全 文 ：2013年 第49卷 第3期 AnimalScienceandBiotechology·畜牧生物技术
SIR2是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）
家庭成员之一，参与酵母交配型基因、端粒区基因和
rDNA沉默，并抑制rDNA的重组，增加1个拷贝的SIR2
基因可延长酵母的寿命，延缓其衰老 [1-2]。哺乳动物
Sirtuins家族有7个成员（SIRT1-SIRT7），其中SIRT1与
SIR2的同源性最高，因此受到广泛关注。SIRT1在体
内通过对几种控制代谢及内分泌信号的转录因子去
乙酰化作用来调节其活性，从而广泛参与哺乳动物
细胞寿命的不同信号通路及糖代谢，胰岛素分泌等
多条代谢通路，参与众多基因转录、能量代谢及细胞
衰老的调节过程 [3-5]。SIRT1在调节多种转录活性中
以一种组织特异性方式发挥作用，提示SIRT1的表达
在哺乳动物生理学方面可能具有广泛的效应。
白藜芦醇（RES）是自然界中存在的一种植物多
酚，广泛存在于葡萄等多种植物中，是一种植物抗毒
素，具有抗炎、抗癌、抗氧化、雌激素样作用等多种
生理活性。近年来研究发现，白藜芦醇是去乙酰化
酶SIRT1最有效的激活剂 [6-7]。卵巢颗粒细胞是目前
广泛用于相关基因研究的有效且成熟的细胞模型。
对发育的卵泡而言，细胞凋亡的最终表现为卵泡闭
锁，其中颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要直接
原因，了解颗粒细胞凋亡的调控机制，对研究卵泡闭
锁、卵巢衰老十分重要。因此本研究分析白黎芦醇
诱导的去乙酰化酶SIRT1高表达对猪卵泡颗粒细胞
凋亡的影响，将有助于更好地研究SIRT1基因在猪卵
巢卵泡发育，发情排卵中的作用机理，可为更深入地
研究猪SIRT1基因生物学特性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品 实验猪由江苏省农科院六合苏钟猪原
种场提供，采集新鲜健康的猪卵巢，置于37℃生理盐
水（添加青霉素和链霉素）中，2 h内带回实验室，用
PBS清洗卵巢3~4次，选择直径为3~5 mm的卵泡进行
颗粒细胞采集。
1.2 主要仪器和试剂 Trizol试剂盒为Invitrogen公司
产品，M-MLV Reverse Transcriptase为Promega公司产
品，DMEM-F12液体培养基、新生胎牛血清、DPBS为
GIBCO公司产品，无RNase的dNTPMixture、Buffer、SYBR
Premix Ex TaqTM为TaKaRa公司产品，Annexin V-FITC细
胞凋亡检测试剂盒购自凯基公司，Bio-Rad Iq5型荧光
定量PCR仪，SZ-51连续变倍体视显微镜，Leica倒置荧
光显微镜，BIO-RAD电泳凝胶成像系统。
1.3 颗粒细胞的原代培养 选择直径为3~5 mm的
大卵泡，用一次性注射器抽取卵泡液，将卵泡液打入
15 mL离心管中，离心，弃上清，加入适量PBS悬浮细
胞，并吹打至散，离心，取适量DMEM/F-12将细胞重
悬浮，并吹打均匀，细胞计数，调整密度至106/mL；接
种于25 cm2培养瓶中，每个培养瓶加2~3 mL DMEM/
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收稿日期：2012-08-31；修回日期：2012-11-05
资助项目 ：江苏省自然科学基金 （BK2010466）；江苏省农业科技
自主创新资金 （CX（10）422）；国家生猪现代产业技术体系南京
综合试验站（CARS-36）；江苏省农业种质资源库
作者简介：李碧侠（1979-），女，博士研究生，副研究员
*通讯作者
白黎芦醇诱导的去乙酰化酶SIRT1高表达
对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响
李碧侠1，2，赵 芳2，任守文2，王学敏2，方晓敏2，付言峰2，涂 枫2，王金玉1*
（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京 210014）
摘 要：本研究旨在分析体外白藜芦醇对去乙酰化酶SIRT1表达量的影响，探讨去乙酰化酶SIRT1表达量与颗粒
细胞凋亡间的相关性 。 采用qRT-PCR方法进行SIRT1 mRNA分析 ， nnexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和流式
细胞仪检测猪卵巢颗粒细胞凋亡率 。 结果表明 ：培养液中白黎芦醇浓度达到50μmol/L时 ，处理组颗粒细胞中
SIRT1 mRNA表达量极显著高于空白对照组（P<0.01）；与颗粒细胞中SIRT1表达量规律相同 ，随着白黎芦醇浓度
