全 文 ：Marine Sciences /Vol. 30 , No. 5 /2006
微绿球藻 DNA质粒文库的构建
赵大显 ,周志刚
(上海水产大学 农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室 , 生命科学与技术学院 , 上海 200090)
摘要:微绿球藻(Nannochloropsis oculata)DNA 被提取纯化并经超声波处理后, 将所得大小在
1. 6 ～ 3 kb 之间的 DNA片段用 T4 DNA聚合酶补平, 再与 Sma I 酶切消化并经去磷酸化处理
的质粒载体 pUC18连接 ,转化至 DH10B大肠杆菌(Escherichia coli)的感受态细胞中。建立的
DNA 质粒文库容量含 2×104个克隆, 其中重组子占 90%。随机挑选白色菌落并培养, 抽提的
质粒经 Xba I和 Sac I双酶切鉴定 ,显示重组的质粒中均含有大小不等的 DNA 插入片段。
关键词:微绿球藻(Nannochloropsis oculata);超声处理;质粒载体 pUC18;DNA 文库
中图分类号:Q78　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-3096(2006)05-0087-05
　　在系统分类地位上 , 有人[ 1] 认为微绿球藻或眼
点拟微球藻(Nannochloropsis oculata)属绿藻门
(Chlo rophyta)、绿藻纲(Chlo rophyceae), 也有人[2 , 3]
认为它属金藻门(Chry sophy ta)、真眼点纲(Eustig-
ma tophyceae)。微绿球藻是单细胞藻 ,呈球形 , 直径 2
～ 4 μm , 单独或集合 , 色素体一个 , 淡黄绿色 , 侧生 ,
仅占原生质体的一部分 , 无蛋白核 , 有淀粉粒 1 ～ 3
个 ,细胞壁极薄[ 1] 。微绿球藻细胞富含二十碳五烯酸
(EPA)[ 4 ,5] 、蛋白质 、维生素等物质 , 是健康食品和药
品的重要资源之一。其中 , EPA 不仅是水产动物幼
体发育必需脂肪酸之一 , 还能增强水产养殖动物免
疫系统功能 , 提高成活率和抗病力[ 6 , 7] 。 因此 , 微绿
球藻还是一种非常重要的海产经济饵料微藻[ 8 , 9] 。
目前国内外对微绿球藻的研究多集中在藻的培
养工艺[ 10～ 16] 、分子系统学[ 3 ,17 ,18] 及环境因子对 EPA
生物合成影响等方面。有关环境因子与 EPA 生物合
成关系的研究主要涉及温度[ 19] 、氮源与 N /P[ 20～ 21] 、
pH [22] 、碳源[ 23]等因素对其脂肪酸组成及含量的影
响。关于微绿球藻 EPA 生物合成的生化调控机制未
见研究报道。作者拟构建微绿球藻 DNA 的质粒文
库 ,为今后克隆和表达与 EPA 合成相关酶的基因 ,进
一步探讨藻细胞中 EPA 的生物合成途径及分子调控
机理奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　藻种与培养
微绿球藻系上海水产大学饵料藻种室提供。使
用 f /2 培养液[ 24] ,在 25℃、3500lx 连续光照的条件下
培养至对数生长期 ,离心收集。
1. 2　DNA 提取
将收集的微绿球藻用灭菌海水清洗 2 次后 ,除了
不用鲍鱼酶处理细胞壁外 , 其他操作步骤均按 Hu
等[ 25]叙述的方法提取 DNA 。
1. 3　外源插入片段制备
取 DNA 4 ～ 5μg 于 1. 5 mL Eppendoff 管中 , 用
超声波按工作 2 s , 间歇 10 s 的程序多次重复处理 ,
并在重复过程中 , 取 10 μL 已处理的样品 , 用 1%的
琼脂糖凝胶电泳观察处理效果 ,尽可能使大部分处理
的 DNA 片段集中在 1. 6 ～ 3 kb 之间。然后用 T4
DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)补平超声波处理的
DNA 片段 , 100μL补平体系含 2. 5 U T4 DNA 聚合
酶及 2μL 10 mmol /L 的 dNTPs , 37℃水浴反应 1 h
后 , 用酚 /氯仿终止反应。然后用 QIAquick 胶抽提
试剂盒(Qiagen 公司)回收 1. 6 ～ 3 kb 之间的 DNA
片段。
1. 4　克隆载体制备
用限制性内切酶 Sma I(TaKaRa 公司)完全消化
质粒载体 pUC18 DNA(Invitrog en 公司), 再用碱性
磷酸酶(CIP)(NEB 公司)对酶切后的质粒载体
(pUC18 /Sma I)DNA 按 Sambrook 等方法[ 26]去磷酸
化处理。
收稿日期:2004-06-30;修回日期:2005-02-20
基金项目:国家转基因植物研究与产业化开发专项(JY03-B-
20);上海市属高校自然科学研究资助项目(01H04)
作者简介:赵大显(1979-),男 ,江西新建人 ,硕士研究生 ,从
事藻类生物技术研究 , E-mail:dxzhao @s tm ail. s hfu . edu.
