全 文 ：白黎芦醇对人口腔鳞癌 KB细胞增殖和凋亡的影响及其机制
杨征，张斌，米磊
(辽宁医学院附属第一医院口腔科，辽宁 锦州 121001)
摘 要:目的:探讨白藜芦醇对人口腔鳞癌 KB细胞的增殖及凋亡影响。方法:应用MTT比色法检测 Res对 KB细胞
体外生长的抑制作用;流式细胞仪测定细胞的周期和凋亡; Hoechst33258 荧光染料染色，显示凋亡细胞形态; Western blot
方法检测 survivin、Caspase － 3、Smac蛋白的表达。结果: Res能以剂量和时间依赖的方式抑制 KB 细胞生长，以剂量依赖
的方式使 KB细胞周期阻滞在 S期、诱导细胞凋亡; Hoechst33258 染色，可见细胞呈明显的凋亡特征; Western blot方法测
得 Res下调 KB细胞的 Survivin蛋白表达水平、增加 KB细胞胞浆的 Smac蛋白含量( P ＜ 0. 01) 、同时活化 Caspase － 3 蛋
白。结论: Res可抑制 KB增殖，使细胞周期呈 S 阻滞并可诱导细胞发生凋亡，Survivin、Caspase － 3 和 Smac 基因参与了
Res诱导 KB细胞凋亡的作用。
关键词:白藜芦醇;口腔鳞癌;细胞周期 ;凋亡; Survivin; Caspase － 3; Smac
中图分类号: R2 － 03 文献标识码: B 文章编号: 1000 － 1719( 2011) 04 － 0740 － 03
The Research of Anti － Proliferation and Induction of Apoptosis of Resveratrol
on Human oral Squamous Cell Carcinoma KB Cells in Vitro
YANG Zheng，ZHANG Bin，MI Lei
( Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，Liaoning，China)
Abstract: Objective: To study the resveratrol on human oral squamous cell carcinoma cells proliferation and apoptosis． Meth-
ods: MTT colorimetric assay of KB cell in vitro growth inhibition; Cell cycle phase distribution and hypodiploid DNA was deter-
mined by flow cytometry; Hoechst33258 fluorescent dye staining，indicating apoptotic cell morphology; Western － blot method of
detection of survivin，Caspase － 3，Smac protein expression． Results: Res able to dose － and time － dependent manner inhibited KB
cell growth; A dose dependent manner makes KB cell cycle arrest in S phase and induce apoptosis; Hoechst33258 staining，show-
ing characteristics of apoptosis cells were significantly; Western － blot method measured Res down Survivin protein expression in
KB cells，and increase the KB cell cytoplasm Smac protein content( P ＜ 0． 01) ，Caspase － 3 protein was activated． Conclusion: Res
inhibits proliferation of KB cell，the cell cycle arrest was S can induce apoptosis，Survivin，Caspase － 3 and Smac gene involved in
apoptosis of KB cell．
Key words: Resveratrol; KB; cell cycle; apoptosis; Survivin; Caspase － 3 Smac
收稿日期: 2010 － 07 － 02
基金项目:辽宁省教育厅高等学校科学研究项目( L2010315)
作者简介:杨征( 1972 － ) ，男，辽宁人，住院医师，学士，研究方向: 抗瘤
药物研究。
通讯作者:米磊( 1982 － ) ，男，陕西人，硕士研究生，研究方向:抗癌药物
研究。
流行病学及大量动物实验已经证实人类食物中的
许多天然成分可阻断肿瘤的发生和发展，具有良好的预
防和治疗肿瘤的作用。白黎芦醇( Resveratrol，Res) 是
1940年首次从毛叶黎芦( veratrum grandinorum) 的根部
