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热带海洋学报 JOURNAL OF TROPICAL OCEANOGRAPHY 2012 年 第 31 卷 第 1 期: 67−71
doi:10.3969/j.issn.1009-5470.2012.01.010 http://www.jto.ac.cn


收稿日期: 2010-11-02; 修订日期: 2011-02-14。卢冰编辑
基金项目: 广东省科技计划项目(2006B20201061); 广东省海洋渔业科技推广专项(A200899E01); 中国水产科学研究院南海水产研究所中
央级公益性科研院所专项资金项目(2007TS01, 2010TS02)
作者简介: 陈素文(1968—), 女, 广东省揭阳市人, 研究员, 从事海水贝藻育苗及养殖的研究。E-mail: chensuwen407@163.com，Tel:
020-84451432
海洋生物学
海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附着的影响
陈素文, 吴进锋, 陈利雄
中国水产科学研究院南海水产研究所, 广东 广州 510300
摘要: 为了研究海萝的非繁殖季节孢子育苗方法, 进行了 2 个实验来研究海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附
着的影响。1) 6组不同风干程度海萝种藻在−18℃冷冻保存 6个月后取出在 16℃水中进行孢子的释放, 种藻风干到干重
为原鲜重约 25%的组, 孢子的保存效果最好, 该组种藻释放孢子量约为对照组(未经风干和保存的种藻)的 77.6%, 且孢
子的附着率与对照组的差异性不显著; 2) 风干到重量为原鲜重约 1/4的种藻分别保存于−18℃、−36℃、−80℃, 在保存
8个月后, 每一保存温度下的种藻分别在 8℃、12℃、16℃、20℃水中释放孢子, 种藻在水温 12℃下释放的孢子量最多;
保存于−36℃、−80℃的种藻较保存于−18℃的释放孢子量多。本实验结果为海萝的非繁殖季节孢子育苗找到一种简便的
方法, 也为该属藻类的种质保存提供了参考。
关键词: 海萝种藻; 冷冻保存; 孢子
中图分类号: P735.2; S968.4 文献标识码: A 文章编号: 1009-5470(2012)01-0067-05
Effects of freezing storage of fertile Gloiopeltis furcata on its released spores’
number and spores’ attachment
CHEN Su-wen, WU Jin-feng, CHEN Li-xiong
South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China
Abstract: In order to study spore culture of Gloiopeltis furcata in non-reproduction season, two experiments were conducted
on freezing storage of fertile Gloiopeltis furcata in terms of its released spores’ number and spores’ attachment. In the first
experiment, six group of fertile Gloiopeltis furcata of different dry-degree was preserved at −18℃ for six months and then
released at water temperature of 16℃. The results showed that the best preservation effect of fertile Gloiopeltis furcata was the
group that dry weight was about 25% of its fresh weight. The released spores’ number of this group was about 77.6% of the
control group (the fertile Gloiopeltis furcata which was not dealed with air drying and preservation) and there was no signifi-
cant difference in spores’ attachment between this group and the control group. In the second experiment, fertile Gloiopeltis
furcata that dry weight was about 1/4 of its fresh weight was preserved at −18℃, −36℃, and −80℃ for eight months and then
released spores at water temperature of 8℃, 12℃, 16℃, and 20℃. The results showed maximum spores appeared at water
temperature of 12℃ and fertile Gloiopeltis furcata that preserved at −36℃ and −80℃ released more spores than those pre-
served at −18℃. The two experiments showed a simple and convenient method for spore culture of Gloiopeltis furcata in
non-reproduction season and would assist the preservation of germ plasm of Gloiopeltis.
Key words: fertile Gloiopeltis furcata; freezing storage; spore

海萝(Gloiopeltis furcata)隶属于红藻门红藻纲
隐丝藻目内枝藻科海萝属[1]。海萝属藻类可食用、
药用及作为工业原料 , 是经济价值很高的红藻
类[2-4]。在海萝属藻类资源量日益减少、市场需求量
日益高涨的情况下, 开发其养殖成为必然, 而开发
海萝属藻类的养殖, 首先要解决苗种的来源。利用
68 热 带 海 洋 学 报 Vol. 31, No. 1/ Jan., 2012

