全 文 ：第 1 4 卷 第 1 期
1 9 9 5 年 3 月
台 湾 海 峡
JOURNAL OF 戊EAN侃RAPYH NI TAIWAN ST RAIT
V o 卜 1 4 , N o . l
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1 9 9 5
极谱法在镐诱导单胞藻和禾草类植物
赘合物研究的应用 ,
周莲贞
(国家海洋局第三海洋研究所 , 厦门 , 3 6 1 0 0 5)
尼贝 日
(斯德哥尔摩大学系统生态学系自然资源管理研究所 ,瑞典 )
摘 要 三 角揭指 藻 (尸 h ae o d a c yt lu m t ir co nr ut u m ) 和 剪股颖草 属禾 草 ( A -
g or ist
: ca iP “ ar 行 ) 经过处 理后再用液相层析法从中提取一 种金属结合多肤 , 极谱分析
表呵不 同的锅结合多肤具有不 同的稳定性 , 金属结合物与金属硫蛋 白不同 , 在电位一
1
.
7 V 附近未 出现氧催化峰 , 金属硫蛋 白以及从单胞藻和 禾草中提取的多肤在机谱浏
定过程中都在电位一 5 2 Om V 和 一 9 30 m V 附近 出现双峰 , 在一 5 20 m V 处 ,半波电位显
示 了单个镐硫醉健的 还原 , 在一 9 3 Om V 处的峰是 由 于镐 和硫 多齿赞合 的还原 , 因此
这通常可 用以鉴定锡釜合物 。 在偏浓度为 5拌m o l / dm ’ 和 20拜m o l / d m , 时一 9 3 o m V 的
峰高与锡浓度之间存在着对应关系 。
关键词 机谱分析 肤 蛋 白质 植物势合物
1 前言
植物鳌合物首先由 M u r a s gu i 等 〔`〕提出 。 植物鳌合物是植物 、 藻类或菌类等暴露于各种不
同金属环境中时在其细胞质中通过酶合成产生的一种金属鳌合多酞 。 多酞「(r 一谷氨酸半氨酞
基 )甘氨酸 n 一 2一 1 1」图是一重复结构 ,包含了两种氨基酸 , 即半肤氨酸和谷氨酸 ,其末端是甘
氨酸或丙氨酸 。 半胧氨酞的琉基能结合 C u ,十 、 Z n , + 、 P b ’ 十 、 C d ’ 十和 H g , + 等金属离子 。 据报道 , 一
些金属或非金属 ,如 dC ’ 十 、 p b , + 、 Z n , 十 、 S b , + 、 A g + 、 N i , 十 、 H g ’ + 、 A s o :一 、 e u ’ 斗 、 s n , + 、 s e o 二一 、 A u 十
和 iB , + 等离子 , 能诱导植物鳌合物的合成 sj[ , 其中 ,福是迄今 已 知的一种最强的植物鳌合物诱
导剂 [ 4〕 。
1
.