分离得到的非黄酮类多酚化合物，分子式是 C14H1203，
分子量 228. 25，化学结构式是 3，5，4’－三轻基 －反 －
二苯乙烯。表明 Res 作为一种低毒的天然药物，对消
化、血液、呼吸、生殖等多个系统来源的多种肿瘤细胞，
在肿瘤的发生发展中发挥抑制效应，可显著抑制多种人
类肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡［1 －3］。但目前，国
际上对 Res在人口腔鳞癌方面的研究还远未深入。本
实验研究 Res对 KB细胞增殖与凋亡的影响，旨在证实
Res对舌癌具有潜在的治疗作用。
1 材料与方法
1. 1 细胞株 口腔鳞癌细胞 KB 购于中国典型培养
物保藏中心。
1. 2 药物及试剂 RPMI1640 培养基 ( 干粉) 购自美
国 Gibco公司;新生小牛血清购自杭州四季青有限公
司; DMSO、碘化丙啶、胰酶( 分装) 购自 Sigma 公司; 鼠
抗人 survivin、smac 购自北京中杉公司; 兔抗人
Caspase － 3 购自博奥森公司; Hoechst33258 染色试剂
盒为南京凯基公司; PVDF膜购自 Millipore公司。
白藜芦醇( Res) : sigma 公司，纯度 99%，用 DMSO
溶解配成 1O0mmol /L 的原溶液，分装，－ 20℃避光保
存备用。实验前以 RPMI1640 培养液稀释成不同浓
度，DMSO终浓度 ＜ 0. 5%。
1. 3 MTT法检测不同浓度 Res 对肿瘤细胞的抑制作
用 将 KB细胞密度调整为( 4 ～ 5 ) × 104 /mL 的细胞
悬液。96 孔板每孔加入细胞悬液 100μL，培养液
100μL，调零孔加入 200μL 培养液。实验组加入不同
浓度的 Res，使其终浓度分别为 6. 25、12. 5、25、50、
100、200、300μmol /L，对照组则加等量不含药物的培
养液。每个剂量 3 个平行孔。于 24、48、72h，各取一
块 96 孔培养板中，每孔加入新鲜配制的浓度为 5g /L
的 MTT20μL，继续培养 4h后取出培养板，小心吸弃培
养基，每孔加 DMSO150μL，轻轻震荡 10min后，用酶联
仪于 490nm处测出各孔吸光度值( OD 值) ，按下式计
算细胞抑制率: 细胞抑制率 ( % ) = ( 1 － 给药孔平均
OD值 /对照孔平均 OD值) × 100%。实验重复 3 次。
1. 4 流式细胞仪( FCM) 分析细胞周期 分别消化收
集以 0、12. 5、25、50 和 100μmol /L Res处理 24h 的 KB
·047· 辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 4 期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2011.04.169.yangzh.067
细胞，调整细胞浓度至 1 × 106 /mL 各取 lmL; 1000rpm
离心 5min，吸弃上清，PBS洗 1 次，加无水乙醇，置 4℃
固定过夜。检测时用 PBS洗细胞 2 次，PI 复合染液暗
处染色 30min后上流式细胞仪检测。
1. 5 流式细胞仪( FCM) 检测细胞凋亡 以 0、12. 5、
25、50、100 和 200μmol /L Res 处理 KB 细胞 24h，分别
消化收集各组细胞，调整细胞浓度至 1 × 106 /m 各取
1mL; PBS 洗涤 2 次后，弃上清液; 加入预冷的结合缓
冲液 100IL 重悬细胞，置冰浴; 加入 5IL AnnexinV /
FITC和 10IL PI 于细胞悬液中; 置于室温避光染色
30min;补加 400IL 结合缓冲液混悬细胞，流式细胞仪
进行检测，分析细胞凋亡的百分比。
1. 6 荧光显微镜观察凋亡 将预处理过的盖玻片置于
6孔板内，KB 细胞( 5 × 105 /孔) 接种过夜，加入 25、50、
100μmol /L的Res继续培养24h。PBS洗2次，固定液(甲
醇与冰乙酸的体积比为 3∶ 1) 固定 15min，PBS洗一次，加
Hoechst33258荧光染料 ( 5mg /L ，PBS配制) ，37℃避光孵
育 15min，封片，于荧光显微镜下观察、照相。
1. 7 Western blot 半定量检测 survivin、smac 及
Caspase3 蛋白表达 将 KB 细胞( 1. 5 × 106 /孔) 接种
于 6 孔培养板中过夜，实验分组及药物处理同上。吸
除培养液，PBS洗涤后，每孔加入细胞裂解液 50μL，获
得总蛋白。以牛血清白蛋白( BSA) 做标准品，测蛋白
浓度。取 50μg总蛋白经 10%聚丙烯酞胺凝胶电泳分
离后，转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶 ( 含 0. 1%
Tween20 ) 封闭 1h，加兔抗 survivin 及鼠抗 smac、
Caspase3、β － actin 一抗 4℃孵育过夜 ( β － actin 做为
上样量对照) ，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗室
