全 文 ：第 37卷　第 2期
2001年 3月 　　　
南京大学学报(自然科学)
JO URNAL OF NANJING UNIVERSITY
(NATURAL SCIENCES)
　　　　Vol.37 , No.2
M ar., 2001
坛紫菜多糖的分离纯化和结构分析(Ⅱ)
吕　燕1 ,陈　颢1 ,汪水娟1 ,费修绠2 ,张伟云1
(1.南京大学生物系 , 南京 , 210093;2.中国科学院海洋研究所 ,青岛 , 266073)
摘　要:　对广东产坛紫菜沸水提取多糖采用 Sevag 法脱蛋白 ,冻干后得粗多糖 ,得率为 8%.在
粗多糖溶液中加入 CTAB以沉淀除去酸性多糖 PP1 , 超滤以纯化中性多糖 PP2 , PP2 经 DEAE-
纤维素 、葡聚糖凝胶 G200 进一步纯化.经纸层析 、凝胶过滤及紫外光谱分析鉴定为纯品.通过红
外光谱 、气相色谱对 PP2 进行组成分析 , 再用化学方法测定其总糖 , 3 , 6-内醚-L-半乳糖及硫酸
基的含量 , 分别为 86.33%、5.425%和 12.2%.最后通过高碘酸氧化 , Smith 降解等方法测定
PP2 的化学结构 ,结果表明 , PP2 由半乳糖 、3 , 6-内醚-L-半乳糖 、甘露糖 、葡萄糖 、木糖和阿拉伯
糖组成 ,具有α,β 型糖苷键 ,连接方式有(1※3)、(1※4)、(1※2)3 种.PP1 分子量通过凝胶过滤
法初步测得为 16.2 万左右.
关键词:　坛紫菜 , 多糖 ,分离 , 纯化 ,结构分析
中图分类号:　Q53
　　坛紫菜(Porphyra haitanensis)是产于我国南方的一种重要经济红藻.紫菜多糖是紫菜
重要组成成份 ,它除了具有传统工业价值 ,广泛用于食品和轻工纺织业 ,还具有多种生物活
性及药用价值.周慧萍等报道紫菜多糖具有明显的抗凝血 、降血脂 、抗血栓 、强心作用[ 1] ,还
具有抑制肿瘤 、降低血糖 、抗炎和防治溃疡等作用[ 2] .另据报道紫菜多糖有明显增强细胞免
疫和体液免疫的功能 ,如促进淋巴细胞转化增加吞噬细胞功能 ,增强免疫器官重量 ,凝集红
细胞 ,增加血清蛋白的合成和促进血清溶血素的形成[ 3] .本文讨论了从坛紫菜中分离纯化
酸性坛紫菜多糖 PP1和中性坛紫菜多糖 PP2的工艺流程 ,并对 PP2进行了结构分析.
1　材　料
　　实验用的坛紫菜 P .haitanensis180品系由中国科学院海洋研究所费修绠课题组提供 ,
鲜活材料采自广东湛江硇州岛海区栽培试验筏架 ,1998年 3月 1日采集 ,3月 2日空运到南
京后-20 ℃冷冻保存备用.
2　方法与结果
2.1　提取　坛紫菜 95%乙醇 60 ℃回流提取 2次 ,每次 3 h ,纱布过滤 ,滤渣蒸馏水(pH 7)
100 ℃提取 3次 ,每次 3 h ,水提取液浓缩 ,Sevag 法脱蛋白 ,冻干得坛紫菜多糖粗品 ,得率约
为 8%.
基金项目:中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验室(EM BLC)(973005a)收稿日期:2000-02-15
2.2　分离　将粗多糖 800 mg 溶于 80 mL 0.02 mol/L Na2SO4 溶液 ,加入 8 mL 10%的
CTAB ,离心收集沉淀 ,溶于 250 mL 2 mol/L 的 NaCl溶液中 ,超滤冻干得 PP1粗品.上清液
浓缩至 50 mL ,加 4倍体积 95%乙醇沉淀 ,冻干得 PP2粗品.
