全 文 ：ISSN　 1007-7626
CN　 11-3870 /Q
中国生物化学与分子生物学报
Chin. J. Biochem. M ol. Biol. 2000, Vol. 16, No. 6, 774～ 778
第 16卷第 6期
2000年　 12月
　* 　农业部 85-青年基金资助项目 (渔 85-93-青 05)
联系人　李丹彤 ,女 , 1965年 7月生 ,硕士 ,讲师
Tel: ( 0411) 4698067, Fax: ( 0411) 4660163 E-mai l: dlfuied
@ mai l. dlpt t. ln. cn
收稿日期: 2000-01-27,修回日期: 2000-05-09
孔石莼 (Ulva pertusa )凝集素的分离纯化及性质的研究*
李丹彤　崔铁军　吕　欧　徐忠源　高强龙　许庆陵
(大连水产学院养殖系生物化学教研室 ,大连　 116023)
摘要　为抑制肿瘤细胞增殖和防治有关病害提供基础理论依据 ,将孔石莼 (Ulva pertusa )经磷酸盐
缓冲液抽提 , 20% ～ 75%硫酸铵分级沉淀 ,牛甲状腺球蛋白-Sepharose 4B亲和层析 ,可以从绿藻孔
石莼中纯化出孔石莼凝集素 ( U PL) ,在 PAGE上显示单一蛋白染色带 ,在等电聚焦电泳上显示单
一蛋白染色带 ,其 pI为 8. 40. 纯化后的 U PL的最大紫外吸收峰在 285 nm ,用 Sephadex G-200分
子筛层析测得其分子量为 11 047.该凝集素可以凝集人的 A、 B、 AB、O型红细胞 ,且凝集活性相同 ,
在对人 ( A、 B、 AB、 O)兔、鲤、鲫的红细胞的凝集作用中 ,兔的凝集作用最强 . 该凝集素凝集兔红细
胞的作用不被 D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露聚糖、γ球蛋白、卵清蛋白所抑制 ,仅被牛甲状
腺球蛋白抑制 ,最小抑制浓度为 6. 20 g /L. 该凝集素在 pH4. 0～ 10. 14范围内均有活性 ,但在
pH6. 50～ 9. 51范围内活性较高 ,该凝集活性在 85℃加热 1 h,活力仍未改变 ,说明具有很强的耐热
性 .
关键词　孔石莼 ,凝集素 ,纯化
中图分类号　 Q946. 1
Isolation, Purif ication and Properties of Lectin fromUlva pertusa
*
LI Dan-tong, CUI Tie-jun, LU Ou,X U Zhong-yuan, GAO Qiang-long , XU Qing-ling
( Departmen t of A quacul tu re,Biochem istry Section ,Dalian Fish eries Col lege,Dal ian 116023,Ch ina )
Abstract　 Iso lation, puri fica tion and properties of lectin from Ulva pertusa were conducted to elu-
cidate the function in inhibition fo r tumo r cell roproduction and the disease prevention and treat-
ments. The green alga Ulva pertusa lection( U PL) had been purified by ex t raction w ith PBS, fo l-
lowed by 20%～ 75% ammonium sulfa te f ractiona tion and an affinity chromatog raphy on the
Bovine-thy ro globulin-Sepharose 4B colum. There appeared one sing le band of lectin on both
PAGE and Iso elect rofo cusing elect rophoretic. It s i soelectric point w as 8. 40, w ith peak abso rption
a t 285 nm. i ts molecular w eigh t was 11 047 on Sephadex G-200. The U PL was nonspeci fic in ag-
g lutina tion fo r any type of human erythrocytes, and the hemagg lutina ting activi ty w as equal. The
agg lutination fo r rabbi ts was the highest , among ery th ro cy tes o f humans ( A, B, AB, O) , rabbits,
common carp and crucian carp. The hemagg lutina ting activi ty fo r rabbit could no t be inhibi ted by
D-fructose, D-galactose, glucose, sucro se, mannan, gamma-globulin( human) and egg albumin, but
inhibi ted by bovine-thy rog lobulin and the minimum inhibi to ry concentration w as 6. 20 g /L. This
lectin had the maximum hemagg lutinating activi ty at pH 6. 50- 9. 51, w ith activi ty at pH4. 0-
10. 14. The hemagg lutinating activi ty w as not af fected by heating fo r 60 min a t 85℃ . So i t had
high heat resistance.