温孵育 2h，洗膜，ECL 法显色后 GIS 凝胶图像分析系
统拍照并分析处理。
1. 8 统计学方法 所有数据均为 3 次独立实验结
果，以均数 ±标准差( 珋x ± s) 表示，采用 SPSS 13. 0 统计
软件进行单因素方差分析和 t 检验。P ＜ 0. 05 认为差
异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 Res 对 KB 细胞生长的抑制作用 Res 在
12. 5μmol /L以下对 KB 细胞生长无显著影响，25μmol /
L Res处理细胞 KB48h 和 72h 后对细胞生长有抑制作
用( P ＜ 0. 05) 。在 50 ～ 300μmol /L 浓度范围内，Res 作
用 24h后，对 KB 细胞的增殖有显著的抑制作用( P ＜
0. 01) ，并且随着 Res浓度的增加，对细胞的抑制率也逐
渐增加。同浓度的 Res 对 KB 细胞的抑制作用随着时
间的延长也逐渐增强，但无统计学意义( 见插页图 1) 。
2. 2 Res对 KB细胞周期分布的影响 KB 细胞在经
12. 5、25、50、100μmol /L Res处理 24h 后，随着浓度的增
加，G1 期比例逐渐下降，S 期比例逐渐升高，G2 期比例
逐渐下降，50、100μ mol /L Res处理后 G1 期下降和 S期
比例升高有统计学意义( P ＜0. 05) ( 见插页图 2) 。
2. 3 Res 对 KB 凋亡的影响 经 12. 5、25、50、100、
200μmol /LRes处理 KB细胞 24h后，随着浓度的增加，
细胞早期凋亡率和晚期凋亡及坏死率逐渐增加，且早
期凋亡率增加显著，Res浓度在 25μmol /L 以上有统计
学意义 ( P ＜ 0. 05 ) 。提示 Res 以浓度依赖方式诱导
KB细胞发生凋亡和坏死，以凋亡为主。
2. 4 Hoechst33258 荧光染料染色 荧光显微镜下，空
白对照组正常细胞染色质均匀、核形态规则。实验组
KB细胞形态发生显著变化，呈现染色质边集、核固缩、
核片断化，凋亡小体形成。随着 Res浓度增加，凋亡细
胞明显增多，甚至出现大片细胞脱落形成细胞托失区
( 见插页图 3) 。
2. 5 Western blot 检测 survivin; smac 及 Caspase － 3
蛋白表达经 Res处理 24h后，经Westemblot检测:对照
组可见明显的 Survivin 蛋白条带，随着作用浓度的增
加，Survivin蛋白表达逐渐下降( P ＜ 0. 01 ) ; 对照组仅
见极微弱的 Smac 蛋白条带，随着作用浓度的增加，
Smac蛋白表达逐渐增加( P ＜ 0. 01) ;随着作用浓度的
增加，可检测到 Caspase － 3 的活化亚基，且随浓度增
大活化程度更明显( 见插页图 4) 。
3 讨 论
MTT 法检测药物对肿瘤细胞的抑制作用具有简
便、快速、灵敏度高、重复性好等优点，现已广泛应用于
抗癌药物的临床前研究中。本研究通过 MTT 法结果
表明，50 ～ 300μmol /L的浓度范围 Res对 KB细胞的增
殖有抑制作用，并且表现出时间依赖性和浓度依赖性。
笔者通过细胞周期分析发现 Res可引起 KB 细胞发生
S期阻滞，从而抑制了细胞增殖。这可能是 Res 抑制
口腔鳞癌细胞增殖的原因。但是，Res 对不同细胞系
的细胞周期分布的影响是不一致的［4 ～ 8］。这种细胞周
期的干预的差异可能与细胞系的不同特性有关。
Res除了化学预防和细胞周期调节作用外，还能
诱导肿瘤细胞发生凋亡。本研究中，AnnexinV 和 PI
双染提示 20 ～ 200μmol /L 处理口腔鳞癌癌细胞 24h
后，凋亡细胞数明显增多，并且有浓度依赖性，而坏死
的细胞数变化不如凋亡率显著，说明 Res 在该浓度范
围内诱导 KB细胞凋亡效应要强于引起细胞坏死的作
用，进一步证实诱导细胞凋亡是杀伤 KB 细胞的作用
机制之一。
近年发现 IAPs 在抑制细胞凋亡过程中发挥重要作
用，Survivin作为 IAP基因家族成员之一，主要表达于细
胞有丝分裂周期中的 S期及G2/M期［9］，广泛表达于各种
肿瘤组织中，而在正常组织不表达或低表达，显示其在癌
组织中处于失控的表达状态［10 －12］。本研究结果表明，在
口腔鳞癌细胞 KB中 Survivin基因表达明显，随着 Res浓
度的增加及作用时间的延长，Survivin蛋白的表达逐渐降
低，并使 KB细胞生长阻滞于 S期，细胞发生凋亡。提示
调 Survivin蛋白的表达，从而可能下调其对终末效应蛋白
Caspase －3和Caspase －7的直接抑制作用或对 Caspase －
3的间接抑制作用，使细胞凋亡增加。
许多研究证明 Smac 参与线粒体途径的细胞凋
亡［13］。Res诱导 KB 细胞凋亡的过程中有 Smac 蛋白
表达增加，表明 Res增加 KB细胞浆内 Smac 蛋白含量
可能是通过促进 Smac 从线粒体内释放增加所致，从
而可通过结合 Survivin释放了凋亡过程下游执行分子
Caspase － 3，增强 Caspase － 3 的活性，发挥了促进口腔
鳞癌细胞凋亡的作用。
Fuldas等［14］为了检测 Res介导的细胞周期捕获是