2.3　纯化　PP1 、PP2粗品分别用离子交换纤维素 DE52 于室温分离纯化.DE52装柱(2.6
cm×20 cm)后蒸馏水平衡过夜 ,流速 0.22 mL/min ,上样量100 mg ,上样体积 4 mL ,蒸馏水
洗脱 30管后 ,以蒸馏水 125 mL和 3 mol/ L NaCl 125 mL 梯度洗脱 ,BSZ-100型自动分部收
集器收集 ,每管 3.3 mL.收集液用苯酚-硫酸法检测 ,以管号为横坐标 ,光密度为纵坐标作
图 ,收集蒸馏水洗脱多糖液和 NaCl梯度洗脱多糖液 ,透析冻干 ,分别得 PP2 、PP1半纯品.
PP2半纯品用葡聚糖凝胶G200室温进一步纯化.G200装柱(2.6 cm×60 cm)后蒸馏水
平衡 40 h ,流速 0.2 mL/min ,上样量 20 mg ,上样体积 1 mL ,蒸馏水洗脱 ,以同样方法收集 ,
检测 ,合并单一洗脱峰的多糖液 ,透析冻干 ,得 PP2纯品.
2.4　纯度鉴定
2.4.1　纸层析　取新华 1号滤纸(3 cm ×20 cm),距端点 1 cm 处的中部以 PP2水溶液点
样 ,展层剂为正丁醇:浓氨水:水(40∶50∶5),饱和 2 h 以上 ,室温展层 6 h ,取出后吹干 ,用
0.5%甲苯胺蓝液染色 ,立即用 95%乙醇漂洗至背景褪色 ,PP2只有一个斑点.
2.4.2　凝胶过滤 　G200装柱(1 cm ×50 cm),柱高 41 cm ,蒸馏水平衡 ,流速 0.12 mL/
min ,PP2上样量 2 mg ,体积 0.5 mL ,用蒸馏水洗脱 ,每管 1.2 mL 分部收集 ,苯酚-硫酸显
色 ,以管号为横坐标 ,光密度为纵坐标作图 ,洗脱曲线为单一洗脱峰.
2.4.3　紫外光谱分析　PP2配成 0.1%水溶液 , KONTRON UVKON860型紫外分析仪上
对 200 ～ 400 nm区间扫描 ,250 ～ 280 nm 间无吸收 ,表明其中无蛋白质 、氨基酸及核酸.
2.5　组成分析
图 1　中性多糖 PP2 单糖组成气相色谱分析
Fig.1　GC analysis of neutral polysaccharide PP2
2.5.1　气相色谱　PP2 10 mg ,加入 2 mol/L 三氟乙酸 3 mL ,100 ℃密闭水解 6 h.减压蒸
发至干 ,如此重复 3次.加入 10 mg 盐酸羟胺 ,0.5 mL 吡啶 ,放入 90 ℃水浴加热反应 30 min
并振荡.取出后冷至室温 ,加入 0.5 mL 醋酸酐 ,在 90 ℃继续反应 30 min ,乙酰化完成 ,反应
产物直接用于气相色谱分析.以 L-鼠李糖 、D-岩藻糖 、D-阿拉伯糖 、D-木糖 、D-甘露糖 、D-葡
萄糖 、D-半乳糖为标准单糖 ,同样处理后进行气相色谱分析.气相色谱仪为 HP-5型 ,30.0 m
×2 mm 弹性石英毛细管柱 ,固定液为 5%苯甲基硅烷.气体流速:载气 N2 25 mL/min ;H2
30 mL/min;空气 400 mL/min.进样量为 1.0μL .检测器温度300 ℃,进样口温度280 ℃,柱
温为 160℃0.2 ℃/ min 170℃30 ℃/min 250℃5 min 250 ℃(SUGAR14方法).结果表明 PP2至少由
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图 2　标准单糖气相色谱分析(SUGAR14 方法)
Fig.2　GC anlysis of standard monosaccharides by SUGAR14.M
表 1　中性多糖 PP2 单糖组成气相色谱分析
Table 1　GC analysis of neutral polysaccharide PP2
单糖组成 阿拉伯糖 木糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖
出峰时间/ min 18.097 19.534 41.996 44.811 48.593
峰面积 0.898 17 1.313 16 2.949 21 15.570 449 79.134 97
表 2　标准单糖气相色谱分析(SUGAR14 方法)
Table 2　GC analysis of standard monosaccharides by SUGAR14.M
单糖组成 核糖 鼠李糖 阿拉伯糖 岩藻糖 木糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖
出峰时间/min 17.051 17.391 18.373 19.180 19.441 42.578 44.538 48.091
半乳糖 、甘露糖 、葡萄糖 、木糖和阿拉伯糖组成 (图 1 ,图 2;表 1 , 表 2).