Key words　Ulva pertusa, Lectin, Puri fica tion
　　凝集素 ( lectin)是非免疫起源的蛋白质或糖蛋
白 ,具有凝集细胞 ,抑制肿瘤细胞增殖 ,激活淋巴细
胞 ,抑制血小板凝集 ,毒性等多种功能的生物活性 .
发现凝集素已有百余年 ,但直到 20世纪 40年
代才开始为人们所关注 . 早年人们对凝集素的研究
集中在陆生植物 ,自 70年代后期 ,海洋生物 (海藻、
无脊椎动物、鱼类 )凝集素不断被提取、纯化 .对其性
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 2000. 06. 017
质也逐步有所了解 ,并发现海洋生物凝集素的生物
活性绝不比陆生植物凝集素逊色 .目前 ,已证实多种
海藻中存在凝集素 ,但成功地进行分离纯化的却不
多 ,据堀贯治 [1 ]报道 ,仅有 10种绿藻和 13种红藻的
凝集素被分离纯化 ,并且其中从 5种红藻得到的只
是部分纯化制品 .但是与其它生物凝集素相比 ,有关
海藻凝集素的信息很少 ,海藻凝集素的比较生物化
学研究尚属空白 .其原因是 ,从事海藻凝集素研究的
学者较少 ,采集试验材料须有方便的地理条件 ,以及
海藻凝集素的提纯方法困难 [1 ] .鉴于以上原因 ,海藻
凝集素的研究刚刚处于起步阶段 .
石莼属作为一种潜在的可开发性的凝集素来
源 ,人们对其中的石莼 (Ulva lectuca )凝集素进行了
分离纯化及部分性质研究 [ 2] .孔石莼 (Ulva pertusa )
作为绿藻石莼属的一种 ,其资源丰富 ,迄今为止 ,有
关孔石莼凝集素 (Ulva pertusa lectin, U PL)的研究
很少 , K. Hori对日本海域 53种海藻凝集活力研究
中发现孔石莼等 14种海藻凝集素对兔红细胞具有
一定的血凝活力 ,并进一步测定了其凝集素对兔、
马、绵羊、鸭、鸡、人 ( A、 B、 O、 AB)红细胞的血凝活
力 ,但未进行有关性质 (分子量、等电点、适用 pH范
围、耐热性 )的研究 [3 ] ; Rogers D J报道了唾液糖蛋
白和胎球蛋白对 U PL的凝集活性具有抑制作用 [4 ] .
但目前在国内外尚未见到有关 UPL的分离纯化及
分子量、等电点等性质的报道 ,我们首次成功地采用
了牛甲状腺球蛋白 -Sepharose 4B亲和层析方法对
其纯化 ,并进行了分子量、等电点、适用 pH范围、耐
热性等性质研究 ,以期为海洋药物开发及海产经济
动物病害防治开拓一条新途径 .
1　材料与方法
1. 1　材料
孔石莼采自大连小平岛耗子洞海岸 ,兔购于大
连医科大学实验动物中心 ,人的 A、 B、 O、 AB型血液
由健康学生及教师提供 .
牛甲状腺球蛋白 ,酵母甘露聚糖 ( Sigma) ; CN-
Sepharose 4B, Sephadex G-200,蓝色葡聚糖 ( Blue
Dex tran 2000) ,核糖核酸酶 ( Pharmacia ) ; 球蛋白
( human) ( Serv a ) ; Ampholine pH3. 5～ 9. 5等其它
等电聚焦电泳均采用 LKB产品 ;牛血清白蛋白 (上
海浦江应用生物化学研究所 ) ;卵清蛋白 (上海生化
所东风技术公司 ) ;生理盐水 (辽宁阜新制药厂 ) ,其
它试剂均为国产分析纯或生化试剂 .