cn;周志刚 ,通讯作者 , 电话:021-65710533 , E-mail:zgzhou
@shfu . edu. cn
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1. 5　连接与转化
将外源插入片段与去磷酸化的质粒 pUC18 混合
后 ,加入 T4 DNA 连接酶(Invitrog en 公司), 于 14℃
温浴过夜。将连接液于 70℃灭活 10 min 后 , 放于漂
在 TE 缓冲液(1 mmo l /L EDTA , 10 mmo l/ L T ris-
HCl , pH 8. 0)的 Millipor e纯化膜( =0. 025 μm)上 ,
静置点透析 1. 5 h 以达到纯化目的 , 然后吸出膜上已
纯化的连接液放于 1. 5 m L的离心管中 , 待转化用。
将渗析后的连接液用高压电穿孔法[ 26] 转化至感
受态 DH 10B大肠杆菌(Invitrog en 公司)。转化后立
即加入 1 m L平衡至室温的 SOC 液体培养基[ 26] , 在
37℃振荡培养(200 r /min)1 h 后 , 取 100 μL 菌液涂
布到 LB/氨苄 /IPTG /X-Gal平板上 , 于 37℃倒置培
养过夜后观察分析菌落生长情况。
1. 6　重组质粒鉴定
随机挑取 6 个白色菌落进行小规模培养 ,用小量
质粒抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)
提取质粒 DNA , 再用 Xba I 和 Sac I 对提取的质粒
DNA 进行双酶切鉴定。
2　结果与讨论
2. 1　DNA 提取
用 H u等[ 25]的方法自微绿球藻中提取的 DNA
经 1%琼脂糖凝胶电泳(图 1), 表明 DNA 的分子量
约为 23 kb , 没有 RNA 的污染。通过紫外检测可知 ,
A260 /A280的比值在1. 82 ～ 1. 89之间 ,可用于下一步的
酶切及 PCR实验。
图 1　微绿球藻 DNA 在 1%琼脂糖凝胶上的电泳图
Fig. 1 　Elect rophoresis pat tern of total DNA isolated
f rom Nannoch loropsis ocu lata on 1% agarose
gel
M:λDNA /HindⅢ大小标准;1 泳道:λDNA;2 ～ 4泳道:3 次独
立提取的DNA
M:λDNA /HindⅢ;Lane 1:λDNA;Lanes 2 ～ 4:Independent
isolations o f DNA f rom Nannochloropsis oculat a
2. 2　克隆载体制备
超螺旋质粒载体 pUC18 的 DNA 经 Sma I 消化
处理后于 1%琼脂糖凝胶电泳(图 2), 结果表明超螺
旋质粒 pUC18的 DNA经 Sma I 酶切后变成了线形
DNA 。用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去除线状 DNA 两
端的 5’ 磷酸基团 ,可以防止载体的自身连接并环化 ,
从而降低细菌转化时的背景。 处理后的质粒 DNA
质量浓度为 25 mg /L。
图 2　质粒 pUC18 DNA 的 Sma I 酶切图谱
Fig. 2 　Res t riction map of pUCI18 DNA diges ted
by Sma I
M:λDNA /Hind Ⅲ大小标准;1泳道:pUC18 DNA;2 ～ 4
泳道:Sma I 酶切后的pUC18 DNA
M:λDNA /HindⅢ;Lane 1:pUC18 DNA;L anes 2～ 4:
pUC18 DNA digested by S ma I
2. 3　外源插入片段的制备
由于超声波处理的随机性 , 当微绿球藻 DNA 经
超声波打碎后, 还有部分核 DNA 未被有效地打断 ,出
现如图 3 所示大于 10 kb 的条带。将超声波处理的
DNA用 T4 DNA 聚合酶进行末端平滑化 , 平滑化的
DNA(图 3B)电泳图谱在 1. 6 ～ 3 kb 之间出现一块明
亮且连续的区域。鉴于质粒载体只能插入约 2 kb 大
小的外源 DNA , 将图 3B中 1. 6～ 3 kb 之间的 DNA片
段 ,经 QIAquick 胶抽提试剂盒回收后得到 30 μL末端
平滑化的微绿球藻 DNA ,其质量浓度约 30 mg / L。
2. 4　连接与转化
末端平滑化的 DNA 与经过 S ma I 酶切和去磷
酸化处理的质粒DNA 连接 , 转化至大肠杆菌 DH 10B
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图 3　超声处理(A)及末端平滑化(B)的 DNA 电泳图
Fig. 3 　Elect rophoresis pat terns of ul trasonicated and b lunt-ended DNAs of N annoch lorop sis oculata
M:GeneRulerTM 1 kb DN A Ladder大小标准;1泳道:超声处理(A)及平滑化(B)的DNA
M:GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder;Lane 1:ult rasonicated (A) and blunt-ended (B)DNA s
感受态细胞后 , 在 LB /氨苄 /IPTG /X-Gal 平板上形
成蓝白斑(图 4)。从 30 μL 连接液中取 1. 5 μL 进行
转化 ,加 1 mL SOC 复性后取 100 μL 涂平板可得白
