全 文 ：坛紫菜多糖对脾细胞活性的影响
张全斌1 , 李大新2 ,于鹏展1 ,刘希光1 ,李智恩1 ,徐祖洪1
(1.中国科学院海洋研究所 ,山东 青岛 , 266071;2.山东省医药公司 ,山东 济南 , 250013)
摘　要:目的:坛紫菜多糖分级组分 F1 、F2和 F3 是从坛紫菜中通过热水提取及 DEAE-纤维素层析得到的
3 个多糖组分。本文研究了坛紫菜多糖组分对大鼠脾细胞活性的影响。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色方法研
究坛紫菜多糖组分对大鼠脾细胞活性的影响。结果:F1和 F2 对脾细胞的活性具有明显的抑制作用 , F3 对脾
细胞活性也有一定的抑制作用。而且 3 种多糖组分能够显著抑制紫外线损伤的脾细胞的活性。结论:坛紫菜
多糖对免疫细胞的活性具有明显的抑制作用 , 可能是一种潜在的免疫抑制剂。
关键词:坛紫菜;多糖;脾细胞;紫外线损伤
中图分类号:931.77　R967　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2003)06-0014-05
Effect of polysaccharides from Porphyra haitanensis on the ac-
tivities of spleen cells
ZHANG Quan-bin , LI Da-xin , YU Peng-zhan , et al .
(Inst itute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Qingdao 266071 , China)
Abstract:Objective Polysaccharide fractions F1 , F2 and F3 w ere prepared f rom Porphyra haita-
nensis by hot-water ex traction and DEAE-cellulose chromatog raphy .Their effects on the activity
of spleen cells were investigated in this study.Methods MTT tetrazolium assay w as adopted to
study the ef fect of these polysaccharide fractions on the activity of spleen cells.Results F1 and F2
showed significant inhibitory ef fect on the activity of spleen cells.F3 exhibi ted slight inhibitory
effect.All the f ractions markedly inhibited the activities of spleen cells damaged by ult raviolet ra-
diation.Conclusion Poly saccharide f ractions from Porphyra hai tanensis significantly inhibit the
activi ty of spleen cells.The test results indicated that they are po tential immunosuppressive a-
gents.
Key words:Porphyra haitanensis;polysaccharide;spleen cell;ult raviolet damage
　许多研究表明多糖作为免疫调节剂可促进
机体的细胞免疫和体液免疫。紫菜多糖是紫
菜中的主要成分之一 ,研究表明紫菜多糖具
有多方面的生物活性。 Yashizaw a 等[ 1 , 2] 从
条斑紫菜中得到的多糖能够激活巨噬细胞 ,
具有免疫增强作用;但张伟云等[ 3-5] 从条斑
紫菜中分离得到的多糖组分抑制免疫细胞的
增殖 ,对免疫系统表现出负向的调节作用。
坛紫菜是我国南方主要的经济海藻之一 。我
们从福建产坛紫菜中分离到 3个多糖组分 ,
分别为 F1 、F2和 F3[ 6] 。为了探讨坛紫菜多
糖的免疫调节作用 ,本文研究了坛紫菜多糖
组分对免疫细胞活性的影响。
1　材料与方法
1.1　材料
坛紫菜多糖分级组分 F1 、F2 、F3是从福
建连江县产坛紫菜 Porphyra hai tanensis T .
J.Chang et B.F.Zheng 中 ,通过热水提取和