1. 2　方法
1. 2. 1　牛甲状腺球蛋白 -Sepha rose 4B的制备 ,用
赵永芳等 [5 ]的方法 .
1. 2. 2　孔石莼凝集素的分离纯化:孔石莼采回后立
即用过滤海水洗净 ,用纱布及滤纸吸去水份 . 称取
200 g鲜重放入冰箱中冷冻 ,然后再置于冷冻干燥
机中冻干 ,将干藻于捣碎机中捣成粉末 ( 43 g )称取
34 g 藻粉加入 0. 15 mol /L NaCl的 PBS ( 0. 015
mo l /L, Na2 HPO4-NaH2 PO4 , pH7. 2) 680 ml浸泡 16
h,离心 ( 4℃ , 5 000 r /min, 55 min) ,取上清液即为粗
提液 .硫酸铵分级:在冰水浴条件下向粗提液加入固
体 ( N H4 ) 2 SO4达 20%饱和度 ,过夜 ( 4℃ ) ,经离心
(同上 ) ,弃沉淀取上清 .在冰水浴条件下向上清液加
入固体 ( N H4 ) 2 SO4至 75%饱和度 ,过夜 ( 4℃ ) ,再离
心 (同上 )收集沉淀溶于蒸馏水中 ,对蒸馏水透析至
无 SO2-4 ,冻干 5 ml,其余部分再对 PBS充分透析 .
取透析后样品 3 ml(含蛋白 70 mg ) ,上亲和层析柱
后 ,流速为 10 ml /h ,待样品全部进入层析柱后 ,静
置 30 min,待其充分反应 . 用 150 ml 0. 15 mol /L
NaCl PBS洗脱至 A280 < 0. 02,然后换用 1 mol /L
NaCl PBS解吸附 ,洗脱与解吸附过程皆分步收集 ,
流速为 15 ml /h , 3 m l /管 ,经 280 nm紫外测定 ,并
检测各管的凝集活性 ,将有活性的凝集素溶液合并 ,
透析 ,冻干得 U PL亲和样品 .
1. 2. 3　蛋白含量测定 [ 6]:用 A280表示 ,以牛血清白
蛋白做对照 .
1. 2. 4　血凝活性测定:离心管用含抗凝剂的生理盐
水溶液润洗后 ,放入新鲜血液 ,用生理盐水离心洗涤
4次 ( 4 000 r /min, 10 min)最后用生理盐水配制成
1%的红细胞悬液 .在 96孔Ⅴ型血凝板上用 40μl凝
集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释后 ,加入
1%红细胞悬液 40μl,振匀 ,室温放置 2 h后 ,肉眼
观察 ,无凝集现象时红细胞沉积在Ⅴ型孔底部呈大
红点状 ,有凝集现象时呈网状不下沉 ,血凝活力以产
生凝集现象时的最小凝集素的量或凝集素最大稀释
倍数表示 .
1. 2. 5　聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE):浓缩胶浓度
5% ,分离胶浓度 15% ,浓缩胶缓冲液 pH为 6. 8,分
离胶缓冲液 pH为 8. 8,电流 17 m A,电泳 5 h,用
10%三氯乙酸固定 ,然后用考马斯亮蓝 R250染色 ,
冰醋酸 -乙醇脱色 ,放入保存液 (乙醇∶冰醋酸∶甘
油∶双蒸馏水= 3∶ 1∶ 1∶ 5) ,然后制成干板保存 .
1. 2. 6　分子量测定: 采用 Sephadex G-200分子筛
凝胶过滤法 [7 ] .
1. 2. 7　紫外吸收光谱测定: 用 751G型分光光度计
775第 6期 李丹彤等:孔石莼 (Ulva pertusa)凝集素的分离纯化及性质的研究 　
测定 240 nm～ 320 nm的光吸收值 .