斑 110个 , 蓝斑 12个 , 白斑(即重组子)约占总菌落的
90%,说明微绿球藻基因组 DNA 已有效地克隆到
pUC18 载体上。由此估算该基因组文库的容量约为
2×104个克隆。
图 4　基因组文库的蓝白斑筛选
Fig. 4　Blue /w hite color screening of ge-
nomic lib rary
2. 5　重组质粒酶切鉴定
2. 5. 1　质粒 DNA 抽提
随机挑取 6 个白色菌落进行小规模培养 ,用小量
质粒抽提纯化试剂盒提取质粒 DNA , 经 1%琼脂糖
凝胶电泳发现 DNA 大小在 4～ 6 kb 之间(图 5)。
图 5　重组质粒 DNA 的电泳图
Fig. 5　Elect ropho resis pat terns of recombin ant plasmid
DNAs
M:λDNA /Hind Ⅲ大小标准;1 ～ 6泳道:重组质粒DNA
M:λDNA /Hind Ⅲ;Lane s 1～ 6:recombinant plasmid DNAs
2. 5. 2　双酶切鉴定
重组质粒 DNA 经 X ba I 和 Sac I 双酶切后于
1%琼脂糖凝胶的电泳结果如图 6 , 其中约 2 700 bp
是质粒经双酶切后的共同带 ,图 6 同样显示出随机挑
取的 3个白色菌落中均含有大小不等的插入片段。
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图 6　重组质粒的酶切图谱
Fig. 6　Rest rict ion mapping of the recombinan t plas-
mids digested by X ba I an d Sac I endonu cleases
M:GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus大小标准;
1泳道:经 Xba I /Sac I双酶切的质粒载体 pUC18 DNA;2 ～ 4
泳道:经 Xba I / Sac I双酶切的重组质粒DNA
M:GeneRule rT M 100 bp DNA Ladde r Plus;Lane 1:pUC18
DNA dige sted by Xba I /Sac I;Lanes 2 ～ 4:recombinant plas-
mid DNAs digest ed by Xba I /Sac I
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mid vector pUC18
ZHAO Da-xian , ZHOU Zhi-gang
(Key Labo rato ry o f Gene tic Resources and Eco lo gy in Aquacluture , the M inistry of Ag riculture , Shanghai
Fisheries Univ ersity , and College o f Aqua-Life Science and Techno log y , Shanghai Fishe ries Unive rsity ,
Shanghai 200090 , China)
Received:Jun. , 30 , 2004
Key words:Nannochlorop sis ocu lata;ult rasonicat ion;plasmid vector pUC18;genomic lib rary
Abstract:The genomic DNA iso la ted and purified f rom Nannochloropsis oculata w as shea red af te r a
treatment with an ultrasonic pro cessor . The treated DNA w as blunt-ended w ith T4 DNA po lymerase and then
was collected f rom 1. 6 kb to 3 kb in size. The targ et blunt-ended DNA w as cloned into pla smid vecto r pUC18
which was previously digested w ith S ma I and dephospho ry lated with calf alkaline pho sphatase. The recombi-
nant plasmid was tr ansfo rmed into Escherichia coli DH 10B com petent cells and the genomic libr ary w as con-
str ucted. There w ere about 2×104 clones in the genomic library of N. oculata , and the percentage of recombi-
nants w as about 90%. It w as confirmed tha t all randomly selected plasmids of w hite colonies contained tar get
DNA inser ts f rom 1. 6 kb to 3 kb in size after restriction mapping with Xba I and S ac I endonucleases.
(本文编辑:张培新)
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