人工采孢子育苗将是解决苗种来源的重要途径。
自然海区中, 每年夏天来临之际, 海萝属藻类
释放出孢子后, 藻体就腐烂消失, 只剩下海萝基座,
秋冬之季, 才可见新长出的芽体, 海萝属藻类以孢
子萌发成的盘状体或腐烂后剩下的基座来度夏[4-5]。
在南方, 每年 3—4月份获得成熟种藻后进行人工育
苗, 要到 11 月份左右, 海区水温降到合适范围时才
能把苗种拿到海区去进行栽培, 在这期间需要降温,
相应的生产成本就很高。如把海萝的孢子保存起来,
等夏天过去后再进行培苗, 那将是省时、省力、节
能的育苗方式。
大型海藻的孢子保存普遍采取直接保存孢子的
方法, 主要有低温冷藏、冷冻及超低温保存[6-9], 陈国
宜等[10]研究了海萝孢子的超低温保存法, 殷明焱[11]
则研究了海萝的组织培养。这些方法主要是从保存
种质的目的出发 , 目前尚未在苗种生产上得到应
用。本文试验了操作简单, 较易应用于育苗生产的
冷冻保存海萝种藻来保存孢子的方法, 有望为海萝
属藻类进行非繁殖季节的人工育苗奠定基础, 也为
其种质保存提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料和实验地点
在海萝繁殖季节(2—4 月份), 采集广东省深圳
市三门岛周围海域的成熟海萝种藻作为实验材料。
实验于 2007年 2月份至 2009年 4月份在中国
水产科学研究院南海水产研究所的实验室进行。采
用人工气候培养箱维持 16℃水温和 7000 lx光照度。
种藻保存采用−18℃、−36℃、−80℃冰箱来满足实验
相应保存温度。所有实验均采用 1000mL 烧杯作为
种藻释放孢子时的容器; 孢子附着时则用 500mL烧
杯作为容器, 用载玻片平放于烧杯底部作为孢子的
附着基。
1.2 方法
1.2.1 不同风干程度种藻的保存实验
所采集的海萝种藻去除杂藻并经海水清洗后 ,
用干净干燥的毛巾吸去表面的水分, 称取 7 份种藻,
每份 360g, 其中 1份不阴凉风干作为对照组, 其他 6
份分别进行阴凉风干作为处理组。空气湿度大或室
温超过 24℃时, 用空调抽湿或降温来加快种藻阴凉
风干的速度或维持较低温度。6 份种藻经不同时间
的风干, 分别成 6种不同重量(具体见表 1)。对照组
与各个处理组均分为 9小份(原湿重都为 40g), 各取
6小份用塑料薄膜袋分装为 6小包密封保存于−18℃,
取余下的 3 小份作为 3 个平行组, 于 900mL (16℃)
海水中进行种藻释放孢子实验: 首次是在 6h 后, 将
每一烧杯中种藻捞出后定量水中孢子密度, 第 2 次
及第 3 次都是在种藻放入新鲜海水 12h 后再捞出种
藻和定量水中孢子密度。每次测量完水中孢子密度
后, 每一烧杯取 30000 个孢子各放于 400mL (16℃)
水中, 搅拌让孢子均匀附着于载玻片上, 隔 24h后,
测量载玻片上孢子的附着密度。

表 1 不同风干程度的种藻
Tab. 1 Fertile Gloiopeltis furcata of different air-dry
degree
组别 风干后重量占风干前重量的百分比/% 风干后的表观和手感
A 36.4 种藻干软、暗红色
B 33.4 种藻略干硬、颜色加深
C 27.9 种藻有点干硬、颜色深
D 25.0 种藻干硬、颜色更深
E 22.9 种藻干硬, 变黑
F 19.9 种藻很干硬, 黑色