离子交换纤维素层析分级得到的 3个多糖组
14 《中国海洋药物》杂志 2003 年第 6 期(总第 96 期)
分。三者均为半乳聚糖硫酸酯 。它们的硫酸
基含量分别为 17.4%、20.5%和33.5%[ 6] 。
坛紫菜生物品种由中国科学院海洋研究所陆
保仁教授鉴定。
RPIM 1640 细胞培养液 、小牛血清为
Gibco 公司产品;3-(4 , 5-二甲基噻唑-2 酰
基)-2 ,5二苯基四氮唑溴盐(简称 MTT 或噻
唑蓝)为 Sigma 公司产品;其它试剂均为分析
纯或生化试剂。
1.2　仪器
UVA 型紫外辐射仪(波长范围 320-
400nm ,峰值波长 365nm)和 UVB 型紫外辐
射仪(波长范围 230290nm ,峰值波长254nm)
北京师范大学光电仪器厂生产;Rosys An-
thos 2010 酶标仪是瑞典 Anthos公司产品;
MCO 175 CO2孵箱是日本 Sanyo 公司产品 。
1.3　脾细胞的制备
无菌取健康 Wistar大鼠脾脏 ,按照常规
方法制备脾细胞 ,加入含 10%的小牛血清的
RPIM 1640培养液(完全培养液),调其细胞
浓度至 1.38×106·mL-1 。
1.4　坛紫菜多糖对大鼠脾细胞活性的影响
将大鼠脾细胞接种于 96 孔板 ,分为 16
组 ,分别为对照组 ,坛紫菜多糖分级组分 F1 、
F2和 F3 各 5 个浓度组(分别为 5 、10 、20 、
40 、80mg·L-1)。每组 4 个复孔。每孔加细
胞悬液 100μL ,并加入不同浓度的坛紫菜多
糖使最终浓度达到所需浓度 ,调总反应浓度
相同 ,置 5%CO2培养箱中 37℃培养 24h 。采
用 MT T 法进行检测。
1.5　坛紫菜多糖对紫外线损伤的大鼠脾细
胞的活性的修复实验
1.5.1　坛紫菜多糖对长波紫外线(UVA)损
伤的影响
将大鼠脾细胞接种于 96孔板 ,分为 17
组 ,分别为正常对照组 、损伤对照组 ,坛紫菜多
糖F1 、F2和 F3各 5个浓度组(分别为 5 、10 、
20、40 、80mg·L-1)。每组 4个复孔。每孔加细
胞悬液 100μL ,正常对照组的细胞不经过
UVA 损伤 ,其余各组均在 UVA 下照射10s ,照
射强度为 120μW·cm-2 ,然后置 5%CO2培养箱
中37℃培养2h后 ,加入不同浓度的坛紫菜多
糖使最终浓度达到所需浓度 , 37℃5%CO2温
育22h 。进行 MTT 检测。
1.5.2　坛紫菜多糖对中波紫外线(UVB)损
伤的影响
紫外线照射改为在 UVB下照射 40s ,照
射强度为 10.2μW·cm-2 ,其余步骤同1.5.1。
1.6　坛紫菜多糖预先给药对紫外线损伤的
大鼠脾脏淋巴细胞的保护实验
1.6.1　坛紫菜多糖对长波紫外线(UVA)损
伤的影响
将大鼠脾细胞接种于 96 孔板 ,分为 17
组 ,分别为正常对照组 ,损伤对照组 ,坛紫菜
多糖 F1 、F2和 F3各 5 个浓度组(分别为 5 、
10 、20 、40 、80 mg·L-1)。每组 4 个复孔。每
孔加细胞悬液 100μL ,加入不同浓度的坛紫
菜多糖使最终浓度达到所需浓度 , 37℃5%
CO2温育 2h 。之后正常对照组的细胞不经过
UVA 损伤 ,其余各组均在 UVA下照射 10s ,
照射强度为 120μW·cm-2 ,然后置 5%CO2培
养箱中 37℃培养 22h后 ,进行 MTT 检测 。
1.6.2　紫菜多糖对中波紫外线(UVB)损伤
的影响
紫外线照射改为在 UVB下照射 40s ,照
射强度为 10.2μW·cm-2 ,其余步骤同1.6.1。
1.7　MTT 法[ 7]
常规培养细胞之后在每 100μL 细胞培
养液中加入 10μL 浓度为 5g·L-1的 MTT 溶
液 ,继续孵育 4h ,离心弃上清液 。然后向各
孔中加入 150μL 二甲基亚砜 ,充分振荡 ,在
492nm 处比色。
1.8　数据分析
数据结果以 x ±s 表示 , 采用单因素方
差分析(ANOVA)对数据进行处理 ,组间差
异以 t检验进行分析。
15《中国海洋药物》杂志 2003 年第 6 期(总第 96 期)
2　结果
2.1　坛紫菜多糖对大鼠脾细胞活性的影响
坛紫菜多糖 F1 、F2和 F3对大鼠脾细胞
活性的影响见表 1。从 ANOVA 分析结果
看 ,F1和 F2均对大鼠脾细胞活性具有显著
的抑制作用 。F3不影响脾细胞的活性。对
各实验组间差异进行 t-检验分析 ,可以看出 ,
除最小浓度给药组外 ,F1的其它 4个给药组
均显著抑制脾细胞的活性;F2的分析结果与
F1相似;F3只在浓度为 40mg·L-1以上时表
现出明显的抑制作用 ,在其它给药浓度时对
细胞活性的作用不明显。