的升高，颗粒细胞活力逐渐降低 ，凋亡率逐渐升高 。 综合分析 ，白藜芦醇可诱导猪卵巢颗粒细胞中去乙酰化酶
SIRT1的表达，加速猪卵巢颗粒细胞凋亡，SIRT1表达与猪卵巢颗粒细胞凋亡存在一定相关性。
关键词：白黎芦醇；颗粒细胞；SIRT1；凋亡；猪
中图分类号：S828.5 文献标识码：B 文章编号：0258-7033（2013）03-0069-04
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F-12培养基，做好标记，置于37℃ 5％CO2培养箱中
培养，12 h后观察细胞贴壁状况，24 h后换液，待细
胞密度达90%时将细胞传代。体外培养的猪卵巢颗
粒细胞密度达80%时将培养液分别更换为RES剂量
为10、25、50、75、100 μmol/L的DMEM-F12培养液，空
白对照添加相应剂量溶剂DMSO的DMEM-F12，处理
培养24 h后，采用qRT-PCR技术对猪卵巢颗粒细胞
SIRT1基因的mRNA进行定量分析。
1.4 SIRT1 mRNA表达量的检测 根据GenBank中
公布的猪SIRT1基因序列设计引物，扩增片段长度为
130 bp，上游引物序列为 5′ -ATTCTTGTGAAAGT－
GATGAGGATG-3′，下游引物序列为5′- ATTGTTC－
GAGGATCTGTGCC-3′；管家基因GAPDH的引物序
列：上游引物序列为5′- TGAAGGTCGGAGTGAACG－
GAT-3′，下游引物序列为 5′ -TGGGTGGAATCAT－
ACTGGAAC -3′，扩增片段长度为148 bp。引物由上
海生物工程技术公司合成。利用Trizol法提取猪卵巢
颗粒细胞总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA质
量和浓度，进行反转录、qRT-PCR扩增，绘制荧光定
量标准曲线，检测荧光定量重复性和稳定性，具体方
法见参考文献 [8]。
1.5 颗粒细胞凋亡率的检测 本实验采用凯基生物
公司的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒对猪卵巢
颗粒细胞凋亡率进行检测，实验步骤参照试剂盒说明
书。分别将空白对照组细胞和RES浓度为10、25、50、
75、100 μmol/L的培养基处理过的细胞用PBS清洗2遍，
然后用不含EDTA的胰酶消化，分别收集到1.5 mL离心
管中，用PBS洗涤细胞2次，弃上清，收集细胞约1×106；
每个样品管中加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，
然后加入5 μL Annexin V-FITC（20 μg/mL）混匀，加入
5 μL Propidium Iodide（50 μg/mL），混匀，室温避光反应
5～15 min；1 h内将样品送至南京鼓楼医院进行流式细
胞仪的观察和检测。结果利用WinMDI2.9软件分析，通
过计数凋亡区细胞数量得出凋亡率。
1.6 统计分析 每种处理试验均重复3次，用SPSS13.0
软件进行不同浓度白黎芦醇与SIRT1表达量、颗粒细
胞凋亡率组间差异分析，以及SIRT1表达量与颗粒细
胞凋亡率间的相关分析。
2 结果与分析
2.1 不同浓度白黎芦醇对SIRT1表达量的影响 图
1表明，随着白黎芦醇浓度的升高，SIRT1 mRNA表达
量逐渐增多。培养液中白黎芦醇浓度为10、25 μmol/
L时，处理组颗粒细胞中SIRT1mRNA表达量与空白
对照组没有显著差异；培养液中白黎芦醇浓度为50、
75、100 μmol/L时，处理组颗粒细胞中SIRT1mRNA表
达量极显著高于空白对照组（P<0.01）（见图1）。
注：**表示与空白对照组比较差异极显著 （P<0.01）。 下图同
图1 不同浓度白黎芦醇培养的
颗粒细胞中SIRT1相对表达量
2.2 不同浓度白黎芦醇对猪卵巢颗粒细胞活力和
凋亡率的影响 采用AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测
试剂盒和流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡率。如图2
和图3所示，随着白黎芦醇浓度的升高，颗粒细胞活
力逐渐降低，凋亡率逐渐升高。与颗粒细胞中SIRT1
表达量规律性相同，培养液中白黎芦醇浓度为10、
25 μmol/L时，处理组与空白对照组没有显著差异；
培养液中白黎芦醇浓度为50、75、100 μmol/L时，处
理组极显著高于空白对照组（P<0.01）。
A： 空白对照组，B：10 μmol/L RES处理，C：25 μmol/L RES处理，D：50
