 3 4 1 3 5 2 0.490 0.513 0.509 0 23 9 32
15 3 5 2 4 1 3 0.441 0.427 0.434 -49 -63 -56 -168
16 4 1 4 2 5 3 0.498 0.522 0.513 8 32 23 63
17 4 2 5 3 1 4 0.497 0.490 0.500 7 0 10 17
18 4 3 1 4 2 5 0.472 0.471 0.455 -18 -19 -35 -72
19 4 4 2 5 3 1 0.488 0.490 0.490 -2 0 0 -2
20 4 5 3 1 4 2 0.479 0.493 0.478 -11 3 -12 -20
21 5 1 5 4 3 2 0.454 0.451 0.475 -36 -39 -15 -90
22 5 2 1 5 4 3 0.403 0.400 0.408 -87 -90 -82 -259
23 5 3 2 1 5 4 0.445 0.408 0.428 -45 -82 -62 -189
24 5 4 3 2 1 5 0.472 0.436 0.459 -18 -54 -31 -103
25 5 5 4 3 2 1 0.455 0.450 0.472 -35 -40 -18 -93
Ⅰ/ 5 4.4 21.0 -81.2-43.0-57.8 -6.8 T =-652
Ⅱ/ 5 12.4 -12.4-42.4 -0.4 8.4 2.0
Ⅲ/ 5 2.4 -51.4 8.2 -0.6 -32.8-74.2 μ= T /75=-8.7
Ⅳ/ 5 -2.0 -20.8-10.8-59.6-48.0-35.6
Ⅴ/ 5 -146.8-66.8 -4.2 -26.8 -0.2 -15.8
2.3 对叶绿素合成的影响
表 9是微量元素 3 种配方在室内生产规模培养单胞藻对叶绿素合成的影响的实验结
果。可以看出 , 3种配方均不同程度地提高了牟氏角毛藻和金藻的叶绿素浓度。通用型配
方(配方 3)的使用效果与配方 1和 2基本无差别。
对表 9中第 6d的结果分析 ,用角毛藻筛选出的配方 1提高角毛藻叶绿素浓度 25.6%,
用金藻筛选出的配方(配方 2)提高金藻叶绿素浓度 21.6%,通用型配方(配方 3)对这两种
藻的叶绿素分别提高 19.7%和 24.0%。
47 2 期 袁有宪等:海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度
表 3 微量元素在金藻培养中的作用正交试验结果及直观分析
Table 3 Results of orthogonal test of microelement for I.galbana culture and direct analysis
试验号
No.
水平 Levels 吸光度 A
Cu Zn Mn Mo Co Ni
金 藻(第 6d)
I.galbana (A-0.370)×1000 合计
1 1 1 1 1 1 1 0.372 0.369 0.369 2 -1 -1 0
2 1 2 2 2 2 2 0.374 0.375 0.373 4 5 3 12
3 1 3 3 3 3 3 0.373 0.374 0.362 3 4 -8 -1
4 1 4 4 4 4 4 0.366 0.374 0.376 -4 4 6 6
5 1 5 5 5 5 5 0.372 0.367 0.365 2 -3 -5 -6
6 2 1 2 3 4 5 0.374 0.362 0.365 4 -8 -5 -9
7 2 2 3 4 5 1 0.369 0.363 0.362 -1 -7 -8 -16
8 2 3 4 5 1 2 0.372 0.373 0.370 2 3 0 5
9 2 4 5 1 2 3 0.369 0.370 0.370 -1 0 0 -1
10 2 5 1 2 3 4 0.364 0.361 0.370 -6 -9 0 -15
11 3 1 3 5 2 4 0.371 0.371 0.374 1 1 4 6
12 3 2 4 1 3 5 0.367 0.374 0.371 -3 4 1 2
13 3 3 5 2 4 1 0.379 0.376 0.375 9 6 5 20
14 3 4 1 3 5 2 0.370 0.372 0.370 0 3 0 3
15 3 5 2 4 1 3 0.372 0.372 0.369 2 2 -1 3
16 4 1 4 2 5 3 0.365 0.376 0.365 5 6 -5 6
17 4 2 5 3 1 4 0.364 0.366 0.364 -6 -4 -6 -16
18 4 3 1 4 2 5 0.352 0.355 0.360 -18 -15 -10 -43
19 4 4 2 5 3 1 0.353 0.354 0.352 -17 -16 -18 -51
20 4 5 3 1 4 2 0.371 0.374 0.368 1 4 -2 3
21 5 1 5 4 3 2 0.358 0.362 0.366 -12 -8 -4 -24
22 5 2 1 5 4 3 0.350 0.353 0.353 -20 -17 -17 -54
23 5 3 2 1 5 4 0.363 0.361 0.360 -7 -9 -10 -26
24 5 4 3 2 1 5 0.356 0.353 0.356 -14 -17 -14 -45
25 5 5 4 3 2 1 0.356 0.359 0.365 -14 -11 -5 -30
Ⅰ/ 5 2.2 -4.2 -21.8 -4.4 -11.2-15.4 T =-271
Ⅱ/ 5 -7.2 -14.4-14.2 -4.4 -11.2 -0.2
Ⅲ/ 5 6.8 -9.0 -10.6-10.6-17.8 -9.4 μ= T /75=-3.6
Ⅳ/ 5 -20.2-17.6 -2.2 -14.0 -6.8 -9.0
Ⅴ/ 5 -35.8 -9.0 -5.4 -20.2 -7.8 -20.2
表 4 角毛藻-微量元素正交试验方差分析
Table 4 Variant analysis of orthogonal test for C.mulleri