2.5.2　红外光谱分析　将 PP2用 KBr压片 ,在N ICOET170-SXFT 型红外光谱仪上进行红
外分析.PP2在 3 600 ～ 3 200(3 417.6)cm-1处有宽展圆滑强吸收峰 ,为-OH 伸缩振动;
3 000 ～ 2 800(2 961.0 , 2 931.5)cm-1处有一组吸收峰 ,为CH3 , CH2 , CH等的 C-H伸缩
振动;1 240 cm-1 ,820 cm-1处有弱吸收峰 ,分别为 S=O , C-O-S伸缩振动 ,表明PP1含少量硫
酸基;1 200～ 1 000 cm-1处有较强吸收峰 ,这与分子上连接的硫酸基引起C-H 伸缩振动强度的增
加有关;931.1 cm-1处有明显吸收表明 PP2含有 3 ,6-内醚-L-半乳糖[ 4] ＊＊(图 3).
2.5.3　化学分析
2.5.3.1　总糖　用 Dubois等[ 5 , 6]的蒽酮-硫酸法 ,以半乳糖为标准测定.不同浓度标准半乳
糖溶液 1 mL ,冰浴后加入 5 mL蒽酮试剂 ,振摇后于 80 ℃恒温加热反应 20 min ,冷至室温 ,
640 nm 波长比色 ,对其浓度作标准曲线.PP2水溶液 1 mL 同样处理后查标准曲线得总糖含
量为 86.33%.
2.5.3.2　3 , 6-内醚-L-半乳糖　用 Yaphe 等[ 6 , 7]的方法 ,以果糖为标准测定.不同浓度标准
果糖-饱和苯甲酸溶液 1 mL ,冰浴后加入 5 mL 新配间苯二酚试剂 ,振摇均匀于 80 ℃恒温加
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注:3 , 6-内醚-L-半乳糖因分子含醚桥而不宜用普通 GC组成分析验出 , 宜用间苯二酚法 ,阿拉伯糖因含量过低 ,
Smi th降解单糖组成 GC分析无法检出 ,单糖组成 GC分析却检出了.
＊＊注:2 145.6 、2 044.7 、 2037.2 cm-1一组峰由中性多糖 PP2中所含 CTAB引起
热反应 10 min ,冰浴后于 550 nm 波长比色 ,对其摩尔浓度作标准曲线.PP2水溶液 1 mL 同
样处理后查标准曲线 ,乘以分子量 144和校正系数 1.087即得 3 ,6-内醚-L-半乳糖的含量为
5.425%.
图 3　中性多糖 PP2 红外光谱
Fig.3　Infrared spectrum of neutral polysaccharide PP2
2.5.3.3　硫酸基　通过酸水解从糖复合物中释放硫酸基 ,生成硫酸钡 ,用分光光度法测
定[ 8] .不同浓度 K2SO4 溶液 0.1 mL , 8%三氯乙酸溶液 0.35 mL , 0.5%BaCl2-明胶溶液
0.25 mL ,混和静置20 min于360 nm 波长测定浊度 ,对其浓度作标准曲线.PP2三氟乙酸水
解液一份作同样处理 ,另一份用 0.5%明胶代替 BaCl2-明胶溶液 ,吸光值相减后查标准曲线
得 PP2中硫酸基的含量为 12.2%.