μmol/L RES处理，E：75 μmol/L RES处理，F：100 μmol/L RES处理。 图
中纵坐标和横坐标分别为PI荧光及AnnexinV/FITC荧光强度，第一象
限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞， 第二象限代表坏死细胞，
第三象限代表正常细胞，第四象限代表凋亡细胞。
图2 流式检测不同浓度白黎芦醇
培养液中颗粒细胞凋亡率
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图3 不同浓度白黎芦醇
培养液中颗粒细胞存活率
2.3 颗粒细胞中SIRT1表达量与细胞凋亡率间的相
关性 由图4可见，颗粒细胞凋亡率与SIRT1表达量
间的变化规律一致，均为培养液中白黎芦醇浓度达
50 μmol/L以上时，处理组与空白对照组存在极显著
差异（P<0.01）。
图4 不同浓度白黎芦醇培养的颗粒细胞存活率和SIRT1
mRNA 相对表达量
3 讨 论
3.1 白黎芦醇与SIRT1表达量间的变化规律 Howitz
等 [1]学者在筛选 l8种去乙酰化酶激活剂中发现，白
藜芦醇是作用最强的SIRTI激活剂。随后人们发现，
白藜芦醇通过激活SIRT1蛋白调节能量代谢、氧自
由基水平、提高基因组稳定，延长细胞和生物体自
身寿命，从而达到抗衰老作用。白藜芦醇还能通过
调节PPAR-γ、PGC-1α、FOXO家族、NF-kβ、TYR等
基因的表达参与能量代谢、抗氧化等多条信号通
路，防止或延缓很多疾病的发生和发展，可有效防治
癌症、心血管病、2型糖尿病和神经变性等疾病 [9-11]。
但其是否直接地激活SIRT1去乙酰化酶仍然存在争
议，体外试验结果表明白藜芦醇不能直接作用于
SIRT1去乙酰化酶。白藜芦醇通过抑制cAMP磷酸二
脂酶而激活SIRT1去乙酰化酶，从而改变衰老相关
的代谢变化。小鼠和细胞实验证实白藜芦醇通过
抑制cAMP磷酸二脂酶，升高cAMP含量，随后引起
NAD+升高，最终激活SIRT1去乙酰化酶 [12]。本研究
发现，随着体外培养液中白藜芦醇浓度的升高，猪
卵巢颗粒细胞中 SIRT1 mRNA表达量出现显著升
高，处理组与空白对照组间存在极显著差异。以上
结果已明确白藜芦醇在一定浓度范围内可上调猪
卵巢颗粒细胞中SIRT1表达量，但具体调控机制需
进一步研究。
3.2 猪卵巢颗粒细胞中SIRT1表达量与颗粒细胞凋
亡率间的相关性 研究发现，SIRT1与多种信号传导
通路中的蛋白相互作用，使生物体内的组蛋白、赖氨
酸残基、转录因子发生去乙酰化，并参与神经保护、
细胞衰老凋亡、糖脂类代谢、胰岛素分泌、炎症氧化
应激反应、血管生成等过程，发挥其对基因的调控功
能 [13-14]。
目前有关猪SIRT1基因的研究刚刚起步，且主要
集中在脂肪代谢方面。SIRT1表达量随着脂肪细胞的
分化而逐渐升高，SIRT1表达量增加可促进脂肪细胞
内脂滴沉积，降低培养基中甘油含量，同时发现抑制
SIRT1基因表达可促进猪前体脂肪细胞凋亡 [15-16]。为
了研究SIRT1基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响，本
实验分析了白藜芦醇诱导SIRT1 mRNA基因变化与
颗粒细胞凋亡间的规律性，结果发现两者变化规律
一致，但由于本实验未分析两者内在相关性及其关
联机制，因此需要更多的深入研究。
4 结 论
白藜芦醇作为猪SIRT1基因有效的激活剂，可
诱导猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达，同时可
加速颗粒细胞凋亡，颗粒细胞中SIRT1表达量与颗
粒细胞凋亡存在一定关联性，具体调控机制需进
一步研究。
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（下转 80 页）
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（上接 71 页）
异（P>0.05），可判定黄腐酸原粉小鼠精子畸形试验
结果为阴性。
3 结 论
矿源黄腐酸分别对大、小鼠进行经口急性毒性
试验（LD50测定），经1周观察无临床中毒症状，未见
死亡。依据急性毒性分级评价标准可判断样品属无
毒级。
对矿源黄腐酸原粉分别进行鼠伤寒沙门氏菌回
复突变试验（Ames试验）、小鼠骨髓细胞微核试验及
小鼠精子畸形试验，试验结果均为阴性。由此可以
判断矿源黄腐酸无遗传毒性。
本试验证实了矿源黄腐酸不具有急性毒性和遗
传毒性，初步认可其安全性，但后期还需要进行长期
喂养试验，目前长期饲喂试验正在进行当中。本试
验研究为矿源黄腐酸应用于畜牧养殖业的安全性评
价奠定了理论基础。
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