全 文 ：刺松藻多糖抗凝血及抗血栓作用的研究
汪艳秋1, 2 ,刘宪丽 2 ,刘东颖 2 ,吴荣杰1 ,邹向阳 2 ,侯　林 1
(1.辽宁师范大学生命科学学院 , 辽宁 大连　116029;2.大连医科大学生物技术系 ,辽宁 大连　116044)
摘要:目的　研究刺松藻多糖抗凝血作用及对血小板聚集的影响。方法　采用热水浸提乙醇沉淀法制备刺松藻多糖。家兔心
脏采血 , 取血浆检测活化部分凝血酶时间(APTT), 凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT);采用红外比浊法测定刺松藻多糖对
血小板聚集的影响。采用胶原蛋白-肾上腺素诱导小鼠血栓模型实验 ,检测刺松藻多糖抗血栓作用。结果　刺松藻多糖能显著
延长家兔血浆 APTT、PT和 TT;显著抑制由二磷酸腺苷(ADP)引起的家兔血小板聚集 ,对胶原蛋白 -肾上腺素诱导的小鼠血栓性
偏瘫及死亡率均有明显降低。结论　刺松藻多糖具有抗凝血 、抑制血小板聚集和抗血栓作用。
关键词:刺松藻;多糖;抗凝血活性;抗血栓活性;血小板聚集
Anticoagulantandantithromboticefects
ofpolysaccharideofCodiumfragile
WANGYan-qiu1, 2 , LIUXian-li2 , LIUDong-ying2 , WURong-jie1 , ZOUXiang-yang2 , HOULin1
(1.CollegeofLifeSciences, LiaoningNormalUniversity, Dalian　116029, China;
2.DepartmentofBiotechnology, DalianMedicalUniversity, Dalian　116044, China)
Abstract:Aim　ToinvestigatetheinhibitingeffectsofpolysaccharideofCodiumfragileonbloodcoagulationandplateletaggregation.
Methods　PolysaccharidesofCodiumfragilewereextractedbyusinghotwaterextractionandethanolprecipitation.Theactivepartial
thromboplastintime(APTT), pronthrombintime(PT)andthromboplastintime(TT)ofrabbitsweretestedbyclottingmodelinvitro.Infra-
redturbidimetricmethodwasusedtoestimatetheefectofplateletaggregation.Mousemodelofthrombosisbyinjectingcolagen-adrena-
linewasappliedtoobservetheantithromboticeffects.Results　ThepolysaccharidescansignificantlyprolongedAPTT, PTandTT, promi-
nentlyinhibitedtheplateletaggregationinducedbyadenosinediphosphate(ADP).Thehemiplegyanddeathratewasdecreasedinmouse
byinjectingcolagen-adrenaline.Conclusion　Polysaccharidehasanticoagulantandantithromboticefect.
Keywords:Codiumfragile;polysaccharide;anticoagulantactivity;antithromboticactivity;plateletaggregation
基金项目:辽宁省教育厅高校科研计划基金资助项目(No2009A199)
作者简介:汪艳秋 ,女 ,硕士研究生
通讯作者:侯　林 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:海洋动物细胞生物
学 , E-mail:houlin01@126.com
　　刺松藻(Codiumfragile)属绿藻门 , 为多年生世界性暖温
带海洋植物。中医认为 ,刺松藻性味甘咸寒 ,具有清热解毒 、
消肿利水 、驱虫之功效 [ 1] 。 CianciaM和 AthukoralaY等发现 ,
从阿根廷和韩国海域生长的刺松藻热水提取物具有抗凝血活
性 [ 2, 3] 。本研究采集大连黄海海域自然生长的刺松藻 , 采用
热水浸提和乙醇沉淀法制备刺松藻多糖 ,探讨其对活化部分
凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)的
影响 , 对血小板聚集的抑制作用 , 以及对胶原蛋白-肾上腺素
诱导小鼠血栓性偏瘫和死亡的保护作用。
1　材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　药品与试剂　注射用赖氨匹林(LAS)8.33 g· L-1 ,安
徽省蚌埠安宝制药厂;二磷酸腺苷(ADP)为 Amresco产品;活
化部分凝血活酶时间测定(APTT)试剂盒 , 血浆凝血酶原时间
测定(PT)试剂盒, 凝血酶时间(TT)试剂盒, 上海太阳生物技术
公司产品。阿司匹林片, 购自山西医科大学制药厂;胶原蛋白 ,
购自上海生工生物工程有限公司;肾上腺素 , 购自上海禾丰制
药有限公司。刺松藻多糖:刺松藻 2009年 4月间采自大连海
域 ,经辽宁师范大学生命科学学院王宏伟教授鉴定为 Codium
fragile。多糖提取采用热水浸提乙醇沉淀法:新鲜藻体洗净 ,匀
浆后 ,按 1∶2(W/V)加入蒸馏水, 90°C浸提 5 h, 过滤 ,藻渣重复
提取一次, 合并两次滤液 ,减压浓缩至原体积的 1/5, 三氯乙酸
除蛋白, 3 000r·min-1离心 20min, 上清液加入乙醇至终浓度
70%, 静置过夜 , 3 000 r· min-1离心 20min, 多糖沉淀以少量
三蒸水重悬 ,冷冻干燥得刺松藻多糖(C.fragilepolysaccharides,
CFPS)。采用硫酸-苯酚法测定总糖含量为 35.11%, BaCl2-明
胶比浊法测得硫酸根含量为 9.02%。
1.1.2　实验动物　新西兰兔 ,体重 2.5 ～ 3.5 kg, 雌雄不限;
昆明小鼠 , 雌性 ,体重 18 ～ 22 g, 6 ～ 8周龄 ,大连医科大学 SPF
动物实验中心提供。
1.1.3　实验仪器　FD-1真空冷冻干燥机:北京博医康实验
仪器有限公司;酶标仪:ThermoElectionCorporation;LBY-NJ2
血液凝聚仪:北京普利生科贸集团。
1.2　方法
1.2.1　体外抗凝血实验　新西兰兔心脏取血 , 动脉血与抗凝
剂比例 9∶1, 轻度混匀 , 3 000 r· min-1离心 15 min, 收集上层
液(血浆)。将待测血浆分成 4份 , 每份血浆 0.1ml, 分别加入
等体积的生理盐水 , 125、250、500、1 000 mg· L-1刺松藻多糖
溶液 , 制备含不同浓度多糖药物的混合血浆 ,按试剂盒说明 ,
用血凝仪分别测定 APTT、PT、TT。
1.2.2　对 ADP诱导新西兰兔血小板聚集的影响　健康新西
兰白兔 ip戊巴比妥钠 30 mg· kg-1麻醉 , 颈动脉插管放血 ,
0.109 mol· L-1枸橼酸钠抗凝(1∶9)。 室温下 1 000 r·
·804· 安 徽 医 药　AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal　2011 Jul;15(7)
min-1 , 离心 10 min, 收集上清为富血小板血浆(PRP);余液继
续以 3 000 r· min-1离心 15 min, 上清为制贫血小板血浆
(PPP)。参照血小板聚集仪说明操作。用 PPP调 PRP血小
板计数为 3×105 /μl, 设阴性对照组:PRP200 μl+生理盐水
10 μl;阳性对照组:PRP200 μl+LAS10 μl;实验组:PRP
200 μl+刺松藻多糖 10μl。 37℃预热 2min后 , 加入 ADP10
μl(终浓度 3 μmol· L-1)启动血小板聚集反应 , 浊度法测定
血小板 5 min最大聚集率 , 血小板聚集测定 2 h内完成 , 计算
血小板聚集抑制百分率 ,计算公式如下:
聚集抑制率(%)=空白对照组聚集率 -实验组聚集率空白对照组聚集率 ×100 %。
1.2.3　对胶原蛋白-肾上腺素诱导小鼠血栓形成的影响　胶
原蛋白-肾上腺素混合溶液配制:称取胶原蛋白 25 mg,浸泡于
10 ml生理盐水中 2 h以上 , 匀浆后 , 4 000 r· min-1离心 10
min,取上清液;另取 1g· L-1的肾上腺素 0.9 ml,加入上清液
中 , 加生理盐水至 20 ml,制得 1.25 g· L-1的胶原蛋白-45 mg
· L-1肾上腺素溶液。为了保证诱导剂能引起大多数正常小
鼠血栓性偏瘫 , 并且所能引起的血栓性偏瘫在药物的保护范
围内 , 用生理盐水稀释胶原蛋白-肾上腺素溶液 , 至胶原蛋白-
肾上腺素溶液与生理盐水比例分别为 1∶1, 2∶1。昆明种小鼠
9只 ,随机分为 3组 , 尾静脉注入胶原蛋白-肾上腺素混合溶液
0.1 ml/10 g,注射后小鼠立即产生肢体偏瘫的脑血栓症状。