1 植物赘合物的作用
植物鳌合物的基本作用是对付铜 、 锌和福等各种金属的影响 ,其中虽然铜和锌是植物的必
需元素 ,但一旦过量则对生物体造成危害 ; 而福并不是生物体的必需元素 。 在自然界中 ,植物鳌
合物的诱导构成了一种生态型特征 , 使植物能在富含金属的土壤中生长 (可能还存在别的能提
高生物对金属耐受性的机制 ) 。 据报道 ,生长在被金属污染的土壤中的植物的根对金属的积累
随组织里产生的植物鳌合物量的增长而增长 。 K en e : 等〔 5〕的实验清楚地说明植物鳌合物的生
七作用是为了保护植物细胞质中的细胞内酶 。 虽然多肤结合有毒金属是为了保护细胞 ,但植物
本文 }门 9 9 4 年 1 2 月 3 [ 1收到 。
台 湾 海 映 14 卷
鳌合物在形成过程中往往迅速 消耗细胞中的谷胧甘肤 [] 6。 i R。 deV o s 等人 〔’ 」用铜处理石竹科
麦瓶草属的植物 l S’ ln eo u cu cbl a“ :时发现 ,在植物鳌合物的形成过程中 ,所 消耗的谷胧甘肤与
根中硫代巴 比妥酸反应的物质的形成有关 , 显示了脂类的氧化降解作用 。 因此 , 植物鳌合物的
产生可能提高 了植物细胞对氧化压力的敏感性 ,从而使细胞无法补偿谷胧甘肤的迅速消耗 。
金属硫蛋白是一种在复制水平上的调节蛋 白质 ,是在各种应激因子 , 如暴露于重金属 , 热
休克 , 毒物及氧化压力下诱导产生的 。 与由细胞质酶产生的植物鳌合物相反 ,这种蛋白质是原
始基因产物 , 其典型分子量小于 10 0 0 。 在金属硫蛋白中 ,半肤氨酸是占主导的氨基酸 ,占总量
的 1 / 3 。 金属硫蛋白结合重金属的容量是每分子 4 ~ 12 个原子 , 具体容量取决于生物和金属的
种类 。 H a m e r sj[ 在其综述中指出 ,在动物 ,真菌类和藻类中存在有金属硫蛋白以及金属硫蛋白
类似物 。 植物的金属硫蛋白类似物发现于剪股颖属 禾草 A g or slt : 图以及福处理过的蕃茄植株
中 。 G ilr l〔’ 。〕认为 , 尽管分子量相似 , 植物 中所发现的金属硫蛋 白类似物与动物金属硫蛋白的类
似物一样 , 都不是金属结合蛋白质 ,它们是植物鳌合物的分子聚集体 , 因此在分离过程中若离
子强度较高则易于解聚 。
1
.
2 具有金属结合能力的植物的实际应用
工业生产和车辆废气的排放造成环境的金属污染 , 迫使人们需要找到 一种移除或回收金
属的方法 。可以预计 ,可利用的土地资源将 日益减少 ,人们也要寻求办法 ,改造受金属污染的土
地 ,恢复其合适用途 。 同时 , 矿产磷酸盐通常伴生福 ,而随着磷酸盐矿源的减少 ,在寻找到高效
低耗的移除福的方法以前 , 农业将不得不使用含高浓度锅的磷酸盐矿肥料 。 此外 , 土壤微生物
区系的组成与植物对害虫的抗性密切相关 , 因此可以推测有毒金属可能对土壤微生物区系产
生不利的影响 。
因此 ,利用植物最大限度地积累锅或其他重金属 ,即通过植物鳌合物或其他金属鳌合物质
的合成 , 将能从土壤中清除有毒金属 。 为此必须找到合适的植物 ,或者通过改造基因等方法提
高植物的金属耐受性和金属吸收率 , 以及吸收的金属在植物体内的分布等方面的功能 ,使之适
用于移除金属 。 这就需要为植物中可结合金属的植物整合物建立鉴别和定量的方法 。 另外 , 还
必须建立各种实用的方法 , 以收获植物 、 移除并储存收获物中的金属 。
1
.