保存于−18℃的对照组和每种不同风干程度的
种藻在保存后 1个月、6个月时, 每一组每次取出 3
包作为 3 个平行组也进行如上的孢子释放及附着实
验, 试验各自的保存后效果。
1.2.2 种藻不同保存温度和解冻温度的实验
在前面实验的基础上, 第 2 年将采集的成熟种
藻洗净阴凉风干到原鲜重的 1/4, 称取 48 份, 每份
9g。在进行保存前, 取 12份作为对照组, 余下的 36
份种藻用塑料薄膜袋装为 36 小包密封平分保存于
−18℃、−36℃、−80℃。对照组种藻分别放于 8℃、
12℃、16℃、20℃海水中进行孢子的释放及附着, 每
一份种藻用 900mL 海水来进行孢子的释放(每 3 份
为同一温度组)。孢子释放具体操作同 1.2.1。每次测
量完种藻释放出孢子密度后, 每一个烧杯取 30000
个孢子各放于相对应温度的海水(400mL)中进行孢
子的附着, 搅拌均匀, 隔 24h后, 测量载玻片上孢子
的附着密度。
保存于−18℃、−36℃、−80℃的种藻在保存后 8
个月, 每一保存温度条件下的 12份种藻(每 3份为同
一温度组)分别放入 8℃、12℃、16℃、20℃海水中
进行孢子的释放及附着, 方法同对照组。
1.2.3 数据的测量及统计分析
测量每个烧杯水中孢子密度时, 搅拌均匀, 随
机取样 10次, 每次取 2μL孢子水在显微镜下测定孢
子的数量。每一份种藻释放孢子的量为 3 次释放出
陈素文等: 海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附着的影响 69

孢子量的总和。随机测定每一片载玻片上 10个视野
(10×10)中孢子附着数量来计算孢子的附着密度。
孢子的附着率=3 次孢子附着密度的平均数×500mL
烧杯底部面积/30000个×100%。
不同组别之间数据的差异性比较采用统计软件
SPSS 12 中的方差分析进行多重比较。实验结果的
所有数据均为平均值±标准偏差。
2 结果
2.1 不同风干程度种藻的冷冻保存效果
风干前、风干后和保存后各组种藻释放孢子量
如表 2。对照组的种藻在保存后没有孢子释放出。
种藻风干到其重量不小于原鲜重 1/3 的 A 组、B 组
在保存前所释放的孢子量与对照组差异性不显著 ;
保存 1个月后, A组只有极少量孢子释放出来, B组
所释放的孢子量则约为对照组保存前所释放孢子量
的 56.2%; 保存 6个月后, A组没有孢子释放出来, B
组所释放的孢子量则约为对照组保存前所释放孢子
量的 30.5%。种藻风干到其重量小于原鲜重 1/3的 C、
D、E、F 组, 在保存前每一组所释放出的孢子量显
著比对照组所释放出的孢子量少, 特别是风干到为
其原鲜重约 1/5的 F组, 已没有孢子释放出; C组与
D 组在保存前、保存后 1 个月所释放的孢子量没有
显著性差异, 都约为对照组的 77.6%; E 组与 D 组
一样, 在保存后 1个月、6个月释放孢子量都与保存
前的没有显著性差异, 但 E 组所释放孢子量明显比
D组的少。
各组种藻在保存前释放出的孢子, 其附着率与
对照组的差异性不明显; 保存后, 除了 A、B组所释
放孢子的附着率明显比对照组的小之外, C、D、E
组所释放孢子的附着率与保存前的没有显著性差异
(表 3)。

表 2 不同风干程度种藻在保存前后释放的孢子数量
Tab. 2 Released spores’ number of fertile Gloiopeltis furcata of different dry degree before and after storage
孢子数量/万个 组别 种藻重量/g
保存前 保存 1个月 保存 6个月
对照组 40 1740±226.50a 0 0
A 14.56 1740±187.35a 54±32.45e 0
B 13.36 1710±238.12a 978±137.48c 531±90.00d
C 11.16 1320±187.35b 1395±119.05b 840±187.35c
D 10 1350±180.00b 1245±212.67b 1131±242.56b
E 9.16 978±137.48c 915±158.00 c 870±187.35c
F 7.96 0 0 0
注: 表中各组种藻的原湿重都为 40g。标注相同字母的数据之间差异性不显著; 标注不同字母的数据之间差异性显著, P＜0.05。

