全 文 ：药物分析 ·论著·
高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量
程利娟，郭 琪，雷 虹，杨 莹，申 睿，慕 磊，王彦宗
［基金项目］ 军队中医药科研专项课题(10ZYZ204)
［作者单位］ 075000 河北 张家口，河北北方学院药理教研
室(程利娟);100071 北京，北京军区联勤部药品仪器检验所
(程利娟、郭琪、雷虹、杨莹、申睿、慕磊、王彦宗)
［通讯作者］ 王彦宗，E-mail:13701081036@ 139． com
［摘要］ 目的 采用高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量。方法 色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱
(4． 6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相:乙腈 － 0． 01 mol /L磷酸二氢钾溶液(6∶ 94)，流速:1． 0 ml /min，检测波长:260 nm，
柱温:30℃，进样量:10 μl。结果 腺苷在 2． 696 ～ 67． 40 g /ml范围内与其峰面积呈现良好的线性关系(r = 0． 999 9)，
平均回收率为 99． 89%，相对标准偏差为 1． 71%(n = 6)。结论 该方法简便准确，灵敏度高，重复性好，为控制牛樟芝
的质量提供了科学依据。
［关键词］ 牛樟芝;腺苷;色谱法，高效液相
［中国图书资料分类号］ Ｒ927． 11 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-140X(2014)05-0076-03
［DOI］ 10． 3969 / j． issn． 2095-140X． 2014． 05． 021
High Performance Liquid Chromatography in Determination of Adenosine Content in Antrodia Camphorata
CHENG Li-juan1，2，GUO Qi2，LEI Hong2，YANG Ying2，SHEN Ｒui2，MU Lei2，WANG Yan-zong2(1． Department of
Pharmacology，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China;2． Institute for Drug and Instrument Con-
trol，Combined Logistics Department of Beijing Military Area Command，Beijing 100071，China)
［Abstract］ Objective To detect the Adenosine content in Antrodia Camphorata using high performance liquid
chromatography (HPLC)． Methods The chromatographic column was Agilent Zorbax SB － C18 column (4． 6 mm ×
250 mm，5 μm);the mobile phase was acetonitrile － 0． 01 mol·L －1 KH2PO4 solution (6 ∶ 94);the flow rate was
1． 0 ml /min －1;the detection wavelength was 260 nm;the column temperature was set at 30 ℃;the injection volume was
10 μl． Ｒesults A good linear relationship between the peak area and Adenosine concentration was observed within the
range of 2． 696 － 67． 40 mg /ml(r = 0． 9999)． The average recovery was 99． 89% with 1． 71% of relative standard devia-
tion (n = 6)． Conclusion This method is accurate and has good sensitivity and reproducibility，and can provide scien-
tific basis for controlling the quality of Antrodia camphorata．
［Key words］ Antrodia camphorata;Adenosine;Chromatography，high performance liquid
牛樟芝(Antrodiacamphorata)又名牛樟菇、樟
菇、樟芝、阴阳对口菇、灵芝之王、血灵芝、棺花，为台
湾地区特有真菌品种，具有抗肿瘤、增加免疫能力、
抗细菌、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降血糖、降胆固
醇、抑制血小板凝集及保护肝脏等生理活性，而且不
良反应很少［1-2］。现代科学研究表明，牛樟芝含有
三萜类化合物、多糖、腺苷、超氧歧化酶、有机锗、蛋
白质(含免疫蛋白)、维生素、烟碱酸、麦角固醇等多
种有效成分［3］。腺苷作为牛樟芝重要活性成分之
一，能够降低体外循环后肺缺血 －再灌注损伤，有效
改善右心功能，对再灌注心脏具有保护作用，同时提
高血液供氧能力和加速血液微循环，提高血液对心
脑的供氧能力［4-8］，是牛樟芝发挥药理作用的主要
成分之一，但目前尚未见以腺苷作为牛樟芝内在质
量评价指标的相关报道。为了进一步严格控制中药
材的质量，确保临床用药的有效性，本实验采用高效
液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量，以期为牛樟
