全 文 ： 坛紫菜多酚抗氧化及抑制UVB致HSF细胞
氧化损伤作用
李锋*，李清仙，程志远，郭养浩
(福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350116)1 
摘要：从坛紫菜中提取分离制备了多酚组分；通过 DPPH自由基清除、抑制 β-胡萝卜素褪色和铁还原
抗氧化能力分析法评价坛紫菜多酚的体外抗氧化作用；以 UVB致人表皮成纤维细胞损伤模型评价坛紫菜多
酚抑制紫外损伤表皮作用，考察其用于防护紫外损伤领域的可行性。体外实验结果显示，坛紫菜多酚具有
较强的抗氧化作用，其 DPPH·清除能力与同等浓度的 BHT 相当；但亚油酸体系抑制 β-胡萝卜素褪色能力
和铁还原抗氧化能力弱于同等浓度的 BHT。细胞实验结果显示，坛紫菜多酚能有效降低 UVB辐照所致 HSF
细胞的 LDH漏出量，维护细胞膜的完整性；降低受损细胞的 ROS水平，增加 SOD、GPX酶活，从而降低
细胞的氧化应激状态，提升内皮细胞的抵抗氧化应激的能力；显著抑制 HSF细胞凋亡水平。坛紫菜多酚能
在细胞水平有效保护 HSF细胞免受 UVB的氧化损伤，表明紫菜多酚具有用于紫外损伤防护领域的潜力。
关键词：紫菜多酚；抗氧化；UVB；氧化应激
The Inhibiting Effects of Porphyrahaitanensis Polyphenols on Oxidation and HSF Cells Oxidative
Damage Induced by UVB
LI Feng*，LI Qingxian，CHENG Zhiyuan，GUO Yanghao
(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China）
Abstract: In this work,Porphyrahaitanensispolyphenol(PP) was extracted and separated, and it′s antioxidant
in vitroand protecting human skin fibroblasts(HSF) against oxidative damage induced by UVB were investigated
too.The antioxidant effectwas evaluated by measuring the DPPH· clearance rate, the inhibitive rate of -carotene
fading and the FRAP value; and the UVB-induced HSF damaging cellular model was employed to evaluate the
protective effect of PP on ultraviolet oxidation damage.The polyphenol component, PP, was separated from
Porphyrahaitanensis′s alcohol extracts by silica gel column chromatography.PP hasa strong DPPH· radical
scavenging ability which is equivalent to the same concentration of BHT′s or stronger; with the aspects of
inhibiting -carotene fading and FRAP value, the antioxidant activity of PP is weaker than that of BHT. The
cellular experiment showed that PPsignificantly reduced the LDH leakage of HSF cells induced by UVB
irradiation; reduced the ROS level of damaging cells; enhanced the antioxidative enzyme activities of SOD、GPX;
reduced the relativeapoptosisratio of damaging cells induced by UVB irradiation. The results showed that PP can
elevatescellular antioxidant capacity, maintains the integrity of cellular structure, and ultimately protects the HSF
cells against oxidative damage induced by UVB.