表 3 不同风干程度种藻在保存前后所释放孢子的附着率
Tab. 3 Attachment rate of spores released by fertile Gloiopeltis furcata of different dry degree before and after storage
孢子附着率/%
组别
保存前 保存 1个月 保存 6个月
对照组 83.92±4.80 a 0 0
A 80.64±4.14 a 63.91±5.30 b 0
B 81.12±5.57 a 64.72±5.01 b 60.43±4.98 b
C 79.83±4.56 a 80.45±4.79 a 78.34±5.89 a
D 82.71±5.04 a 83.12±4.67 a 80.54±4.19 a
E 84.53±4.64 a 78.54±5.75 a 81.71±5.27 a
F 0 0 0
注: 表中标注相同字母的数据之间差异性不显著, 标注不同字母的数据之间差异性显著, P＜0.05。

2.2 不同保存温度种藻在不同解冻温度释放孢子
的结果
阴凉风干到为其鲜重约 1/4 的种藻保存于−18
℃、−36℃、−80℃ 8个月后, 不同保存温度下的种
藻在不同水温下所释放孢子量具有显著性差异(表
4)。对照组在 8℃、12℃释放的孢子量比在 16℃、
20℃下释放的明显少; 而经过低温保存的各组种藻,
在 12℃下释放的孢子量比在其他温度下释放的明显
多, 在 20℃的最少; 保存在−36℃、−80℃与对照组
的种藻在 8℃、12℃下释放的孢子量没有显著性差
70 热 带 海 洋 学 报 Vol. 31, No. 1/ Jan., 2012

异, 这 3组种藻释放的孢子量比保存在−18℃的种藻
释放的孢子量明显多。
不同保存温度下的种藻和对照组在同一水温下
释放孢子的附着率没有显著性差异; 同一组种藻在不
同水温下所释放孢子的附着率具有显著性差异, 在 16
℃下孢子的附着率最高, 在 12℃下的次之(表 5)。

表 4 不同保存温度的种藻在不同水温下所释放的孢子量
Tab. 4 Number of spores released by fertile Gloiopeltis furcata of different storage temperatures into different water
temperatures
孢子数量/万个
组别
8℃ 12℃ 16 ℃ 20℃
对照组 873.5±104.4a 1026.3±121.4b 1225.2±132.1c 1293.6±106.3c
−18℃ 498.9±59.4d 630.4±158.0e 587.2±107.5ed 464.7±95.7d
−36℃ 885.1±96.3a 1032.3±114.0b 898.9±85.6a 658.6±91.6e
−80℃ 805.6±84.6a 981.3±118.6b 785.6±69.8a 615.7±78.9e
注: 各组孢子数量为 9g种藻(原湿重 36g)所释放孢子数量; 表中标注相同字母的数据之间差异性不显著, 标注不同字母的数据之间差异性
显著, P＜0.05。

表 5 不同保存温度的种藻在不同水温下所释放孢子的附着率
Tab. 5 Attachment rate of spores released by fertile Gloiopeltis furcata of different storage temperatures into different
water temperatures
孢子附着率/%
组别
8 ℃ 12℃ 16℃ 20℃
对照组 28.63±5.77a 71.12±4.92b 80.44±6.07c 30.51±6.39a
−18℃ 26.56±6.31a 68.45±5.15b 78.31±7.11c 29.43±6.03a
−36℃ 31.75±6.18a 69.54±5.34b 79.21±6.08c 27.12±5.43a
−80℃ 29.30±7.13a 70.78±5.87b 80.54±6.23c 28.39±6.42a
注: 表中标注相同字母的数据之间差异性不显著, 标注不同字母的数据之间差异性显著, P＜0.05。