2.6　糖苷键分析
2.6.1　高碘酸氧化　PP2 16.2 mg 溶解于 15 mmol/L NaIO4 溶液 50 mL 置暗处(4 ℃)间
隔时间取样 ,紫外分光光度计在 223 nm 处测定高碘酸的消耗量 ,当 IO-4 消耗达到一稳定值
时 ,用 0.01 mol/L NaOH 溶液测定样品中甲酸的生成量.PP2平均每个糖基消耗 0.925分
子高碘酸 ,并且无甲酸释放.由高碘酸的消耗量 ,推算出 1※3与 1※2和(或 1※4)糖苷键之
比约为 92.5:7.5[ 8] .
2.6.2　Smith 降解　PP2高碘酸氧化完成后 ,取 45 mL 反应液 ,加 2 mL 乙二醇透析过夜 ,
用硼氢化钠还原 ,醋酸中和 ,透析 48 h ,蒸发至干得多糖醇 ,加三氟乙酸水解并蒸干得糖醇 ,
加入吡啶和醋酸酐 ,乙酰化完成后进行气相色谱分析.柱温为 170 ℃1 ℃/min185 ℃5 ℃/min210
℃20 ℃/min 250 ℃3 min 250 ℃(SUGAR9方法).以甘油 、赤藓醇 、L-鼠李糖 、D-岩藻糖 、D-阿拉
伯糖 、D-木糖 、D-甘露糖 、D-葡萄糖和 D-半乳糖为标准单糖 ,同样处理后进行气相色谱分析.
检出物有大量半乳糖 ,少量甘油 、赤藓醇 、甘露糖 、葡萄糖和木糖 ,可得 PP1存在的连接方式
1※3 、1※4 、1※2比例约为 92.30:7.35:0.35 ,其主链为 1※3连接 ,还有少量 1※4连接 ,支
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链为 1※2连接.PP1主要由 β-(1※3)-D-半乳糖与α-(1※4)-3 , 6-内醚-L-半乳糖连接的琼二
糖重复单位组成[ 4] ,结合单糖组成分析 ,PP1由半乳糖 、3 , 6-内醚-L-半乳糖 、甘露糖 、葡萄
糖 、木糖和阿拉伯糖组成(图 4 , 图 5;表 3 , 表 4).
图 4　中性多糖 PP2 Smith降解后气相色谱分析
Fig.4　GC analysis of neutral polysaccharide PP2 after Smith-degradation
图 5　标准单糖气相色谱分析(SUGAR9 方法)
Fig.5　GC analysis of standard monosaccharides by SUGAR9.M
表 3　中性多糖 PP2 Smith降解后气相色谱分析
Table 3　GC analysis of neutral polysaccharide PP2 after Smith-degradation
单糖组成 甘油 赤藓醇 木糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖
出峰时间/min 4.567 8.616 11.094 19.606 19.931 20.596
峰面积 0.708 79 7.346 08 2.858 81 1.274 75 1.982 56 85.829 00
糖苷键连接方式 1※2 1※4 1※3 1※3 1※3 1※3
糖苷键比例 0.354 40＊ 7.346 08 92.299 52＊
表 4　标准单糖气相色谱分析(SUGAR9 方法)
Table 4　GC analysis of standard monosaccharides by SUGAR9.M
单糖组成 甘油 赤藓醇 鼠李糖 岩藻糖 阿拉伯糖 木糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖
出峰时间/ min 4.586 8.650 10.864 11.018 11.494 11.985 19.645 19.981 20.608
2.7　分子量的测定　G200装柱(1.6 cm ×50 cm),柱高 41.5 cm ,蒸馏水平衡 ,流速 0.12
mL/min ,将分子量为 11 500 、41 000 、71 000的标准多糖分别上样 ,上样量 2 mg ,体积 0.5
mL ,蒸馏水洗脱 ,每管 1.2 mL 分部收集 ,苯酚(硫酸显色 ,合并流出液体积 ,求得洗脱体积
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(Ve).再用平均分子量为 200万的蓝色葡聚糖上样 ,得外水体积(Vo),以 Ve 为横坐标 ,分
子量对数(lgM)为纵坐标 ,绘制标准曲线.PP2按上述条件上柱得洗脱体积(Ve),再根据 Ve
值查标准曲线 ,得 PP2分子量为 16.2万(图 6).