Keywords:Porphyrahaitanensis polyphenol；antioxidant；UVB；oxidative stress
中图分类号：TS201.4文献标志码：A
坛紫菜系暖温性海洋红藻，是我国特有的传统海水养殖大宗品种，主要分布于福建、浙江两省。
现代研究发现，坛紫菜中富含多种海洋生物活性物质：海藻多酚[1]、红藻糖苷[2]、藻红（蓝）蛋白[3]
以及海藻多糖等。多酚是一大类结构不同、含有多个酚羟基化合物的总称，广泛存在于植物中。随着
现代分析和分离技术应用于海藻资源的开发以及对海藻的次级代谢产物研究的逐步深入，海藻多酚日
益引起人们的关注。近年来研究表明，海藻多酚主要具有以下几方面的生物活性：抗氧化活性[4, 5]，
可有效降低实验动物血清和肝脏中丙二醛含量，提高超氧化物岐化酶等抗氧化酶活性，在体外具有较

收稿日期：
基金项目：国家海洋公益性行业科研专项(201205022)；福建省教育厅科技项目（JA13045）
作者简介：李锋(1976—)，男，助理研究员，主要从事天然成分生物活性研究。E-mail：lifeng9676@aliyun.com
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网络出版时间：2016-11-16 16:25:26
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20161116.1625.080.html

强的抑制自由基活性；抗肿瘤活性[5-7]，海藻多酚对多种肿瘤细胞株具有较强的抑制作用；调血脂降
血糖活性[8, 9]，可有效降低模型动物的空腹甘油三酯、胆固醇等血脂水平，有效降低糖尿病小鼠的空
腹血糖值，提高实验动物的葡萄糖耐受能力和对胰岛素的敏感性。目前对于海藻多酚的研究主要集中
在褐藻多酚方面，而对于红藻多酚的研究相对较少。
随着社会发展，人们有更多的时间从事户外文体娱乐活动，这使得人体皮肤直接暴露于太阳紫外
照射的时间大大增加。每年仅美国的新增非黑素瘤皮肤癌（non melanoma skin cancer，NMSCs）临床
病例就超过 100万，其发病率位居北美各类癌症之首[10]。我国虽无详细的流行病学及临床统计资料，
但紫外辐照所致皮肤损伤正日益引起重视。紫外线是波长范围介于 200~400nm 的电磁波[11]，可分为
三个波段：320~400nm 的长波段 UVA，290~320nm 的中波段 UVB，200~290nm 的短波段 UVC[12]。
受臭氧层的吸收作用，太阳光中的 UVC不能穿透大气层到达地面，在自然环境中几乎不存在。UVB
辐照是产生表皮损伤形成一系列皮肤疾病最普遍的环境致病因子，UVB 能通过与表皮细胞中一系列
组分发生反应而产生 ROS。生成的 ROS主要为 O2-、OH，易与脂质、蛋白质和糖类等生物大分子发
生过氧化反应，生成更有危害的过氧化物，破坏表皮细胞中酶性及非酶性抗氧化防御系统，使得皮肤
受损，造成皮肤红斑、光化角质（actinic keratoses，AKs）和 NMSCs等病理状态[13]。
为了减少在户外时 UVB 对皮肤的损伤，人们常采用遮光剂（sunscreen）和防晒乳来保护皮肤，
这两种主要是通过吸收和反射紫外线的方式来保护皮肤，但考虑到紫外皮肤病的高发病率，其所起的
作用十分有限，故临床亟需更为有效的基于新机制的皮肤保护制剂。目前，一些天然来源的小分子化
合物表现出较好的抑制 UVB 致皮肤损伤的潜力[14-16]，引起了学界的极大关注，从天然植物化合物中
开发皮肤光保护剂已成为已成为该领域新的趋势，这方面的研究方兴未艾；也有较多的研究表明天然
的多酚类物质能有效的抑制紫外线对于皮肤细胞的氧化损伤[17-19]，但主要是集中于茶多酚等陆生植物
的多酚类物质，目前尚未见将海藻多酚用于抑制 UVB 致皮肤细胞损伤方面的研究报道。本工作以新
鲜坛紫菜为原料，提取分离其中多酚组分，通过 DPPH清除实验、抑制 β-胡萝卜素褪色和铁还原抗氧
化能力分析法考察其体外抗氧化作用；以 UVB 致人表皮成纤维细胞损伤模型考察坛紫菜多酚抑制紫