3 讨论
海萝属的藻体,分为孢子体、雌雄 2种配子体和一
种寄生在雌配子体的果孢子体, 孢子体与配子体在非
繁殖季节外形难于区分, 而成熟的雌配子可由突出于
藻体的囊果(果孢子体)来与孢子体区分开来[5]。本实
验所采用的成熟种藻主要是孢子体, 也有少数配子
体混杂在其中。
本实验研究海萝种藻的冷冻保存, 其目的在于
研究其孢子的保存, 所以选择了种藻释放孢子量及
孢子附着率作为种藻保存效果的衡量指标。在实验
中观察到: 海萝孢子为不动孢子, 活力好的孢子在
释放后 1min内就能附着,但在 20h内, 孢子都有附着
能力; 种藻经过冷冻后所释放的孢子, 其附着时间
要比对照组的延长, 但在采苗 24h 后, 有附着能力
的孢子已基本附着且用水冲洗都没法把它冲洗下来;
16℃下, 孢子附着 22h 左右开始进行第一次分裂,
已附着的各组孢子萌发率(76%左右)差异性不明显。
本实验选择了在采苗 24h 后再测孢子附着率, 这个
附着率可以代替孢子萌发率来衡量种藻冷冻后的效
果。在实验中还观察到, 海萝种藻释放孢子不是一
次性释放, 而是分散的。本实验只统计每一组种藻
前 3 次释放(2d 内)孢子的总量, 虽然这不是每一组
种藻总的释放量, 但因种藻在 2d后释放出的孢子已
大为减少, 不同组别之间差异性已不明显, 所以也
就忽略不计。
不同风干程度种藻的保存实验结果表明, 种藻
不经风干(对照组)就直接冷冻保存, 即使只保存一
个月也没孢子释放出来; 种藻风干程度不够的, 保
存时间越长, 其孢子的释放量就越少; 过分干燥的
种藻(干重为其原鲜重约 1/5)在保存前就没有孢子释
放出来; 风干程度合适的(干重为其原鲜重约 1/4),
其孢子释放量在保存前与保存后 6个月后都是一样,
所释放孢子量约为对照组的 77.6%且孢子的附着率
与对照组的差异性不显著。因此, 掌握好种藻的风
干程度是种藻冷冻保存的关键。
不同冷冻保存温度及解冻温度的实验结果表明,
长时间保存海萝种藻(8个月), 在−36℃、−80℃下的
保存效果比在−18℃的好。这符合细胞在冷冻后的活
性随着时间的延长而降低, 随着冷冻温度的降低而
提高的原理[6]。一些学者的研究表明冷冻的海藻细
胞活性与其解冻速率有关, 解冻越快越好[6]。本实验
陈素文等: 海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附着的影响 71