图 6　中性多糖 PP2 分子量标准曲线
Fig.6　MVV curve of neutral
polysaccharide PP2
3　结　论
中性坛紫菜多糖 PP2 由半乳糖 、
3 ,6-内醚-L-半乳糖 、甘露糖 、葡萄糖 、
木糖和阿拉伯糖组成 ,有α, β两种糖
苷键 ,存在的糖苷键连接方式有 1※
3 、1※4 、1※2 ,其主链为 1※3连接 ,还
有少量 1※4连接 ,支链为 1※2连接 ,
但主链和分支情况要通过甲基化分析
进一步确证.
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　参 考 文　献
[ 1] 　周慧萍 , 陈琼华.紫菜多糖的抗凝血和降血脂作用.中国药科大学学报 , 1990 , 21(6):358～ 360.
[ 2] 　周慧萍 , 陈琼华.紫菜多糖对核酸 , 蛋白质生物合成和免疫功能的影响.中国药科大学学报 , 1989 ,
20(2):86 ～ 88.
[ 3] 　周慧萍 , 陈琼华.紫菜多糖对机体细胞的保护作用.中国药科大学学报 , 1989 , 20(6):340～ 343.[ 4] 　纪明候.海藻化学.北京:科学出版社.1997.
[ 5] 　Dubois M , Gilles K A , Hamilton J K , et al.Co lorimetric me thod for the determination of sugars and re-
lated substances.Anal Chem , 1956 , 28:350～ 356.
[ 6] 　范　晓 , 严小军 , 韩丽君.海藻化学分析方法.北京:学苑出版社.1996.[ 7] 　Yaphe W , Arsenault G P.Improved resorcino l reagent fo r the determination of fructose and 3 , 6-anhydro-
galactose in polysaccharides.Anal Biochem , 1965 , 3:143 ～ 148.[ 8] 　张惟杰.糖复合物生化研究技术.杭州:浙江大学出版社.1994.124～ 125.
Isolation , Purif ication and Structural Analysis of
Polysaccharides from Porphyra haitanensis (Ⅱ)
Lǜ Y an 1 , Chen Hao1 , Wang Shuijuan1 , Fei Xiugeng2 , Zhang Weiyun1(1.Department of ment Bio logy , Nanjing University , Nanjing , 210093 , China;
2.Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Qingdao , 266073 , China)
Abstract:　Polysaccharides of Porphyra haitanensis from Guangdong P rovince were ex tracted in boiling water ,
removed from proteins by methods of Sevag.The content of crude porphyrans was 8% the wet w eight of P.hai-
tanensis.The porphy rans were added CTAB in to remove the acid poly saccharide PP1 and the left neutral
polysaccharide PP2 was purified by superfilter.PP2 was further purified through DEAE -Cellulose 52 and
Sephadex G200 and was proved to be pure through PC , gel filtra tion and UV spectrum.The composition of PP2
w as analyzed by IR spectrum and GC.The contents of total sugar , 3 , 6-anhydrogalactose and SO42- were mea-
sured by chemical methods to be 86.33%, 5.425% and 12.2% separately.Finally , the chemical structure of
PP2 w as identified by periodate oxidation and Smith(deg radation.It show s that PP2 is composed of galactose, 3 ,
6-anhydrogalactose , mannose , glucose , xylo se and arabinose , and that it hasαand β glucosidic bands through 1※
3 , 1※4 , 1※2 linkages.The molecular w eight of PP2 w as estimated through gel filtra tion to be 1.62×105.
Key words:　isolation , purification , structrual analy sis , polysaccharide , Porphyran haitanensis
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