3 分析方法
植物鳌合物通常采用液相层析法 , 主要是凝胶过滤和阴离子交换等步骤提纯 。 随后采用反
相 H P L C 技术 , 区分不同分子量的植物鳌合物 〔’ 01 。 植物种类不同 , 其液相色谱特征也不同 。 某
些 低分 子量化 合物 可 以用 汞 电极 被琉基 去极 的 电化 学法测定 。 这 种方法先在 悬汞电极
( H M D E ) 上沉积待测物 ,然后用阴极剥离法进行微量测 定 ,该方法可用于含硫化合物 ,黄素 、
叶琳等的微量测定 〔 ’ ` 〕 , 同样也可根据它们的硫和硒的形态用于区分半肤氨酸和胧氨酸 〔` , 〕。 但
是 ,这种方法用于分析复杂的生源样品时 , 由于干扰以及基质在滴汞上的吸附而受到一定的限
制 。 滴汞 电极 由于其每一滴汞滴的表面都得以更新 ,因此受到的干扰较小 , 滴汞电极 曾用于肝
细胞线粒体的琉基化合物的测定〔” 」; 与福结合的鳌金属硫蛋 白的研究毛“ 〕 ; 铜和从食物萃取的
含硫蛋白质在滴汞电极上的相互作用仁’ 5 〕 ;还 用于稳定常数的测定巨’ 6 〕 ; 以及福和锌与含硫化合
物的络合作用 〔” ] 。 含有半肤氨酸的蛋 白质 (如金属硫蛋 白 )曾用静态滴汞 电极 (S D M E )在含钻
的氨溶液中进行电化学测定 [ ’ ` ] 。 这一方法曾被 O l a f s s o n & O l s s o n [” ]和 玫 b i a n n 。 & L a n g s t o n
( 1 98 9) 等应用于不同动物组织诱导金属硫蛋 白的研究 。
1 期 周莲贞 、 尼 贝日 :极谱法在福诱导单胞藻和禾草类植物鳌合物研究的应用
2 材料与方法
藻 类的植物 鳌合物是从 已知 可产生植物 鳌合物 的三角褐 指藻中得 到的 ( M ai ta 等人 ,
1 98 8 )
。 三角褐指藻培养于 2 ~ d3 m , 的三角瓶中 ,在室温 7℃ , 每天光照 1 h6 的环境中生长了
d8
, 然后在藻类进入老化期前 以 1 m g d/ m , 的福处理 , 用过滤的方法收集浮藻 , 经洗涤后迅速
放入液氮 中 , 细胞用研钵匀化 , 加入去氧的蒸馏水 , 然后以 2 7 0 0 0 9 的速度离心 0 . h5 , 一半的上
清液注入柱子进行凝胶层析 (葡聚糖凝胶 G 50 , P ha r m a ix a ) , 用分光法测定收集的每一部分在
波长 2 5 4 n m 和 2 8 0 n m 处的吸收 , 经酸消化后用极谱法测定锡的浓度 , 为了进一步提纯 , 含锅
的主要部分被集 中并注入阴离子交换层析柱中 ( s e p h a d e x A 25 , P h a r m ac i a ) , 用含 0 . 7m ol /
d m
“ 氯化钠的 T ir s 一 lC 缓冲液 , p H 一 8 洗提 ,缓冲液经过加氮去氧 。
剪股颖草培养于铺以透水性物质 (蛙石 )的塑料网上 , 网径 1 2 . sc m , 置于塑料容器上 , 塑料
容器中含有植物生长营养液 ( g O c0 m ’ 和 H oe gl a n d 营养液 ) 。 禾草根部用 1 m m ol d/ m , 的冰氯
化钙清洗 , 以去除沾附在表面的福 ,根和叶都经过冰蒸馏水的清洗 , 而后浸入液氮中 。试样经冻
干 、 研磨后 , 一部分样品经酸消化 ,用于分析福的含量 ;大部分样品用作肤的分析 , 细胞在低温 、
去氧 、 p H 一 8 的磷酸钾缓冲液中用超声波破碎并匀化 , 去除纤维物质后萃取 ,并 以与藻类处理
相同的方法处理 。经离子交换层析后的含福样品用渗析法或凝胶过滤法脱盐 , 再冻干浓缩后在
带 64 7 电极架的 M et or h m 6 46 型极谱仪上用脉冲示差极谱法 (采用 S D M E )进行测定 。 所设定
的脉冲强度 : 10 o m V , 滴汞时间 : 1 5 , 扫描速度 : 10 m V / s 。 从马 肾中提取的含锌 18 x 1 -0 ’
( m / m )
,含福 52 X l o “ ’ ( m / m )的金属硫蛋白是从 S i g m a 公司购买的 ,使用时未经进一步提纯 。