变异来源
Variant sou rce
离均差平方和
SS
自由度
Freedom
均方
MS
F
显著性
Signifi cence
总变异(SS总) 69 754 74
S Cu 30 560 4 7 640 60.16 ＊＊
SZn 7 885 4 1 971 15.52 ＊＊
SMn 8 653 4 2 163 17.03 ＊＊
SMo 4 532 4 1 133 8.92 ＊＊
SCo 5 651 4 1 413 11.13 ＊＊
SNi 6 120 4 1 530 12.05 ＊＊
SD误 6 353 50 127
F0.01(4 , 50)=3.72 , F0.05(4 , 50)=2.55
48 中 国 水 产 科 学 5 卷
表 5 金藻-微量元素正交试验方差分析
Table 5 Variant analysis of orthogonal teset for I.galbana
变异来源
Variant sou rce
离均差平方和
SS
自由度
Freedom
均方
MS
F
显著性
Signifi cence
总变异(SS总) 3 994 74
S Cu 2 009 4 502 41.83 ＊＊
SZn 182 4 46 3.83 ＊＊
SMn 393 4 98 8.17 ＊＊
SMo 305 4 76 6.33 ＊＊
SCo 124 4 31 2.58 ＊
SNi 379 4 95 7.92 ＊＊
SD误 602 50 12
F0.01(4 , 50)=3.72 , F0.05(4 , 50)=2.55
表 6 微量元素初选配方
Table 6 Primary choiced concentration of microelements mol/ L
元 素 Microelement Cu Zn Mn Mo Co Ni EDTA
配方 1(角毛藻)Formula 1(C.mu ller i) 10-8 10-9 5×10-8 5×10-8 10-9 10-9 11.3×10-8
配方 2(金藻)Formula 2(I.ga lbana) 5×10-8 10-9 10-7 10-8 10-7 10-9 26.2×10-8
配方 3(通用型)Formula 3(all) 3×10-8 10-9 7.5×10-8 2.5×10-8 5×10-8 10-9 18.1×10-8
表 7 微量元素配方对角毛藻生长实验结果
Table 7 Effects of microelement on growth of C.mulleri
配方
Formula
生长天数/ d Grow th days
1 2 4 6 8 9
细胞浓度/ml-1 Cell concent ration
1 86.9±0.0 166.6±0.7 239.8±3.2 306.5±5.6 389.4±10.5 443.1±29.2
2 86.1±0.0 173.9±1.5 256.0±0.7 331.7±5.6 422.7±7.2 455.3±3.2
3 90.2±0.0 178.8±0.0 270.7±0.0 352.8±3.2 445.5±13.7 479.6±7.2
对 照 Cont rol 86.9±0.0 173.9±0.0 248.7±0.0 305.6±15.4 373.1±40.6 389.3±45.4
提高率/ % Raise rate
1 0.0 -4.2 3.6 -0.3 4.4 11.2
2 -0.9 0.0 2.9 8.5 13.3 14.3
3 3.8 2.8 8.8 15.4 19.4 20.4
49 2 期 袁有宪等:海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度
表 8 微量元素配方对金藻生长实验结果
Table 8 Effects of microelement on growth of I.galbana
配方
Formula
生长天数 Grow th days
2 4 6 7 8 10
细胞浓度/ml-1 Cell concent ration
1 313.8±4.8 520.0±9.8 592.9±10.5 659.6±11.3 746.0±2.5 854.0±14.9
2 314.6±5.2 511.7±7.9 591.8±7.8 653.9±8.4 659.7±9.0 667.8±16.7
3 318.0±7.7 513.1±9.0 589.1±3.3 659.2±10.4 742.9±14.6 800.0±30.7
对 照 Cont rol 312.9±6.1 507.7±9.5 567.6±2.7 591.4±4.3 575.1±13.6 558.8±27.7
提高率 Raise rate(%)
1 0.3 2.4 4.5 11.5 29.7 52.8
2 1.6 0.8 4.3 11.5 14.7 19.5
3 3.8 1.1 3.8 7.5 29.2 43.2
表 9 微量元素对单胞藻培养叶绿素 a 浓度的影响
Table 9 Effects of microelement on concentration of algal chlorophll-a μg/ L
天数/ d Days 1 2 3 4 5 6
配方 1-角毛藻 Formula 1-C.mu ller i 0.230 0.320 0.579 0.744 0.885 1.207
配方 2-金藻 Formula 2- I.ga lbara 0.224 0.333 0.506 0.662 0.693 0.861
配方 3-角毛藻 Formula 3-C.mu ller i 0.230 0.330 0.498 0.720 0.808 1.150
配方 3-金藻 Formula 3- I.ga lbara 0.224 0.322 0.471 0.628 0.684 0.878
对照-角毛藻 Con trol- C.mul leri 0.230 0.278 0.451 0.601 0.664 0.901
对照-金藻 Con trol- I .ga lbara 0.224 0.286 0.454 0.587 0.650 0.708
3 讨论
