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第20卷 第2期
2011年6月
淮海工学院学报(自然科学版)
Journal of Huaihai Institute of Technology(Natural Science Edition)
Vol.20 No.2
Jun.2011
DOI:10.3969/j.issn.1672-6685.2011.02.011
石花菜多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究
*
许瑞波a,b,吴 琳a,王 吉a,周洪英a,巩建龙a,史大华a
(淮海工学院a.化学工程学院;b.江苏省海洋生物技术重点建设实验室,江苏 连云港 222005)
摘 要:利用水提醇沉法提取石花菜多糖(GAP),通过单因素和正交实验考察了温度、时间、料液
比和提取次数等因素对GAP提取率的影响。结果表明,GAP的最适宜提取工艺条件是:料液比为
1g∶30mL,温度75℃,时间2h,提取3次。GAP对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除实验表
明,GAP具有良好的抗氧化活性,而且对2种自由基的清除能力强弱顺序是·OH>O2-·。
关键词:石花菜;多糖;提取;抗氧化活性
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1672-6685(2011)02-0038-04
Study on the Extraction and Antioxidant Activity
of Polysaccharides fromGelidium amansi
XU Rui-boa,b,WU Lina,WANG Ji a,ZHOU Hong-yinga,GONG Jian-longa,SHI Da-huaa
(a.School of Chemical Engineering;b.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,
Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China)
Abstract:Polysaccharides(GAP)was extracted fromGelidium amansii by water-extraction and
ethanol precipitation method.The effects of extraction temperature,time,the ratio of raw mate-
rial to water and extraction times on the yield of GAP were investigated by single factor and or-
thogonal experiments.The results showed that the optimum extraction conditions were as folow-
ing:the ratio of raw material to water is 1g∶30mL,extraction temperature 75℃,extraction
time 2h,and frequency of extraction 3times.The scavenging capacity of GAP to hydroxyl free
radical and superoxide anion free radical were studied,and the results indicated that GAP had
good antioxidant activity and its scavenging capacity to·OH was much higher than that of O2-·.
Key words:Gelidium amansii;polysaccharides;extraction;antioxidant activity
石花菜(Gelidium amansii)属红藻门石花菜科
石花菜属植物,在我国主要分布于渤海、黄海等北部
沿海[1-2]。石花菜是制造琼胶的主要原料[3],是药食
两用海藻。中医认为,石花菜味甘咸,性寒滑,具有
清热解毒的功效[2]。文献[1,4-5]报道石花菜琼脂
胶具有明显的体外延长凝血时间的作用;石花菜所
含的褐藻酸盐、淀粉硫酸酯等类物质具有降压、降脂
等功能;石花菜醇提物具有抗菌、抗氧化活性。
近年来,为了研制新型药物和保健食品,从海洋
资源中寻找生物活性物质已经引起人们的广泛关
注[6],其中海藻被认为是天然抗氧化剂的重要来
源[6-7]。众所周知,多糖是生物体内普遍存在的一类
具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖等特殊生物、药理活性
的生物大分子[8-9]。关于海藻多糖抗氧化活性的研
* 收稿日期:2011-04-11;修订日期:2011-04-21
基金项目:江苏省自然科学基金(企业博士创新)项目(BK2009640);江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题(2009HS06);江苏