3 结果
得到福处理过的藻类和剪股颖草根的提纯物后 , 进行极谱分析 。极谱图中出现三个明显的
谱峰 (如图 1 的 a , b 和 C 所示 ) ;中间的谱峰 (峰 I )的半波电位是福还原的特征 。 这已被用加锡
到肤中的方法所证实 。
在图 l b 和 C 中 ,剪股颖草根的提纯物的图形与图 la 中藻类提纯物的图形 ,即峰的分布相
同 ,峰高 ,即金属结合物的量 , 取决于草根曝污的福浓度 。 图 b1 中 ,锅浓度是 5拜m ol d/ m 3 ,而图
z e 则是 10拼m o l / dm 3 , 同样处理 7d , 但 1 0拌m o l / d m , 锅处理过的峰 l 的高度大约是 5拌m o l / dm ,
锅处理过的 4 倍 。
金属硫蛋白由于各种原因而显示了不同的图谱 。 大约在一 1 . 7 V 出现一个大峰 (图 2 的峰
V )
。 三个较小的峰出现在谱图的一 5 20 m V 、 一 9 20 m V 和一 1 . 3V 分别为峰 I 、 皿和 W 。
4 讨论
从锡处理过的藻类和禾草根组织中提取的多肤经过凝胶过掳和阴离子交换层析后在脉冲
极谱中至少产生了三个明显的峰 。 未经层析分离的粗提取物也显示了类似的结果 ,这表明采用
本方法可免除烦冗的提纯步骤 。 关于对照物 , 因层析后得不到所需的物质 , 所以直接用粗提取
物进行极谱分析 , 其极谱图上无峰 出现 。 图 la 、 b 和 c 的峰 ! 来源于福在汞滴上的还原 ,如果它
表示的是非结合的游离金属的半波 电位及 w a g en 卜 R o 。 等人 ( 1 9 8 9) 从类似的实验得到的结
果 , 那么福将在分离的过程中被结合 ,否则在提纯过程中由于未被结合而被分离掉 (凝胶过滤
阴离子交换层析和渗析 ) 。 整合物经水解 ,其峰 l 和 l 消失 ,但表征福的峰 1 仍存在 。 因此得出
结论 , 峰 I 和峰 I 必定源自多肤或福与多肤的相互作用 。
台 湾 海 峡 14卷
为了解释 出现的两个峰以及锅峰 ,我们假定福与多肤存在着两种稳定性不同的结合 ,它们
具有不同的还原电势 。 稳定的结合显示于峰电位一 93 Om V ( l )处 , 此时福同时与几个半胧氨
酸形成鳌合物 ;弱结合显示一 5 20 m V ( l )处 ,此时锅与单个或少数半肤氨酞基结合 。 当把该物
质加到电解质中时 ,福从弱结合处分解出来 ,而产生福峰 。 因此必须证实在提取物中存在着琉
基 。 且两个峰都与福 一硫络合物还原有关 。 后者可用 E D T A 滴定去除多肤中的镐 ,且持续向多
、肤加入福来证实 (图 3 和图 4 ) 。 提取物中的琉基含量用 D T N B ( lE lm a n S 试剂 )与脱辅基肤反应
来测 定 , 以半肤氨酸作 为标准 , 被 5“ m ol d/ m , 福 处理过的剪股颖草根的半胧氨酸的含量是
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图 1 经层析的提取物的极谱图
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福 处理 ( 5 . 9产 m o l /d m 3 , l od )过的褐指藻 ( a ) ; 剪股颖草以 5拜n 、0 1/ d m 3 福 处理 ( b ) ;
和 1 0四。 I/ d m , 福处理 c( ) : 图 b 和 。 分析的提纯物等量
强的金属鳌合剂 E D T A l( 0 9日,一 16 . 7) 被用以去除多肤中的福 。 代表未结合锡的峰 I 的峰
电流以最快的速度减小 , 接着的峰 I 表示锡与多肤弱结合 。 峰 且在突然降低之前呈滞后的趋
势 。 如图所示 , 第二个滞后状态的出现也许说明了两种福原子结合的稳定性不同 。 福也被加入
到多肤中以检查所有的福结合处是否饱和 。 在持续的滴加过程中峰 I 和 E随着添加量的增加
而增高 ,而峰 正却不受影响 (图 4 ) 。 这些清楚地表明福在与多肤的弱结合处平衡相当快 。 峰 .