从实验结果可以看出 ,铜 、锌 、锰 、钼 、钴 、镍等 6种元素 ,对角毛藻和金藻都是必需的微
量元素 ,这与文献[ 7 , 11] 报道是一致的。但是 , Guillar 和 Ry ther[ 10]提出的著名的 M -f/2
配方(表 10)中没有镍 ,根据本文结果 ,镍对单胞藻的必需性是显著的 。比较本研究的配方
和 M-f/2配方 ,钴的浓度完全相同;铜 、钼的浓度基本相同 。本配方锰的浓度比 M-f/2配
方低近 1个数量级 ,锌低约 2个数量级 。分析存在差异的原因 ,一方面是由于试验所用的单
胞藻种类不同 ,因为不同种类的藻类对水化学环境的需求是不尽相同的;另一方面 ,所用的
海水取自不同海域和历史时期 ,海水中痕量元素的浓度会有很大差别 。随海洋重金属污染
的加剧 ,同一海域不同历史时期的海水亦存在差异 。本文采用的是青岛麦岛近岸海水 ,锌的
浓度为(1.4 ～ 19.2)×10-8mol/L ,铜为(0.5 ～ 3.5)×10-8mol/ L[ 6] ,钴为 8.5×10-9mol/
L
[ 5] 。与本研究配方比较 ,海水中铜在同一数量级 ,某些区域的海水还要低 ,故需要添加。
海水中钴的浓度较本配方低约一个数量级 ,也需要添加 。海水中锌的浓度远高于配方 ,故需
要量很低 ,但海水锌浓度与 M -f/2配方的浓度一致 ,也就是说 ,并非本配方不需要锌或需
要量很低 ,而是所用海水锌的量已经足够。关于锰的浓度 ,本配方比 M -f/2配方低近 1个
数量级 ,分析原因 ,可能是由于 M -f/2配方中铁的浓度较低(1.0×10-6mol/ L),本配方铁
的浓度为 8.9×10-6mol/ L ,而铁在某些生化功能上与锰有相同作用[ 11] 。总之 ,除 M -f/2
没有涉及镍外 ,可以认为本研究的配方和M -f/2配方基本一致 ,即 不同种类的单胞藻对微
量元素的需求浓度大致是相同的。但随历史的变化 ,海洋化学环境也在发生变化 ,某一区域
50 中 国 水 产 科 学 5 卷
变化可能还是较大的 ,所以在藻类培养液中添加微量元素的浓度应视所用海水的背景值而
定。当前易发生污染的元素主要有锌 、铅 、镉 、铬 、铜等 ,在研究微量元素的作用和单胞藻生
产时需引起注意 。
表 10 微量元素配方与 M-f/ 2 配方比较
Table 10 Comparison of microelement composition with and M-f/2
配方
Formula
元素及浓度/(mol·L -1)Element and concentrat ion
Cu Zn Mn Mo Co Ni EDTA
通用型 3×10-8 10-9 7.5×10-8 2.5×10-8 5×10-8 10-9 18.1×10-8
M-f/2 4×10-8 8×10-8 9×10-7 3×10-8 5×10-8 - 10-6
通过以上讨论可以认为 ,本配方研究的贡献在于定量确定了镍对单细胞藻的作用 ,并根
据目前海水环境条件修订了其他元素的浓度 。
参 考 文 献
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Optimum concentration of microelements
in seawater culture solution of marine algae culture
Yuan Youxian Qu Keming Xin Fuyan
(Yellow S ea Fisheries Research Inst itu te , Chinese Academy of Fishery S ciences, Qingdao 266071)
Abstract Copper , zinc , manganese , molybdenum , cobalt and nickel were defined as essential
elements in culture of diatom Chaetoceros mulleri and Isochrysis galbana and thei r optimum
concentrations were defined as(1 ～ 5)×10-8mol/L Cu , 10-9mol/ L Zn , (5 ～ 10)×10-8mol/
L Mn , (1 ～ 5)×10-8mol/L M o , 10-7 ～ 10-9mol/L Co and 10-9mol/L Ni , when those mi-
croelements were added in the cultural solution , the concentrations of cell and chlorophyll of
Chaetoceros mul leri and Isochrysis galbana were raised by 20.4%～ 43.2%and 19.7%～ 25.
6%, respectively.Compared with the composition of seaw ater medium M -f/2 , this culture so-
lution contained a new additional element Ni and the concentrations of other f ive elements were
revised.The concentrations of Co , Cu and M o were the same level as M -f/2.The concentra-
tion of M n w as 10 times as low as that in M -f/2.The concentration of Zn w as 100 times as
low as that in M -f/2 approximately .
Key words Microelement , Marine unicellular algae ,Marine culture
51 2 期 袁有宪等:海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度