外损伤表皮作用，探索红藻多酚天然成分用于紫外防护的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜坛紫菜采自福建省平潭岛；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基
苯酚）、β-胡萝卜素、TPTZ（三吡啶三吖嗪）、Folin-Ciocaltea试剂购自 aladin试剂公司；人皮肤成纤
维细胞（HSF）细胞株，购自鼎国生物技术有限公司；细胞培养相关试剂（血清、培养基、抗生素及
胰酶等），HyClone公司；2,7-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA），sigma试剂公司；Annexin V/PI双
染试剂盒购自上海贝博生物技术公司；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物岐化酶（SOD）和谷胱甘肽过
氧化物酶（GPX）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。
1.2 实验仪器与设备
美国 Beckman COULTER EPICS XL型流式细胞仪；UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津公
司；SHB-III循环水式真空泵，郑州长城科工贸公司；YRE-202A真空旋转蒸发器，日本 EYELA公司；
二氧化碳培养箱，美国 Thermo 公司；倒置显微镜，重庆光电仪器公司；KN-4006B 紫外光疗仪，科
诺医学设备有限公司。
1.3实验方法
1.3.1 紫菜多酚的提取及分离
在Wang等人[20]方法的基础上，加以修改，简述如下：新鲜坛紫菜，冷冻干燥，粉碎；用乙醇按
料液比 1:20于 35℃摇床 200r/min提取三次，每次 2h，过滤收集提取液；合并滤液，减压浓缩去除乙
醇；浓缩液用等体积石油醚剧烈震荡萃取以除去油脂，分液漏斗静置分层，收集上层水相，重复萃取
操作 2次；浓缩萃取分离后的水相。由于水相层提取物中含有较多的糖分，采用硅胶柱层析以去除糖
分。硅胶柱高径比 25:1湿法装柱，上样之后，采用乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，洗脱流速 0.5Bv/h，
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2

部分收集器收集过柱液。每只试管取样于微孔板中，减压干燥去除有机溶剂，每孔加入同体积水，以
消除有机溶剂对后续分析的干扰；硫酸苯酚法测定糖分含量，采用 Folin-Ciocaltea试剂分析多酚含量；
绘制洗脱曲线，收集多酚洗脱峰；收集液减压浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥即得紫菜多酚
(Porphyrahaitanensis polyphenol，PP）样品，-20℃保存备用。
1.3.2 紫菜多酚体外抗氧化 DPPH·自由基清除实验
采用 Souza 等[21]的方法，略有改动，简述如下：2mL DPPH·甲醇或水溶液（1mmol/L）与 5mL
提取物溶液混合，振荡摇匀，室温避光放置 30min。用 2mL蒸馏水代替样品作为阴性对照，相同方法
处理;以 BHT为阳性对照作参考。于 517nm波长测定吸光值。结果用相对于阴性对照的 DPPH·清除率
（%）来表示，计算公式如下：
0
0
( )% = 100%i jA A A
A
  清除率（ ）

式中Α0表示样品与溶剂混合液的吸光度；Αi表示DPPH·与样品反应后的吸光度；Αj表示DPPH·与
溶剂混合后的吸光度。实验重复三次求平均值。
1.3.3β-胡萝卜素-亚油酸体系抗氧化分析
采用 Shon 等[22]的方法，略做修改简述如下：将 1mg β-胡萝卜素溶解于 5mL 氯仿中，随后加入
100μL亚油酸和 1mL Tween 80，混合物室温振荡混合 10 min。随后，40℃减压旋蒸去除氯仿，再加入
100mL氧饱和蒸馏水，剧烈摇晃 1 min，形成乳化物（β-胡萝卜素-亚油酸乳化物）。96孔微孔板，每
孔加入 50μL样品溶液和 200μL的以上乳化液，摇床 80r/min混匀 1 min，50℃孵育反应。在酶标仪上