观察 5 min内偏瘫小鼠的死亡数和 15 min内小鼠偏瘫的恢复
数。选择确定稀释倍数为 1.5∶1, 即诱导剂为 0.75 g· L-1的
胶原蛋白-27 mg· L-1肾上腺素溶液。
　　昆明种小鼠随机分为 5组 , 每组 8只 , 正常对照组;阿司
匹林组(50 mg· kg-1);刺松藻多糖低剂量组(12.5 mg·
kg-1);刺松藻多糖中剂量组(25mg· kg-1);刺松藻多糖高剂
量组(50 mg· kg-1)。除正常对照组灌胃蒸馏水外 , 其余各组
均按 0.1 ml/10 g体积灌胃相应的药液。每天 1次 ,连续 7 d。
末次给药前禁食不禁水 12 h, 末次给药 1 h后 , 尾静脉注入
0.75 g· L-1的胶原蛋白-27 mg· L-1肾上腺素混合溶液 0.1
ml/10 g, 注射后小鼠立即产生肢体偏瘫的脑血栓症状。观察
5min内小鼠的死亡数和 15 min内小鼠偏瘫的恢复数 ,计算
药物对小鼠血栓性偏瘫的保护率。
1.2.4　统计学分析　采用 SPSS10.0 统计软件 , 组间采用 t
检验 , 判断均数差异的显著性。
2　结果
2.1　刺松藻多糖对新西兰兔血浆体外凝血作用的影响　刺
松藻多糖四个剂量组均显著延长新西兰兔血浆活化部分凝血
活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT), 与
对照组比较差异有显著性(P<0.01, P<0.001), 表明刺松藻
多糖同时影响内源性和外源性凝血系统 , 有抗凝血作用(表
1)。
表 1　刺松藻多糖对新西兰兔 APTT、PT和 TT的影响(x±s, n=6)
组别 剂量 /μg· L-1 APTT/s PT/s TT/s
生理盐水 20.33±0.34 7.75±0.18 11.48±0.22
CFPS 125 75.88±1.48＊＊ 7.83±0.11＊ 57.0 ±0.43＊＊
250 116.5 ± 3.20＊＊＊ 7.83±0.16＊ 135.75±2.17＊＊＊
500 222.0 ±21.11＊＊＊ 8.08±0.25＊ 183.0 ± 8.28＊＊＊
1000 241.0＊＊＊ 9.60±0.1＊＊ 226.25±25.55＊＊＊
　　注:与生理盐水比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01, ＊＊＊P<0.001
2.2　刺松藻多糖对新西兰兔血小板聚集的影响　实验结果
见表 2。刺松藻多糖 2、4和 8 g· L-1三个浓度 , 对 ADP诱导
的家兔 5 min时血小板聚集有显著抑制作用 , 与空白对照组
比较差异显著(＊＊P<0.01), 呈浓度依赖关系。表明刺松藻
多糖具有显著抑制 ADP诱导的家兔血小板聚集作用。
表 2　刺松藻多糖对 ADP诱导的血小板 5min聚集率的影响
(x±s, n=8)
组别 剂量 /g· L-1 聚集百分率 /% 聚集抑制率 /%
生理盐水 77.32±5.53 —
CFPS 2 44.84±2.83＊＊ 42.01
4 37.55±5.15＊＊ 51.44
8 21.92±1.62＊＊ 71.65
LAS 8.33 40.64±2.36＊＊ 47.44
　　注:与生理盐水组比＊＊P<0.01
2.3　刺松藻多糖对胶原蛋白-肾上腺素诱导小鼠血栓形成的
影响　经口服给予刺松藻多糖 12.5、 25、50 mg· kg-1 , 静脉注
射胶原蛋白-肾上腺素溶液诱导小鼠偏瘫血栓形成所致的动
物死亡数 , 与正常对照组相比明显降低 , 偏瘫恢复率与正常对
照组相比明显增加;各给药组比较有显著性差异(表 3)。
3　讨论
凝血是机体重要的生理过程 ,由内源性途径 、外源性途径
表 3　刺松藻多糖对胶原蛋白-肾上腺素诱导小鼠血栓形成的影响
(x±s, n=8)
组别 存活数 /只 存活率 /% 恢复数 /只 恢复率 /%
生理盐水
CFPS12.5mg· kg-1
CFPS25.0mg· kg-1
CFPS50.0mg· kg-1
阿司匹林
0　
3　
5　
8　
4　
　0
37.5
62.5＊＊
100.0＊＊
50.0＊＊
0
3
5
8
4
　 0
37.5
62.5＊＊
100.0＊＊
50.0＊＊
　　注:与生理盐水组比＊＊P<0.01
及共同途径组成 , 通过多种酶原被相继激活而得到加强和放
大的一种级联反应。目前国内外临床使用的主要抗凝血药物
是普通肝素 、低分子肝素 、华法林等 , 这些药物具有可致血小
板减少 、出血等副作用 , 并且起效较慢。 因此 , 寻找抗凝血作
用适度 、起效快 、副作用小的天然药物是抗凝药物研究的热点
之一。本研究中 , 刺松藻多糖能明显延长家兔 APTT、PT、TT
和 CT,表明刺松藻多糖对内源性和外源性凝血途径均有显著