否需要 Caspase 活性，用广谱的 Caspase 抑制剂
zVAD. fmk可以抑制 Res、TRAIL或 Res和 TRAIL联合
处理诱导的凋亡，但是 zVAD. fmk 不影响 Res 介导的
p53 和 p21 表达上调和 Survivin 表达下调、G1 期捕获。
提示 Res介导的对 TRAIL 诱导的凋亡的敏感性需要
Caspase － 3活性，但Res诱导的细胞周期捕获和p53，
·147·辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 4 期
p21 或 Survivin 蛋白的表达的调节不需要 Caspase － 3
活性。那么 Res 诱导 KB 细胞凋亡的过程中是否有
Caspase － 3 的活化，本文用不同浓度的 Res 处理 KB
细胞 24h后，Caspase － 3 蛋白的表达水平随着作用浓
度的延长而增加，表明在 Res 可能通过裂解活化
Caspase － 3 蛋白而诱导 KB细胞凋亡。
总之，Smac 可通过两种途径促进凋亡，即对
Caspase 3 的蛋白水解作用和增强成熟 Caspase 3 的酶
催化活性，这两种功能都有赖于 Smac 与 IAPs 的相互
作用［15］。本研究结果表明，经过 Res 诱导作用，细胞
的 Survivin表达水平显著降低，而 smac 蛋白表达水平
上调，Caspase － 3 的蛋白被活化，提示 Res 可能促进
Smac释放增加，通过结合 survivin 释放了凋亡过程下
游执行分子 Caspase － 3，活化 Caspase － 3 蛋白，发挥了
促进 KB细胞凋亡的作用。
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收稿日期: 2010 － 07 － 04
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作者简介:付伟( 1975 － ) ，女，吉林长春人，讲师，博士研究生，研究方
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莪术黄芪超滤膜提取物诱导人 SGC7901 胃癌细胞凋亡的研究
付伟1，2，孙志广3，蒋立峰1
( 1. 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210046; 2. 甘肃中医学院临床医疗系，甘肃 兰州 730000;
3. 江苏省中医院消化科，江苏 南京 210029)
摘 要:目的:观察莪术黄芪超滤膜提取物对人 SGC7901 细胞是否具有凋亡诱导作用。方法:四氮唑蓝比色法( MTT
法) 观察莪术黄芪超滤膜提取物对人 SGC7901 细胞细胞的抑制率;应用流式细胞术，DNA凝胶电泳方法检测细胞凋亡的
发生。结果: ( 1) 莪术黄芪超滤膜提取物对人 SGC7901 细胞的生长有明显的抑制作用，与对照组相比有显著性差异( P ＜
0. 01) ，抑制作用与剂量及时间呈显著性正相关。( 2) 莪术、黄芪超滤膜提取物诱导人 SGC7901 细胞发生凋亡，1. 6g /L处
理，72h效果最佳。结论:莪术黄芪超滤膜提取物抑制人 SGC7901 细胞生长并促其凋亡。
关键词:莪术黄芪超滤膜提取物; SGC7901 胃癌细胞;凋亡;抑制率
中图分类号: R735． 2 文献标识码: B 文章编号: 1000 － 1719( 2011) 04 － 0742 － 03
Study on the Ultra － filtration Extract from Rhizoma Curcumae and Astragalus
Membranaceous in Inducing SGC7901 Cell Apoptosis
FU Wei1，2，SUN Zhi-guang3，JIANG Li-feng1
( 1． The First Clinical College of Nanjing University of TCM，Nanjing 210029，Jiangsu，China;
2． The Clinical Medical Department of Gansu College of TCM，Lanzhou 730000，Gansu，China;
3． The Traditional ChineseMedical Hospital of Jiangsu Province，Nanjing 210029，Jiangsu，China)
Abstract: Objective: To observe the effect of the ultra － filtration extract from Rhizoma Curcumae and Astragalus Membrana-
ceous on inducing human SGC7901 cell apoptosis． Methods: SGC7901 cell proliferation was detected by MTT colorimetry． Apopto-
·247· 辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 4 期