于470nm波长处测定初始反应的吸光值以及反应120 min后的吸光值分别记为Α0和Α120，ΔA=Α0-Α120，
ΔA越大表明 β-胡萝卜素氧化程度越高，褪色越多。计算样品对体系 β-胡萝卜素褪色的抑制率，公式
如下：
0
0
% = 100%iA A
A
   褪色抑制率（ ）
式中 ΔA0表示不加样品抑制时的褪色情况，ΔAi表示加了某种样品产生抑制作用时的褪色情况。
1.3.4 铁还原抗氧化能力分析（FRAP）
FRAP抗氧化分析采用 Benzie和 Strain的方法[23]，简述如下：首先配制 FRAP工作液，取 2.5mL
10mmol/L的三吡啶三吖嗪（TPTZ，用 40mmol/L HCl配制）、2.5mL 20mmol/L的 FeCl3和 25mL 0.3mol/L
的醋酸缓冲液（pH3.6）混合均匀，即得 FRAP工作液。
测定方法：取 0.3mL不同浓度的样品，加入 2.7mL预热至 37℃的 FRAP工作液，摇匀后放置 10min，
于 593nm 处测定吸光值，用空白溶剂作参比对照测定。根据反应后的吸光值，从 FeSO4标准曲线上
求得对应 FeSO4浓度值（μmol/L），根据受试样品所配制的浓度，换算成对应的当量“μmol(FeSO4)/g(样
品)”值，简写为“μmol/g”，定义为 FRAP值。此值越大，表明抗氧化能力越强。
绘制 FeSO4标准曲线：准确称量 6.08mg FeSO4溶于适量水中，加入 18mol/L浓硫酸 0.25mL，再
加水定容至 50mL，并放入一小铁钉，作为贮液（浓度 800μmol/L），将此贮液稀释成 25、50、100、
200、400、800μmol/L系列标准液浓度，各取 0.3mL按以上 FRAP方法处理，测定吸光值，绘制标准
曲线。
1.3.5紫菜多酚抑制 UVB致 HSF细胞氧化损伤实验
1.3.5.1细胞培养
人表皮成纤维细胞（HSFs），用 RPMI-1640培养基（含 10%FBS，100 U/mL链霉素，100 U/mL
青霉素），置于 5% CO2、37℃培养箱中培养，每 48 h换液一次。取对数生长期的细胞用 0.25%胰酶消
化，制备细胞悬液，密度调整至 1×105个/mL，每孔 100uL接种于 12孔板，继续培养 24 h，随后转换
无血清培养基培养 4 h。
1.3.5.2 UVB辐照剂量、紫菜多酚安全剂量的确定及实验分组
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辐照前将细胞用 PBS清洗 2次后加入少量 PBS覆盖细胞，分别用 10、25、50、75及 100 mJ/cm2
剂量的 UVB（290-320nm）辐照细胞，辐照后立即加入无血清培养基继续培养 24 h，MTT法分析细
胞活力，以确定合适的辐照损伤剂量。用含不同浓度紫菜多酚的无血清培养基分别处理细胞 24 h，
MTT法分析细胞活力，以确定紫菜多酚对正常细胞不产生抑制作用的安全剂量范围。
抑制 UVB辐照实验细胞辐照前用药物处理 2 h，经固定剂量 UVB辐照后，立即加入含不同浓度
药物的无血清培养基培养 24 h，MTT法检测细胞活性，考察药物的 UVB损伤的抑制作用。将培养孔
分成 3 种组别：ⅰ.空白对照组：不经 UVB辐照，不加紫菜多酚处理；ⅱ.UVB损伤对照组：用所确
定剂量的 UVB 辐照细胞，不加紫菜多酚；ⅲ.药物组：UVB 辐照，不同浓度紫菜多酚无血清培养基
处理。
1.3.5.3MTT法分析细胞活力
培养板吸去培养基，加入含 5mg/mL MTT的无血清无酚红培养基，于 37℃、5%CO2条件继续培
养 4 h，吸取MTT溶液，加入 DMSO溶解所形成的甲簪晶体，570nm测定吸光值。细胞活力（%）=
处理组吸光值/对照组吸光值×100%。
1.3.5.4细胞 ROS水平、LDH漏出及 SOD、GPX酶活性测定
细胞 ROS测定：采用黑壁底透 96孔板培养细胞，药物处理方法同前。弃上清，PBS清洗，每孔
加入 100uL 10umol/L的 DCFH-DA荧光染液，37℃避光染色 30min。PBS清洗 2次，用 SpectraMax i3x