1. 2. 8　等电聚焦电泳测定等电点:等电聚焦按瑞典
LKB公司多用电泳仪操作手册进行 . Ampho line的
pH范围为 3. 5～ 9. 5,胶浓度 4. 8% ,胶厚度为 0. 5
mm,采用表面电极测胶板 pH.
1. 2. 9　糖抑制试验:在 96孔Ⅴ型血凝板中 ,加入糖
或糖蛋白溶液 40μl,用生理盐水进行倍比稀释 ,然
后加入 40μl能凝集兔红细胞的最小浓度凝集素 ,
静置 15 min(室温 )再加入 40μl 1%兔红细胞振匀 ,
静置 2 h ,观察糖抑制兔红细胞凝集的最小浓度 .
1. 2. 10　 pH对血凝活力的影响: 参照 Ahmed和
Chat terjee方法 [8 ]配制 pH4. 0～ 10. 14的系列缓冲
液 ,测定不同 pH条件下的血凝活力 . pH4. 0～ 6. 0
采用 0. 015 mo l /L的柠檬酸 -Na2HPO4 缓冲液 ,
pH6. 50～ 7. 50采用 0. 015 mol /L磷酸盐缓冲液 ;
pH8. 0～ 9. 0采用 0. 015 mol /L的 Tris-HCl缓冲
液 , pH9. 51～ 10. 14采用 0. 015 mo l /L的 Na2 CO3-
NaHCO3缓冲液 .
1. 2. 11　热稳定性试验:参照文献 [ 9]将浓度为 1 g /
L的 UPL样品分成若干份 ,分别在 25℃～ 85℃的
不同条件下温育于 10 min, 60 min不同时间取样 ,
冷却 ,测定血凝活力 .
2　结　　果
2. 1　孔石莼凝集素的分离纯化
U PL的纯化分为 3个步骤: ( 1)冷冻干燥 , PBS
浸泡 ,离心得绿色粗提液 ; ( 2) 20% ～ 75%硫酸铵分
级沉淀得到黄绿色硫酸铵分级抽提液 ; ( 3)牛甲状腺
球蛋白 -Sepha rose 4B亲和层析 ,用 0. 15 mol /L Na-
Cl PBS平衡缓冲液洗去非特异结合蛋白质 ,然后用
含 1 mo l /L NaCl的 PBS缓冲液洗脱 ,得到一个蛋
白峰 ( Fig. 1) ,具有血凝活力 ,合并有活性部分 ,透
析 ,冷冻干燥得白色样品 , PAGE呈一条蛋白染色带
( Fig. 2) . 纯化结果有关数据见 Table 1.
2. 2　孔石莼凝集素的理化性质
2. 2. 1　 U PL的分子量: 孔石莼凝集素的 20%～
75%硫铵分级抽提液经 Sephadex G-200分子筛层
析 ,得到两个蛋白峰 ,其中第二个蛋白峰具有血凝活
性 ,并且具有两个活力峰 ( Fig. 3) . 用核糖核酸酶
( 13. 7 kD) ,卵清蛋白 ( 45 kD) ,牛血清白蛋白 ( 67
kD ) , 球蛋白 ( 165 kD)为标准绘制标准曲线
( Fig. 4) . 根据孔石莼最大活力峰的 K av求得分子量
为 11 047.
Fig. 1　 Affini ty ch romatograph y of U PL on bovine th y-
roglobulin-sepharose 4B
Column: 10 cm× 1. 0 cm Flowing rate: 15 ml /h, 3 ml /tube
1: 0. 15 mol /L NaCl , 0. 015 mol /L Na2HPO4-Na H2 PO4, pH
7. 2
2: 1 mol /L NaCl, 0. 015 mol /L Na2 HPO4-Na H2 PO4 , pH 7. 2
A280; …… Hemagglutinating activi ty
Fig. 2　 Polyacrylamid e gel elect rophoresis pat tern of U PL
a. 20% - 75% ( N H4 ) 2 SO4 f ractionation; b. Puri fi ed U PL
2. 2. 2　 U PL的紫外吸收光谱: 亲和层析纯化后的
孔石莼凝集素的紫外吸收光谱的最大吸收峰在 285
nm.