省青蓝工程优秀青年骨干教师资助项目(2008);淮海工学院博士科研启动项目(KQ10130)
作者简介:许瑞波(1972-),女,吉林白山人,淮海工学院化学工程学院副教授,博士,主要从事天然产物提取及配位化学方面的研究,
(E-mail)xuruibo9125@163.com。
究越来越多,证实了多种海藻多糖具有很强的清除
羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH和还原力等
作用[6-7,10]。因此,本实验对红藻石花菜多糖进行提
取,优化了石花菜多糖(GAP)提取工艺条件,并进
一步探讨了GAP的抗氧化活性,以期为GAP药物
及功能性食品开发提供理论依据。
1 材料与仪器
原料:将石花菜洗净、阴干,粉碎成菜粉,备用。
主要仪器:WFJ7200型可见分光光度计(上海
尤尼柯有限公司),RE52CS旋转蒸发器(舟山海源
仪器厂),80-2型离心机(金坛荣华仪器厂)。
主要试剂:葡萄糖、硫酸、苯酚、无水乙醇、正丁
醇、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸亚铁
铵、邻二氮菲、盐酸等试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 从石花菜中提取多糖的工艺优化
2.1.1 提取石花菜多糖的操作步骤 准确称取
5.0g石花菜粉放入圆底烧瓶,按一定比例加入蒸馏
水,预浸1h。在一定温度提取一定时间,离心,收集
上清液,后浓缩至一定体积。再加入4倍体积的无
水乙醇,过夜,离心,得到粗多糖。用sevag法去除
蛋白质、核酸等杂质,把纯化后的多糖分别用无水乙
醇、丙酮、乙酸乙酯洗涤3次,烘干即得GAP。
2.1.2 标准曲线的制备 参考文献[11]制备标准
曲线,经线性回归,得标准曲线方程A=43.562ρ+
0.001 9,相关系数r=0.999 2。式中ρ为多糖质量
浓度,mg/mL;A为吸光度。
2.1.3 GAP提取率的测定 量取0.5mL“2.1.1”
中浓缩液,置于25mL容量瓶中用蒸馏水定容。再
准确量取0.5mL该待测液,按照标准曲线制备方
法测量其在490nm处吸光度,根据回归方程计算出
多糖质量浓度,然后按下式计算GAP的提取率:
多糖提取率/%=(多糖质量/原料粉的质量)×
100%=(多糖质量浓度×体积×稀释倍数)/原料粉
的质量×100%。
2.2 GAP体外抗氧化活性研究
2.2.1 对羟基自由基的清除作用 按照文献[12]
方法考察GAP对羟基自由基的清除作用。取6支
10mL比色管,分别依次加入0.3mL 7.5mmol/L
硫酸亚铁铵溶液、0.3mL 7.5mmol/L邻二氮菲溶
液、1mL pH=7.47Tris-HCl缓冲溶液,在2,3,4,
5,6号比色管中各加入0.2mL 7.5mmol/L H2O2,
然后在3,4,5,6号比色管中分别加入1mL质量浓
度分别为2,4,8,10mg/mL的GAP溶液,用蒸馏水
定容至刻度,在37℃水浴锅中,反应1h,在450~
550nm波长范围内扫描,在510nm处出现最大吸
收峰。在该波长处测各吸光度A 值,重复3次,用
平均值计算GAP对羟自由基的清除率:
羟基自由基清除率/%=(A样品-A损)/(A未损-
A损)×100%。
其中:A样品 是加 GAP的体系;A损 是加入 H2O2 没
加GAP的体系;A未损是没加H2O2 和GAP的体系。
2.2.2 对超氧阴离子自由基的清除作用 采用邻
苯三酚自氧化法[8]研究GAP对超氧阴离子自由基
的清除活性。取8支10mL比色管,依次加入10
mg/mL石花菜多糖液(分别为0,0.2,0.4,0.6,
0.8,1.0,1.2,1.4mL)、pH=8.24的 Tris-HCl缓
冲液(其加入量与石花菜多糖液体积之和为5mL),
加入0.3mL 1mmol/L邻苯三酚,用蒸馏水定容至
刻度。在波长322nm 处每隔30s记录一次吸光
度,根据邻苯三酚自氧化速率计算清除率:
超氧阴离子自由基清除率/%=(ΔA1/Δt-
ΔA样品/Δt)/(ΔA1/Δt)×100%。
其中:ΔA1/Δt为邻苯三酚自氧化反应速率;ΔA样品/
Δt为加入样品后邻苯三酚自氧化反应速率。
3 结果与分析
3.1 提取石花菜多糖的正交实验
影响水提醇沉法提取石花菜多糖的主要因素有
提取温度、提取时间、料液比和提取次数,本实验以
多糖提取率为指标,选用L9(34)正交表安排实验,
进行石花菜多糖提取工艺的优化。正交实验结果
(见表1)和方差分析结果(见表2)表明,实验考察的
4个因素即提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)
和提取次数(D)等对石花菜多糖提取率影响的大小
顺序是A>D>B>C,其中提取温度和提取次数对
GAP提取率具有显著性影响。从石花菜中提取多
糖的比较适宜的工艺条件组合是 A3B1C1D3,即石
花菜粉质量(g)与蒸馏水体积(mL)比为1∶30,在65
℃时提取2h,共提3次。
由于提取温度和提取次数对石花菜多糖的提取
率具有非常显著的影响,所以利用单因素实验进一
步确定最适宜的提取温度和提取次数。
93 第2期 许瑞波等:石花菜多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究