型荧光酶标仪测定荧光强度，其激发光波长为 480nm，发射光波长为 520nm；以最高组荧光强度为
100%，计算其他各种的相对荧光强度（%）。LDH 漏出测定：取细胞培养上清液，按照 LDH 试剂盒
说明书操作，测定 LDH酶活，表示为 U/mL。SOD、GPX酶活性测定：收集 6孔培养板中细胞，冰
浴超声波破碎，收集蛋白，BCA法蛋白浓度，样品采用 SOD和 GPX试剂盒测定酶活。
1.3.5.5 流式细胞术 Annexin V/PI双染分析细胞凋亡情况
将处于对数生长期的细胞接种于 6孔培养板中，接种密度为每孔 5×105个细胞，组别设置及处理
同前，培养 24h。吸除培养基，胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集 106个细胞，PBS洗涤 1次，3000r/min
离心 2 min，弃上清。按照 Annexin V/PI双染试剂盒说明书操作制备染色悬浮细胞，用于 FCM分析。
200目尼龙网过滤，流式细胞仪检测分析，激发波长 488 nm，发射波长 530 nm，FITC标记 Annexin V
的绿色荧光通过 FITC通道（FL1）检测，PI红色荧光通过 PI通道（FL3）检测。
1.4数据处理
采用 Origin 软件单因素方差分析，P<0.05 表明差异有显著性，P<0.01 表明差异极为显著。结果
用 mean±SE表示。
2 结果与分析
2.1 紫菜多酚的提取分离
结果如图 1所示，紫菜多酚粗提物中还有相当的糖类物质，主要为小分子碳水化合物类物质(low
molecularmass carbohydrates, LMMCs)，在海藻体内主要发挥维持渗透压的作用[24]，较易溶于乙酸乙酯
等中等极性溶剂。本实验采用硅胶柱层析来实现 LMMCs 和多酚类物质的分离。采用乙酸乙酯/甲醇
体系进行梯度洗脱，流动相组成由 100%乙酸乙酯逐渐过渡到 100%甲醇，可得如图 1所示洗脱效果，
浒苔多酚与浒苔小分子糖分(小分子量的寡糖、糖苷可溶于有机溶剂，而较大分子量的多糖则不溶于
有机溶剂)可基本分离。单独收集多酚洗脱峰作为纯化的组分 PP(porphyrahaitanensis polyphenols)，减
压浓缩，冻干样品，-20℃保存，用以后续实验。PP样品采用 Folin-Ciocaltea法测定总酚含量为 47.82%。
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4
0 20 40 60 80
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
OD
值
洗脱管数
糖类
酚类
PP

图 1 紫菜多酚硅胶柱层析洗脱图谱
Fig1 Silica gel column chromatography elution ofporphyrahaitanensis polyphenols
2.2 紫菜多酚体外抗氧化 DPPH·自由基清除实验
DPPH自由基清除实验结果如图 2所示。海藻多酚具有较强的 DPPH·清除能力，在 1、2、4、8mg/mL
浓度时清除率都接近 100%，在最低浓度 0.125 mg/mL时清除率也超过 60%。其 DPPH·清除能力与同
等浓度的 BHT相当甚至略优于 BHT。
PP
BHT
0.125 0.25 0.5 1 2 4 80
20
40
60
80
100
DP
PH
清
除
率
·
/%
浓度（mg/mL)
图 2 紫菜多酚对 DPPH·自由基清除率
Fig2 Effects of PP on the percentage of DPPH clearance
2.3 紫菜多酚的铁还原抗氧化能力分析（FRAP）
FRAP实验结果如图 3所示。BHT的铁还原抗氧化活性较强，在 0.25 mg/mL时 FRAP值可达 838.3，
但随着浓度的增加，其 FRAP值增加幅度并不明显，8mg/mL时 FRAP值为 1213.4。而紫菜多酚在同
等浓度条件下，与 BHT的 FRAP值有一定差距，在较低浓度下差距较大，0.25mg/mL时 FRAP值为
70.3，而在较高浓度下差距则不太明显，8 mg/mL时 FRAP值为 1038.8。说明紫菜多酚也具有较强的