　 Table 1　 Purification o f th e lectin fr om Ulva pertusa
Fract ionation　　　 Total protein
/mg
Hemagglutinating
activi ty /U· μg- 1 Total activity /U
Speci fi c activi ty
/U· mg- 1
Purif ication
( fold)
Yield(% )
Crude ext ract 3525 14. 40 2. 45× 105 69. 4 1 100
20% - 75% ( NH4 ) 2 SO4 1353 3. 46 3. 91× 105 289. 0 4 160
Aff ini ty ch romatography 38. 9 0. 40 9. 72× 104 2500 36 40
776 中国生物化学与分子生物学报 16卷
Fig. 3　 Gel fi lt ration of UPL on Sephadex G-200
Column: 90 cm× 1. 6 cm, Flow ing rate: 18 ml /h, 3 ml / tub e.
A280; …… Hemagglutinating activi ty
Fig. 4　 Molecular w eigh t determination of the UPL on
Sephadex G-200
1. Ribonuclease( 13. 7 kD) ; 2. Egg alb umin( 45 kD) ;
3. Bovine serum alb umin ( 67 kD) ; 4. Gamma-globulin ( h u-
man) ( 165 kD) ; 5. U PL
2. 2. 3　 UPL的等电点: 亲和层析纯化后 U PL用等
电聚焦电泳的方法得到单一蛋白染色带 ,其 pI为
8. 40( Fig. 5) .
Fig. 5　 Isoelect rofocusing electroph oretic pat tern of pu ri fi ed
U PL
2. 3　孔石莼凝集素的血凝活性及糖、温度、 pH对
血凝活性的影响
2. 3. 1　血凝活性: 将人 A、 B、 O、 AB 4种血型红细
胞 ,以及鲤 ,鲫及兔红细胞 ,进行血凝活性试验 ,结果
见 Table 2.
Table 2　 Hemagg lutinating activity o f Ulva pertusa lectin
Source of
eryth rocy tes
Rabbit
Common
　　 carp
Crucian
carp
Human
A B O AB
Hemag glu tinating
　　 act ivity 2
4 23 23 22 22 22 22
2. 3. 2　糖抑制实验
孔石莼凝集素浓度为 86. 5 mg /L,用兔红细胞
进行糖抑制实验 ,结果显示孔石莼凝集素不被所测
试的单糖、二糖、聚糖及部分糖蛋白所抑制 ,仅被牛
甲状腺球蛋白所抑制 ,最小抑制浓度为 6. 20 g /L,
结果见 Table 3.
Table 3　 Inhibition of hemagg lutinating activ ity o f UPL by
suga rs and g lycopr oteins
Sugars and
glycop roteins
Ini tial
concent rat ion
Minimum inhibitory
concen tration
D-Galactose 500 mmol /L -
D-Fructose 10 mmol /L -
Glucose 10 mmol /L -
Sucros e 10 mmol /L -
Mannan 46. 5 g /L -
Bovine thy roglobulin 24. 8 g /L 6. 20 g /L
Egg albumin 43. 0 g /L -
Gamma-globulin 80 g /L -
“— ” indicate absence of inhibi ti on
2. 3. 3　热稳定性: 孔石莼凝集素的耐热性高 ,在
25℃～ 85℃保温 60 min,活力均未见改变 ( 85℃保
温 60 min,其活力仍保持 100% ).
2. 3. 4　 pH对血凝活力影响
孔石莼凝集素在 pH4. 0～ 10. 14缓冲系统中
25℃静置 2 h ,用兔红细胞测定其血凝活力 ,当 pH
> 9. 51或 < 6. 50时 ,孔石莼血凝活力明显下降 ,在
pH6. 50～ 9. 51范围内凝集活力较高 ( Table 4) .