表1 正交实验安排与结果
Table 1 Arrangement and result of orthogonal experiment
实验编号
提取温度/℃
A
提取时间/h
B
料液比/(g∶mL)
C
提取次数/次
D
多糖提取率/%
1 1(35) 1(2) 1(1∶30) 1(1) 2.92
2 1 2(3) 2(1∶45) 2(2) 7.71
3 1 3(4) 3(1∶60) 3(3) 6.29
4 2(50) 1 2 3 14.68
5 2 2 3 1 7.34
6 2 3 1 2 12.78
7 3(65) 1 3 2 20.86
8 3 2 1 3 21.09
9 3 3 2 1 9.25
k1 5.64 12.82 12.16 6.50
k2 11.50 12.05 10.55 13.68
k3 17.07 9.34 11.49 14.02
r 11.43 3.48 1.61 7.52
表2 方差分析
Table 2 Analysis of variance of orthogonal experiment
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A因素 195.896 2 49.456 19.000 *
B因素 20.034 2 5.058 19.000
C因素 3.961 2 1.000 19.000
D因素 108.166 2 27.308 19.000 *
误差 3.960 2
3.2 提取石花菜多糖的工艺优化
3.2.1 提取次数对多糖提取率的影响 在料液比
为1g∶30mL,提取温度为65℃时,提取2h,考察提
取次数(1,2,3,4和5次)对多糖提取率的影响,结
果见图1。从图1可以看出,提取次数越多,GAP提
取率越高,当提取次数超过3次时,多糖得率增加的
程度很小,故认为提取3次基本就可以比较充分地
把原料石花菜中的多糖提取出来了,没有进行第4,
5次提取的必要。因此,确定提取石花菜3次。
图1 提取次数对多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of extraction times on the yield of polysaccharides
3.2.2 提取温度对多糖提取率的影响 在料液比
为1g∶30mL,提取2h,提取3次,考察提取温度
(55,60,65,70,75℃)对多糖提取率的影响,结果见
图2。可以看出,随着温度的升高,GAP的提取率
也逐渐增加,说明升高温度有利于从石花菜中提取
多糖。在55~70℃范围内,GAP提取率增加比较
明显,当温度达到75℃时,GAP提取率增加缓慢,
变化较小。因此,最适宜的提取温度选择为75℃。
图2 提取温度对多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of temperature on the yield of polysaccharides
通过正交实验设计和单因素实验可以确定从石
花菜中提取多糖的最适宜工艺条件是料液比为1∶
30,提取温度75℃,提取2h,提取3次。在此条件
下,GAP的提取率高达30.17%。
3.3 GAP体外抗氧化活性
3.3.1 GAP对羟基自由基的清除率 不同质量浓
度的GAP对羟基自由基的清除结果见图3。从图3
可以看出,在实验范围内,随着GAP质量浓度的增
大,清除羟基自由基的能力增强,说明GAP对羟基
自由基具有较好的清除能力。
3.3.2 GAP对超氧阴离子自由基的清除率 不同
质量浓度的GAP对超氧阴离子自由基的清除结果
04 淮海工学院学报(自然科学版) 2011年6月
见图4。从图4可以看出,GAP对超氧阴离子自由
基具有一定的清除能力,在实验范围内,随着GAP
质量浓度的增大,清除超氧阴离子自由基的能力增
强。在相同质量浓度下,从石花菜中提取的多糖对
羟基自由基的清除能力显著高于对超氧阴离子自由
基的清除能力[2]。
4 结论
寻找天然抗氧化剂,尤其是从海藻中提取有效
的抗氧化剂必将成为开发海洋资源的一个研究热
点。石花菜是常见的经济海藻,本实验对石花菜进
行了水提醇沉法的工艺研究,并对 GAP清除羟基
自由基和超氧阴离子自由基的能力进行初步研究。
通过单因素和正交实验优化了从石花菜中提取
多糖的工艺条件,结果表明,料液比为1g∶30mL,
温度75℃,提取2h,提取3次,GAP的提取率高达
30.17%。采用sevag法去除 GAP中所含的蛋白
质、核酸等杂质,然后分别用无水乙醇、丙酮、乙酸乙
酯洗涤3次,烘箱中50℃烘干即得较纯的GAP。
通过对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除
实验测定了石花菜多糖的抗氧化活性。结果证明
GAP具有较好的抗氧化活性,当GAP质量浓度为
10mg/mL时,对羟基自由基的清除率约为47%,而
对超氧阴离子自由基的清除率约为14%,说明在该
工艺条件下提取的GAP对羟基自由基的清除效果
要明显强于对超氧阴离子自由基的清除效果。
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(责任编辑:褚金红 实习编辑:许 多)
14 第2期 许瑞波等:石花菜多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究