铁还原抗氧化能力，但其活性弱于同等浓度的 BHT。
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
200
400
600
800
1000
1200
值
FR
AP
样品浓度/mg.mL-1
PP
BHT

图 3紫菜多酚铁还原抗氧化能力分析
Fig3 Effects of PP on FRAP
2.4 紫菜多酚的 β-胡萝卜素-亚油酸体系抗氧化分析
由于体系中亚油酸氧化产生过氧化氢自由基，使得 β-胡萝卜素漂白褪色，如果体系中同时存在抗
氧化剂，则会对抗过氧化氢自由基，对该漂白褪色产生抑制作用。β-胡萝卜素漂白实验结果如图 4所
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5

示。与 FRAP实验结果相类似，BHT同样具有较强的抑制 β-胡萝卜素褪色能力，其在浓度 1、2、4、
8 mg/mL时抑制率均超过 90%；紫菜多酚在 8 mg/mL时的抑制率为 90.5%，与 BHT差距较小，而在
0.125 mg/mL时的抑制率为 21.4%，与 BHT差距较大，推测 BHT抗氧化的线性范围较小，在较低浓
度范围内下具有较强的抗氧化活性，但其浓度超过 1 mg/mL褪色抑制率提升的幅度不及紫菜多酚。
0 2 4 6 8
20
40
60
80
100
样品浓度/mg.mL-1
褪
色
抑
制
率
/%
PP
BHT

图 4紫菜多酚体对 β-胡萝卜素-亚油酸抗氧化分析
Fig4 Effects of PP on β-carotene-lineate antioxidant assaying
2.5 紫菜多酚对正常 HSF细胞活性的影响
结果如图 5所示，通过MTT法分析各组细胞活性，在 0～100 μg/mL剂量范围，紫菜多酚对实验
细胞株无毒性作用，细胞活性都接近 100%，当浓度增加到 500 μg/mL时，细胞活性还可达到 87.6%，
当浓度达到 1000 μg/mL时细胞活性才明显降低到约 75%。于紫菜多酚相比，BHT的安全无毒剂量范
围较小，0～50 μg/mL剂量范围无明显抑制作用，当浓度为 100μg/mL及以上时，细胞活性降低明显，
小于 80%。因此，后续实验选择的安全无毒性的剂量紫菜多酚为 0～100 μg/mL，BHT为 50 μg/mL。
5ug/mL 20ug/mL 50ug/mL 100ug/mL 500ug/mL 1000ug/mL0
20
40
60
80
100
120
ce
ll v
ial
bili
ty(
%)
浓度
BHT
PP

图 5 紫菜多酚对正常 HSF细胞活性的影响
Fig5 Effects of PP on HSF cell vialbility
2.6 UVB辐照对 HSF细胞活性的影响
如图 6所示，在 10～100 mJ/cm2 UVB辐照剂量范围内，同样培养 24 h条件下，随着辐照剂量的
增加，细胞活性逐渐呈降低趋势，10 mJ/cm2剂量时与对照组相比虽有下降但无显著差异，25 mJ/cm2
及以上剂量时与对照相比具有显著性差异。50 mJ/cm2剂量辐照时，HSF细胞活性抑制率约 35%，处
于合适的水平，后续研究统一选择 50 mJ/cm2作为制造 UVB损伤细胞模型的标准辐照剂量。
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6
0
20
40
60
80
100
**
**
**
ce
ll v
ial
bil
ity
/%
UVB（mJ/cm2): - 10 25 50 75 100
*

注：*P<0.05，**P<0.01vs,对照组；n=3
图 6 UVB辐照强度对 HSF细胞活性的影响
Fig6Effects of UVB intensity on HSF cell vialbility
2.7 紫菜多酚对 UVB损伤细胞的 LDH漏出、ROS水平及 SOD、GPX酶活影响
通过分析培养基中乳酸脱氢酶 LDH 酶活来测定细胞 LDH 的漏出量，从而间接反映出细胞膜所
受氧化损伤程度，结果如表 1 所示。与阴性对照组细胞相比，50mJ/cm2UVB 辐照细胞组培养基中的