的抑制作用 , 提示可能与其抑制内 、外源凝血途径相关的某些
凝血因子的活性有关。
血小板的活化 、黏附 、聚集以及血小板因子释放与血栓形
成 、动脉粥样硬化及并发症密切相关 [ 4] 。 血小板聚集是血栓
形成的基本条件 , 需有诱导剂 ,如 ADP、肾上腺素 、凝血酶 、胶
·805·安 徽 医 药　AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal　2011 Jul;15(7)
注射用帕米膦酸二钠的处方与工艺研究
仇锦春 1 ,胡雄林 2 ,廖清船1 ,徐康康 1
(1.南京医科大学附属南京儿童医院临床药学室 , 江苏 南京　210008;
2.南京苏中药物研究有限公司 ,江苏 南京　210016)
摘要:目的　确定注射用帕米膦酸二钠的制备处方及工艺。方法　选择适宜赋形剂 , 进行处方筛选 , 对冻干工艺进行考察。结
果　以甘露醇为赋形剂 , 经过 22 h的冻干过程 ,制得成形性好 , 质量可靠的注射用帕米膦酸二钠。结论　注射用帕米膦酸二钠
处方工艺可行。
关键词:注射用帕米膦酸二钠;处方;工艺
Formulationandpreparationofpamidronate
disodiumforinjection
QIUJin-chun1 , HUXiong-lin2 , LIAOQing-chuan1 , XUKang-kang1
(1.NanjingChildren sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity, Nanjing　210008, China;
2.NanjingSuzhongPharmaceuticalResearchCo., Ltd, Nanjing　210016, China)
Abstract:Aim　Tostudythereasonalformulationandpreparationtechniqueofpamidronatedisodiumforinjection.Methods　Thefor-
mulationofpamidronatedisodiumforinjectionwasoptimizedbychoiceofsuitablevehicle.Thepreparationtechniquewassubsequently
observed.Results　Mannitolasvehicle, pamidronatedisodiumforinjectionwithgoodshapeandqualitycanbemadethrough22 hours
lyophilization.Conclusion　Boththeformulationandpreparationtechniqueofpamidronatedisodiumforinjectionwerefeasible.
Keywords:pamidronatedisodiumforinjection;formulation;preparation
通讯作者:徐康康 ,男 ,主任药师 ,研究方向:医院药学 , E-mail:kangkang4425@126.com
原等 [ 5] 。本研究表明 , 刺松藻多糖对 ADP诱导的血小板 5
min聚集率有显著抑制作用 , 存在一定的量效关系。为进一
步验证其体内抗血栓作用 , 本研究采用胶原蛋白-肾上腺素为
诱导剂 ,观察了刺松藻多糖对该诱导剂诱发小鼠血栓性偏瘫
或死亡的保护作用 , 结果显示 , 不同剂量的刺松藻多糖对胶
原-肾上腺素诱导的小鼠血栓性偏瘫或死亡均有保护作用。
随着人们对多糖抗凝血 、抗血栓 、降血脂及其他生理活性
研究是不断深入 , 多糖的研究已成为医学 、生物学 、化学界共
同关注的热点 [ 6 ～8] 。目前国内研究的抗凝血多糖 , 多来源于
动物 、褐藻 、真菌。而硫酸多糖因其具有强阴离子性 , 一般都
能表现出不同程度的抗凝血活性 [ 9, 10] , 本实验中采用的刺松
藻多糖 , 是一种硫酸化多糖;目前关于绿藻中多糖类物质的抗
凝血活性所见报道不多 , 仅见有学者报道从长松藻(Codium
cylindricum)分离出的半乳聚糖硫酸酯具有抗凝血活性 , 而我
们提取的刺松藻多糖 ,其抗凝血活性非常明显 , 可作为抗凝血
物质的良好来源。当然 ,要完全了解刺松藻多糖的抗凝作用
机制及其它药理作用 , 尚需要作进一步的研究。但其抗凝血 、
抗血栓方面的药理机制尚待进一步从分子水平加以深化 , 以
便为进一步明确多糖的构效关系 , 进而筛选 “活性结构”多糖
或对多糖进行化学改性 ,从而开发出活性更高 、毒副作用更小
的新药奠定基础。
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