没有进行解冻速率的研究, 但从另一方面进行了不
同解冻温度的效果研究, 结果表明, 冷冻的种藻在
12℃下, 释放的孢子量最多, 在 16℃下所释放孢子
的附着率最高, 而在 20℃下效果最差。这与其他学
者所报道的大部分海藻较适合的解冻温度为 20—41
℃不同。大部分海藻需要快速解冻是为了减少抗冻
保护剂的毒性作用[9], 本实验没有采用抗冻保护剂,
因而海萝种藻的解冻不受这个因素影响, 而是与海
萝的生活习性有关。海萝藻体生活的最适温度范围
为 12—16℃, 其孢子附着最适温度为 16℃[12]。种藻
在 12℃下释放孢子量最多的表观现象是解冻后的种
藻在较低温度下不易腐烂, 在第 2、第 3次放入海水
中仍有较多孢子释放出, 而在 20℃时种藻腐烂的较
多, 第 3次放入海水中已基本上没有孢子释放出来。
在 8℃时种藻也不易腐烂但孢子的释放量没有 12℃
时多, 这与较低的温度也不利于孢子的释放有关。
大型海藻种质保存最常用的方法有离体组织培
养法及低温冷冻保存方法[9,11]。离体组织培养由于操
作复杂, 而且愈伤组织生长缓慢, 因此限制了其在
大规模生产上的应用。低温冷冻保存方法主要有低
温(4℃)保存、冷冻(−40℃)保存、低温真空冷冻干燥
法和超低温保存法(−196℃)[9]。超低温保存法是长久
保存海藻种质遗传稳定性的最好方法, 但因其需要
加入冷冻保护剂(有毒性)且需要液态氮, 较难在苗
种生产上得到应用; 低温(4℃)保存法, 只适合于种
质的短时间保存; 低温真空冷冻干燥是先把种质冷
冻, 后用真空技术使物料干燥的方法, 这与本实验
所采用的先干燥后冷冻不同; 其他的冷冻保存海藻
的方法也与本实验的不同, 大多需要加入抗冻保护剂,
如紫菜丝状体和羊栖菜离体生殖托的冷冻保存[13-14]。
本实验操作简单, 只要掌握好海萝种藻的风干程度,
在普通冰箱就能达到保存好孢子的作用, 其生产应
用性强。应用本实验结果进行海萝种藻冷冻保存 ,
在南方夏季高温期过后取出种藻来进行人工育苗已
获得成功, 该方法已获国家发明专利[15] (“海萝属藻
类种藻的保存育苗方法”200810030121.5)。虽然本
实验只统计了种藻保存 8 个月释放孢子的数据, 但
延续的实验表明, 海萝种藻在冷冻保存一年后, 仍
然有孢子释放及附着。这表明采用冷冻保存海萝种
藻也能进行种质的长时间保存。
海藻的抗干燥性、抗冻性依种类的不同而不同[9]。
本实验只研究海萝种藻干燥冷冻保存法, 但我们也进
行了鹿角海萝冷冻保存法的研究, 其结果与海萝的差
不多。所以种藻干燥冷冻保存法适应于海萝属藻类,
对于其他藻类的应用则还需要根据各自的抗干燥性、
抗冻性摸索出合适的方法来进行。
参考文献
[1] 曾呈奎, 张德瑞. 中国经济海藻志[M]. 北京: 科学出版社,
1962: 123-178.
[2] 中国人民解放军后勤部卫生部, 上海医药工业研究所. 中
国药用海洋生物[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977: 27.
[3] 余杰, 许肇成, 颜璐璐, 等. 海萝多糖抗突变与抗肿瘤作
用的研究[J]. 汕头大学学报: 自然科学版, 2007, 22(2):
59-63.
[4] 吴进锋, 陈素文, 陈利雄, 等. 广东沿海海萝属藻类生态
与分布调查[J]. 南方水产, 2007, 3(5): 7-13.
[5] 須藤俊造. 養フノリの 殖(A)[M]. 産學水 集成. 日本: 東
學 會京大 出版 , 1957: 819-828.
[6] TAYLOR R, FLETCHER R L．Cryopreservation of eu-
karyotic algae-a review of methodologies[J]. Journal of Ap-
plied Phycology, 1999,10: 481-501.
[7] TAYLOR R, FLETCHER R L. A simple method for the
freeze-preservation of zoospores of the green macroalga En-
teromorpha intestinalis[J]. Journal of Applied Phycology,
1999, 11: 257–262.
[8] DATTA B H, BABITA P, YONG-KI H, et al. A simple me-
method to preserve algal spores of Ulva spp. in cold storage
with ampicillin[J]. Hydrobiologia, 2007, 592(1): 399-404.
[9] 张玉荣, 李大鹏, 于子山. 大型海藻种质保存的原理和方
法[J]. 海洋科学, 2009, 33 (7): 107-112.
[10] 陈国宜, 阙求登．几种红藻孢子的超低温保存[J]．热带海
洋, 1989, 8(1): 67-72.
[11] 殷明焱. 组织培养保存大型海藻种质的研究[D]. 青岛:
中国科学院海洋研究所, 2005: 1-107.
[12] CHEN S W, WU J F, CHEN L X, et al. Effects of light and
temperature on the attachment and development of Gloio-
peltis tenax and Gloiopeltis furcata tetraspores[J]. Journal of
Applied Phycology, 2011,23:1045-1051.
[13] KUWANO K, ARUGA Y, SAGA N. Preliminary study on
cryopreservation of the conchocelis of Porphyra yezoensis[J].
Nippon Suisan Gakkaishi 1992, 58(10): 1793–1798.
[14] 邹定辉, 高坤山. 羊栖菜离体生殖托低温超低温的保存[J].
水产学报, 2010, 34(6): 935-941.
[15] 中国水产科学研究院南海水产研究所. 海萝属藻类种藻
的保存育苗方法: 中国, 200810030121.5[P]. 2009-01-14.