LDH 酶活显著增加到 51.7 U/L，说明细胞膜受损伤严重，而紫菜多酚能有效保护细胞膜而降低细胞
LDH的漏出量，呈剂量依赖性。细胞 ROS水平反应了细胞氧化应激的程度，紫菜多酚也能显著抑制
UVB 辐照所致 HSF 细胞相对 ROS 水平的增加，在 10μg/mL 剂量时与 UVB 对照相比，使相对 ROS
水平降至 83.4%(P<0.05)，随着剂量增加，能进一步降低至 54.6%(P<0.01)，表明紫菜多酚能有效减轻
损伤细胞的胞内氧化应激水平。超氧化物岐化酶 SOD和谷胱甘肽过氧化物酶 GPX是机体重要的抗氧
化酶，反映了细胞的抗氧化应激状态，本实验结果表明紫菜多酚同样能提高 UVB 所致损伤细胞的
SOD、GPX酶活，提升细胞的抵抗氧化应激能力。
表 1 PP对 UVB致 HSF损伤细胞 LDH、ROS、SOD及 GPX的影响(n=3, x±s　 .)
Table 1 Effects of PPon LDH、ROS、SOD and GPX of damaged HSF cells induced by UVB (n=3, x±s　 .)
Group
LDH
（U/L）
ROS
(%)
GPX
（U/mgprotein）
SOD
（U/mgprotein）
Control 4.8±0.5 33.7±4.5 69.7±9.5 204.7±28.7
50mJ/cm2UVB 51.7±2.8** 100±0** 20.5±4.7** 102.8±20.4**
UVB+PP 10μg/mL 43.1±4.4# 83.4±7.6# 18.3±2.4 133.3±19.2
UVB+PP 50μg/mL 39.9±2.2# 64.8±9.7## 32.2±5.2# 154.3±27.7#
UVB+PP100μg/mL 31.9±3.8## 50.3±7.6## 50.3±9.3## 188.6±20.7##
UVB+BHT50μg/mL 28.6±2.8## 54.6±8.7## 55.1±6.4## 176.4±19.2##
注：**P<0.01vs阴性对照; #P<0.05##P<0.01 vsUVB辐照模型.
2.8 紫菜多酚抑制 UVB辐照所致 HSF细胞凋亡作用
Annexin V/PI双染法利用细胞凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻的特征，配合 PI进行细胞通透性检测，
可同时区分正常细胞（AV-/PI-）、早期凋亡细胞（AV+/PI-）、晚期凋亡细胞或坏死细胞（AV+/PI+，）
等处于不同病理状态的细胞[25]，结果图 7所示。从图 7A、B和 G中可知，50mJ/cm2剂量 UVB辐照
可使 HSF细胞的凋亡比例从正常细胞的约 8.9%增加到约 75%（P<0.01），正常细胞比例下降到 8.7%
（P<0.01），表明 UVB辐照诱导凋亡作用明显。从图 7C、D、E和 G中可知，PP在 10μg/mL时，细
胞凋亡比例有所降低，但不呈显著性；50μg/mL时，可显著降低至 55%（P<0.01），100μg/mL时进一
步降低至 40%左右（P<0.01）。表明，紫菜多酚能显著抑制 UVB 辐照所致的 HSF 细胞凋亡，呈剂量
依赖性，但抑制作用略逊于同等剂量的 BHT（图 7F、G）。
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A. Control B.50mJ/cm2UVB C.UVB+PP10μg/mL

D. UVB+PP50μg/mL E.UVB+PP 100μg/mL F.UVB+ BHT 50μg/mL
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.03
4
5
6
7
8
9
10
##
：BHT(ug/mL) - - - - - 50
：PP(ug/mL) - - 10 50 100 -
**
**
*
****
**
细
胞
相
对
比
例
HS
F
正常细胞
凋亡细胞
*
辐照：UVB - + + + + +
##

注：##P<0.01 vs阴性对照*P<0.05,**P<0.01vsUVB 模型对照, n=3.