2.2　坛紫菜多糖预先给药对紫外线损伤脾
细胞的保护实验
表2显示坛紫菜多糖 F1 、F2和 F3 预先
给药对 UVA 损伤的脾细胞的活性的影响。
可以看出 3种坛紫菜多糖均不能保护细胞免
受 UVA 损伤 ,反而使脾细胞的活性进一步降
低。三者的作用较为一致 ,且给药浓度的改变
与细胞的损害程度之间没有明显的相关性。
表3所示为坛紫菜多糖预先给药对 UVB
损伤脾细胞活性的影响。从 ANOVA 分析结
果看 ,F1对 UVB损伤的脾细胞活性没有显著
影响 ,而 F2和 F3对 UVB损伤的脾细胞具有
进一步的抑制作用。3 种多糖组分的作用都
不具有浓度依赖关系。从 t-检验分析结果来
看 ,与对照组相比 , F1和 F2都是只有 1个浓
度对细胞的活性具有明显的抑制作用 ,而 F3
只有在最大浓度时对紫外线 B损伤的细胞活
性的抑制作用不显著 ,在其它浓度时均显著抑
制紫外线 B损伤的细胞活性。
表 1　坛紫菜多糖对大鼠脾细胞活性的影响(A值 , n=4)
浓度(mg·L-1) F1 F2 F3
正常对照 0.138±0.005 0.138±0.005 0.138±0.005
5 0.132±0.009 0.113±0.034 0.134±0.013
10 0.102±0.013＊＊ 0.102±0.013＊ 0.135±0.005
20 0.095±0.011＊＊ 0.088±0.003＊＊ 0.126±0.014
40 0.099±0.006＊＊ 0.090±0.015＊＊ 0.120±0.010＊
80 0.090±0.001＊＊ 0.092±0.013＊＊ 0.126±0.005＊
注:＊P<0.05;＊＊P<0.01 vs 正常对照组
表 2　坛紫菜多糖预先给药对 UVA 损伤脾细胞的活性的影响(A 值 , n=4)
浓度(mg·L-1) F1 F2 F3
正常对照 0.138±0.005 0.138±0.005 0.138±0.005
损伤对照 0.128±0.009 0.128±0.009 0.128±0.009
5 0.091±0.004＊＊ 0.093±0.010＊＊ 0.094±0.002＊＊
10 0.092±0.003＊＊ 0.091±0.004＊＊ 0.091±0.004＊＊
20 0.093±0.008＊＊ 0.095±0.002＊＊ 0.093±0.008＊＊
40 0.096±0.003＊＊ 0.099±0.015＊ 0.096±0.003＊
80 0.091±0.012＊ 0.093±0.008＊＊ 0.091±0.012＊
注:＊P<0.05;＊＊P<0.01 vs 损伤对照组
2.3　坛紫菜多糖对紫外线损伤的大鼠脾细
胞活性的修复实验
表 4 显示采用 UVA 照射损伤脾细胞
后 ,再加入坛紫菜多糖对脾细胞活性的影响 。
UVA 损伤脾细胞后 ,加入坛紫菜多糖 F1 、F2
和 F3 均不能够提高脾细胞的活性 ,反而对
16 《中国海洋药物》杂志 2003 年第 6 期(总第 96 期)
细胞的活性具有明显的抑制作用 。3 种多糖
组分的作用没有明显的差异。而且它们的作
用与浓度没有明显的相关性。
表 5为 UVB 照射损伤脾细胞后 ,再加
入坛紫菜多糖对脾细胞活性的影响 。3种坛
紫菜多糖组分对 UVB损伤的大鼠脾细胞的
活性均具有明显的抑制作用。而且从 t-检验
结果可知 ,与对照组相比 , 3种多糖组分的所
有给药浓度均明显降低 UVB 损伤脾细胞的
活性 。
表 3　坛紫菜多糖预先给药对 UVB损伤脾细胞的活性的影响(A值 , n=4)
浓度(mg·L-1) F1 F2 F3
正常对照 0.138±0.005＊＊ 0.138±0.005＊＊ 0.138±0.005＊＊
损伤对照 0.091±0.002 0.091±0.002 0.091±0.002
5 0.091±0.006 0.080±0.005＊ 0.078±0.005＊
10 0.082±0.002＊＊ 0.085±0.005 0.083±0.002＊
20 0.088±0.008 0.093±0.002 0.079±0.005＊
40 0.090±0.006 0.085±0.002 0.081±0.006＊
80 0.087±0.004 0.084±0.006 0.084±0.007＊
注:＊P<0.05;＊＊P<0.01 vs 损伤对照组
表 4　坛紫菜多糖对 UVA 损伤的大鼠脾细胞活性的影响(A 值 , n=4)
浓度(mg·L-1) F1 F2 F3
正常对照 0.138±0.005 0.138±0.005 0.138±0.005
损伤对照 0.127±0.009 0.127±0.009 0.127±0.009