　 Table 4　 p H stability o f the lectin f rom Ulva pertusa
pH 4. 0 4. 4 5. 0 6. 0 6. 5 7. 0 7. 2 7. 5 8. 0 8. 5 8. 9 9. 51 10. 14
Hemagg lutination
　　 activi ty 2
1 21 21 22 23 23 23 23 23 23 23 23 22
777第 6期 李丹彤等:孔石莼 (Ulva pertusa)凝集素的分离纯化及性质的研究 　
3　讨　　论
据文献报道 ,唾液糖蛋白和胎球蛋白对 U PL
的凝集活性具有抑制作用 .我们在做糖抑制实验后 ,
发现 U PL不被所测试的单糖、寡糖、聚糖及二种糖
蛋白所抑制 ,被牛甲状腺球蛋白抑制 .利用牛甲状腺
球蛋白 -Sepharose 4B亲和层析进行纯化 ,用 1 mo l /
L NaCl PBS溶液洗脱得到一个蛋白洗脱峰 ,蛋白峰
与活力峰一致 . 经 PAGE显示为单一的蛋白染色
带 ,经等电聚焦电泳显示单一蛋白染色带 ,测得其
pI为 8. 40.实验结果表明 U PL经上述步骤纯化 ,可
获得 UPL的单一样品 . 在研究 U PL的同时又对红
藻角叉菜进行了研究 (待发表 ) ,发现该凝集素也可
用牛甲状腺球蛋白 -Sepha ro se 4B进行纯化 ,推测牛
甲状腺球蛋白 -Sepharose 4B可以确立共同的纯化
海藻凝集素的方法 ,试图以此分离凝集素 .
用 20%～ 75%饱和度的 ( N H4 ) 2 SO4分级沉淀 ,
得到的提纯倍数为 4倍 ,总活力回收为 160% . 回收
率高的原因是粗提物中可能含有其它残余物质 ,如:
多聚糖 ,它可以抑制凝集素的活力甚至阻碍红细胞
膜上的结合位点 .
该分子量测定用 Sephadex G-200分子筛层析 ,
测得 U PL的分子量为 11 047,与文献 [2 ]报道的石莼
的分子量 8. 37 kD比较相似 . 据报道海藻中多数凝
集素的分子量较低 ,如:己报道的最低的来自于相近
的 属 B ryothamnion seaforthi i ( Turner ) kutz 和
B. triquetrum ( Gmelin) How e分子量分别为 4. 5 kD
和 3. 5 kD[10 ] .红藻 Hypnea japonica Tanaka含 4种
凝集素 ,分子量为 4. 2 kD～ 12 kD[ 11] .
U PL对人 ( A、 B、 O、 AB)型及动物红细胞的凝
集活性比较研究结果表明: 兔 > 人 ( A= B= O=
AB) . 本结果与文献报道 , [3 ]兔= 人 ( A)> 人 ( B= O
= AB)的结果不同 . 这也许是由于孔石莼的采集地
点和时间不同造成的 ,其原因尚需进一步探讨 .
U PL对动物红细胞的凝集作用范围较广泛 ,除
人和兔外 ,还有绵羊、马、鸭 [3 ]、鲤、鲫等 .
象大多数海藻凝集素一样 , U PL在宽的 pH和
温度范围表现出活力 ,血凝活力在 pH6. 50～ 9. 51
之间稳定 ,在 pH值 4. 0～ 5. 0范围内保留凝集活力
的 33% ,在 pH10. 14时保留 67%血凝活力 . 该凝集
素在所测试的 25℃～ 85℃范围内活力不变 ,表现出
强的热稳定性 .
经糖抑制实验证明 , U PL血凝活力被牛甲状腺
球蛋白抑制 ,最小抑制浓度为 6. 20 g /L. 该凝集素
不被所测试的单糖: D-半乳糖、 D-果糖、葡萄糖 ,二
糖:蔗糖 ,也不被所测试的甘露聚糖、 球蛋白、卵清蛋
白所抑制. 推测可能该凝集素所识别的特定糖苷键为
Manα( 1-4) Man. 此推测尚需进一步试验证明.
致谢: 承日本广岛大学堀贯治教授、本校刘焕亮教授及
李熙宜教授给予有益指导 ,宋良国老师给予很大帮助 ,在此
表示衷心感谢!
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