G. 正常细胞和凋亡细胞相对比例比较
图7 AnnexinV/PI双染法检测紫菜多酚抑制UVB诱导HSF细胞凋亡作用
Fig7 The inhibitive effects of PPs on HSF cells’ apoptosis induced by UVB with AnnexinV/PI dual staining assay
3. 讨论
本工作以新鲜坛紫菜原料，经乙醇提取，硅胶树脂柱层析乙酸乙酯/甲醇体系洗脱除去小分子糖
类物质等杂质而分离得到了坛紫菜多酚，具有较强的体外抗氧化活性。
2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butyllatedhydroxytoluene, BHT）是广泛使用的通用型酚类抗氧化剂，
具有较强的抑制 ROS 活性，常用作考察抗氧化作用的阳性对照物；紫外辐射是一种重要的氧化应激
因素，UVB能通过与水、含半胱氨酸蛋白等发生光分解反应而产生 ROS对细胞产生氧化损伤；故本
实验以 BHT 作为考察紫菜多酚抗氧化及抑制 UVB 氧化损伤 HSF 细胞的阳性对照物。DPPH 作为一
种较稳定的自由基供体，广泛用于天然抗氧化剂自由基清除能力的评估，化合物对 DPPH·的清除能力
主要取决于其对未成对电子的配对能力，紫菜多酚的 DPPH·清除能力与同等浓度的 BHT相当甚至略
优于 BHT；FRAP分析反映了抗氧化剂通过电子转移将氧化态的 Fe3+还原为 Fe2+复合物的能力，也间
接反映了还原机体活性氧的能力，实验结果显示紫菜多酚也具有较强的铁还原抗氧化能力，但其活性
弱于同浓度的 BHT；β-胡萝卜素-亚油酸体系用于抗氧化分析是由于体系中亚油酸氧化产生过氧化氢
自由基，使得 β-胡萝卜素漂白褪色，如果体系中同时存在抗氧化剂，则会对抗过氧化氢自由基，对该
漂白褪色过程产生抑制作用，紫菜多酚同样具有较强的抑制 β-胡萝卜素褪色作用，但弱于 BHT 的效
果，在 8 mg/mL时的抑制率为 90.5%，与 BHT差距较小，而在 0.125 mg/mL时的抑制率为 21.4%，
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与 BHT差距较大。
UVB 辐照会打破细胞的氧化/抗氧化平衡状态，导致氧化应激增强，抗氧化系统严重受损，对细
胞产生氧化损伤，破坏细胞膜结构，使细胞产生凋亡等[26]。SOD、GPXs是机体重要的抗氧化酶，对
维持细胞氧化还原平衡具有重要作用。乳酸脱氢酶（LDH）是较为稳定的蛋白质，存在于绝大多数正
常细胞的胞质中，不能分泌到胞外，而一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外[27]；通过检测细胞
培养液中的 LDH活性（即 LDH的漏出量），可判断细胞受损的程度。本研究结果表明，在一定的剂
量范围内（0~100μg/mL），坛紫菜多酚能有效降低 UVB辐照所致 HSF细胞的 LDH漏出量，维护细胞
膜的完整性；增加受损细胞的 SOD、GPX 酶活，从而提升内皮细胞的抵抗氧化应激的能力；显著抑
制 UVB辐照所致的 HSF细胞凋亡情况。
综上，坛紫菜多酚具有较强的体外抗氧化作用；保护人表皮成纤维 HSF细胞免受 UVB辐照所致
的氧化损伤，降低损伤细胞 ROS 水平，降低细胞的凋亡程度，维护细胞结构的完整性。其机制有可
能是通过增加细胞中诸如 SOD、GPX 等抗氧化酶而实现，具体的分子机理还需进一步深入研究。本
实验的结果表明，坛紫菜多酚可望应用于防护紫外照射损伤领域，为紫菜资源的有效利用提供了科学
依据。
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