5 0.100±0.019＊ 0.091±0.004＊＊ 0.101±0.007＊＊
10 0.088±0.007＊＊ 0.099±0.011＊ 0.095±0.007＊＊
20 0.091±0.003＊＊ 0.096±0.004＊＊ 0.089±0.007＊＊
40 0.097±0.011＊ 0.098±0.007＊ 0.097±0.005＊＊
80 0.096±0.002＊＊ 0.092±0.004＊＊ 0.103±0.002＊＊
注:＊P<0.05;＊＊P <0.01 v s损伤对照组
表 5　坛紫菜多糖对 UVB损伤的大鼠脾细胞活性的影响(A值 , n=4)
浓度(mg·L-1) F1 F2 F3
正常对照 0.138±0.005＊ 0.138±0.005＊ 0.138±0.005＊
损伤对照 0.120±0.009 0.120±0.009 0.120±0.009
5 0.089±0.008＊＊ 0.089±0.012＊ 0.101±0.009＊＊
10 0.082±0.004＊＊ 0.086±0.003＊＊ 0.105±0.005＊
20 0.087±0.008＊＊ 0.091±0.010＊＊ 0.089±0.003＊＊
40 0.079±0.004＊＊ 0.091±0.004＊＊ 0.086±0.008＊＊
80 0.078±0.006＊＊ 0.085±0.007＊＊ 0.089±0.004＊＊
注:＊P<0.05;＊＊P<0.01 vs 损伤对照组
3　讨论
本实验采用 MTT 法检测坛紫菜多糖对
大鼠脾细胞自发增殖活性的影响。与大多数
多糖类物质具有免疫增强作用不同 ,坛紫菜
多糖反而表现出免疫抑制作用 。坛紫菜多糖
分级组分 F1和 F2 对脾细胞的活性均具有
明显的抑制作用 ,F3对脾细胞活性也具有一
定的抑制作用 。多糖对细胞的抑制作用包括
两个方面 ,一方面是样品直接的细胞毒作用 ,
17《中国海洋药物》杂志 2003 年第 6 期(总第 96 期)
另一方面是样品对细胞增殖的抑制 。考虑到
在本实验中所采用的多糖浓度非常小 ,而且
文献中也很少有关于多糖类物质细胞毒作用
的报道 ,我们认为坛紫菜多糖对细胞活性的
抑制作用是由于其对细胞增殖的抑制。张伟
云等[ 3-5]发现条斑紫菜的 4个多糖组分中有
2个表现出明显的对免疫细胞增殖的抑制作
用。这与本文的结果是一致的。 Yashizama
等[ 1 ,2]从条斑紫菜中分离得到的 2个多糖组
分能够激活巨噬细胞的功能 ,表现出免疫增
强活性 。分析这些结果的差异 ,一方面可能
是由于所得到的多糖组分的化学组成及结构
有差异;另一方面可能与采用的实验方法及
选用的免疫细胞不同有关 。
紫外线根据波长的不同分为:长波紫外
线(UVA , 400320nm)、中波紫外线(UVB ,
320280nm)和短 波 紫 外线 (UVC , 280-
200nm)。在自然界中 , UVA 约占 95%,
UVB只占 5%左右。近来研究发现 ,紫外线
具有降低淋巴细胞活性 、诱导细胞凋亡的作
用。UVB具有选择性降低淋巴细胞和抗原
提呈细胞免疫活性的作用[ 8 ,9] 。UVA 可造
成细胞核和线粒体 DNA 损伤;可在体外实
验中诱导多种细胞发生凋亡[ 10] 。
在本实验中 ,大鼠脾细胞经过紫外线照
射后活性均有所降低 。表明紫外线照射能够
降低脾脏淋巴细胞的活性 。这与文献报道的
结果是相吻合的。实验中发现 UVB照射对
脾细胞所造成的损伤大于 UVA 照射造成的
损伤 。坛紫菜多糖无论是预先给药还是紫外
线照射后给药都不能保护脾细胞免于紫外线
损伤 ,反而进一步降低细胞的活性。已有研
究显示 ,活性氧在紫外线光老化中起重要作
用[ 11] 。来自体外研究的大量证据表明 ,在
UVA 诱导的生化改变中 ,包括膜脂质损伤 、
细胞凋亡 、DNA碱基改变和基因突变 ,氧化
应激均发挥着重要的作用 。我们以前的研究
已经表明坛紫菜多糖具有清除活性氧自由
基 、抗氧化作用[ 6] 。那么坛紫菜多糖对紫外
线损伤的脾细胞应该存在两方面的作用:一
方面多糖本身对脾细胞活性具有抑制作用 ,
另一方面多糖能够对抗紫外线造成的氧化损
伤对细胞具有一定的保护作用 。但是从最终
的实验结果看 ,各坛紫菜多糖给药组细胞活
性较对照组有明显的降低 ,这说明坛紫菜多
糖本身对脾细胞的抑制作用起着主要作用。
坛紫菜多糖对脾细胞活性的抑制作用表
明坛紫菜多糖可能是一种潜在的免疫抑制
剂 ,可能用于临床免疫亢进的治疗 。
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(收稿日期:2003-06-07)
18 《中国海洋药物》杂志 2003 年第 6 期(总第 96 期)