不受福的影响 。 很明显 , 在强鳌合物中 ,福结合物中 ,福结合点 已饱和 ,无法或仅以极低的速率
结合 。
图 2 金属硫蛋 白的极谱图有 4 个明显的峰 : 一 1 . 7V 处突出的峰归结于硫化物产生的氢催
1 期 周莲贞 、 尼贝 日: 极谱法在福诱导单胞藻和禾草类植物鳌合物研究的应用
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化波 0z[ 〕。 虽然所含的硫醇量可用试剂来测
定 ,但 一 1 . 7 v 附近的峰不在植物赘合物的
极 谱 图 出 现 ; 三 个 较 小 的峰 出 现 在 一
5 2 o m V
、 一 9 3 o m V 和一 1 . 3V 处 。 藻类和剪
股颖草的提纯 物在一 52 0 m V 和 一 9 30 m V
处显示 了近乎相同的半 电位 (峰 I 和 班 ) ,
也许 由于这是 同一电极过程 ,而在一 1 . 3V
处的峰是 由于与蛋 白质结合的锌的还原 。 7
个与金属硫蛋 白结合的镐中有 1个与蛋 白
质的结合 比其他 6 个弱 〔“ 〕 ,弱结合的福原
子也 许 具有 较低 的还 原 电位 , 从而 在 一
5 2 Om V 附近产生了谱峰 ,此峰在添加 E D -
T A 后消失 。
总而言之 , 本研究表明极谱可成功地
应用于鉴定并相对地定量金属赘合物 。 从
藻类和剪股颖草 中经过层析提取的物质因
不在 一 1 . 7V 处出现氢催化峰而清楚地与
金属硫蛋 白分开来 , 游离福与结合福相对
图 2 在氨缓冲液中金属硫蛋白的极谱图
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谱 图被分为纵座标不同的两部 ,峰的标 号与揭 指藻
和翁股颖草极谱 图的峰相 对应
比率藻类大于剪股颖草 , 而福硫蛋 白的分析 中没有检测到游离福 。 峰 I 和 l 特别有意义 ,它们
同时 出现在蛋白质与藻类和剪股颖草的提纯物的极谱图中 , 剪股颖草的植物 金属鳌合物的量
取决于所给福的浓度 。 峰 . 由锅络合物的还原产生 ,且不受游离福浓度的影响 , 因此此峰峰高
代表诱导的福赘合物的量 。 本实验室正在研究福与各种生源鳌合物质的稳定常数的测定 。
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图 3 E D T A 滴定福植物鳌合物 图 4 向藻类的植物鳌合物持续添加福 (dC 1C 2 )
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峰 l 、 I 和 I 的峰 电流 ( n A )在每次持续
滴定的 2 50 5 后记录
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· 台 薄 海 峡 1 4 卷
本项研 究得到瑞典计划与协作研究委 员会的 支特 , 合同号为 9 2 0 7 1 6 A 8一 5/ 2 1 83 。 作者感谢
O l l e W a h l b e r y 等人对 本研究的支特 。
参考文献
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T w o p e a k s a t a p p r o x i a m e t e l y 一 5 2 0 m V a n d 一 9 3 0 m V , a p p e a r e d i n t h e p o l a r o g r a m o f t h e
m e t a l lo t h i o n e i n p r o t e i n a n d t h e p o l y p e p t e id e p r e p a r e d f r o m a l g a e a n d p l a n t
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A t 一 5 2 0 m V , t h e
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w a v e p o t e n t i a l i n d i e a t e s r e d
u e t i o n o f s i n g l e e a d m i u m
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,
a n d e o u l d t h u s b e u s e d f o r id e n t i f ie a t i o n o f e a dm i u m e h e l a t i n g e o m p o u n d s i n g e n e r a l
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A d o s e
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r e s p o n s e r
e l a t io n s h i p b e t w e e n p e a k h e i g h t a t 一 9 3 o m V a n d e a d m i u m e o n e e n t r a t i o n a t s 拜
m o l / d m
` a n d 1 0 “ m o l / d m 3 e x p o s u r e w a s o b s e r v e d i n r o o t s o f A g osr t i
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K E Y WO R D S P o l a r o g
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