芝的质量控制提供参考。
1 仪器与试药
Agilent 1100 型高效液相色谱仪(包括四元泵，
VWD检测器，自动进样器，ChemStation 化学工作
站);Mettler-Toledo AX205 电子天平(梅特勒 －托利
多仪器有限公司);KQ-300VDB 型双频数控超声波
清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
腺苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:
110879-200202)，牛樟芝药材(宏潮生物健康科技推
广中心，批号:20121025，20121208，20130125)，甲
醇、磷酸二氢钾、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试
剂均为分析纯。
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2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18 色谱柱
(4． 6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相:乙腈 －
0． 01 mol /L磷酸二氢钾溶液 (6 ∶ 94)，流速:
1． 0 ml /min，检测波长:260 nm，柱温:30℃，进样量:
10 μl。
2. 2 系统适应性试验 在上述色谱条件下，腺苷色
谱峰的理论塔板数 ＞ 10 000，分离度为 2． 95，拖尾因
子为 0． 97，色谱图见图 1。
0 2 4 6 8 10
250
200
150
100
50
0
A
1
0 2 4 6 8 10
250
200
150
100
50
0
1
B
吸
光
度（
m
AU
）
时间（min）
时间（min）
吸
光
度（
m
AU
）
图 1 腺苷(A)和牛樟芝样品(B)的高效液相色谱图
2. 3 溶液的制备
2. 3. 1 对照品溶液制备:精密称取腺苷对照品
13. 48 mg，加 15%甲醇定容至 100 ml，制成浓度为
134. 8 μg /ml的对照品储备液，置 4 C冰箱保存。
2. 3. 2 供试品溶液制备:取牛樟芝粉末(过三号
筛)1. 0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入
15%甲醇 25 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率
300 W，频率 45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用
15%甲醇补足减失的重量，摇匀，0. 45 μm微孔滤膜
滤过，取续滤液，即得。
2. 4 线性关系考察 精密量取腺苷对照品储备液
0. 2、1. 0、2. 0、3. 0、5. 0 ml 分别置于 10 ml 量瓶中，
加 15% 甲醇定容，摇匀，制成浓度分别为 2. 696、
13. 48、26. 96、40. 44、67. 40 μg /ml的标准品溶液，按
“2. 1”项下色谱条件测定峰面积，以浓度为横坐标
(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归
方程:Y =32. 499X +0. 1498(r = 0. 999 9，n = 6)，表
明腺苷在 2. 696 ～ 67. 40 μg /ml 范围内与其峰面积
呈良好的线性关系。
2. 5 精密度试验 精密吸取浓度为 40. 44 μg /ml
的对照品溶液，按“2. 1”项下色谱条件连续进样 6
次，峰面积的相对标准偏差(ＲSD)为 0. 58%，表明
仪器的精密度良好。
2. 6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在 0、
2、4、8、12、24 h按“2. 1”项下色谱条件测定，记录峰
面积，结果腺苷峰面积的 ＲSD 为 0. 99%(n = 6)，表
明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。
2. 7 重复性试验 取同一批样品 6 份，按“2. 3. 2”
项下方法制成供试品溶液，进样测定，结果样品中腺
苷平均含量为 1. 18 mg /g，ＲSD为 0. 93%，表明该方
法重复性良好。
2. 8 加样回收率测定 精密称取 6 份已知含量
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(1. 18 mg /g)的牛樟芝样品(批号 20121025)0. 1 g，
分别精密加入 40. 44 μg /ml 的腺苷对照品溶液
3. 0 ml，按“2. 3. 2”项下方法制成供试品溶液，测定
腺苷含量，计算回收率，结果见表 1。
表 1 牛樟芝样品腺苷含量及回收率测定结果(n = 6)
取样量
(g)
样品含量
(μg)
加入量
(μg)
实测量
(μg)
回收率
(%)
平均
回收率(%)
相对标准
偏差(%)
0． 1032 121． 78 121． 32 242． 67 99． 65
0． 1047 123． 55 121． 32 247． 67 102． 31
0． 1056 124． 61 121． 32 245． 77 99． 87
0． 1011 119． 30 121． 32 242． 23 101． 33 99． 89 1． 71
0． 1023 120． 71 121． 32 240． 04 98． 36
0． 1009 119． 06 121． 32 237． 75 97． 83
2. 9 样品含量测定 按“2． 3． 2”项下方法制备供
试品溶液，按“2． 1”项下色谱条件测定 3 批样品的
含量，每份样品平行测定 3 份，结果腺苷的含量分别
为 1． 18、1． 27、1． 21 mg /g，ＲSD 分别为 0． 97%、
1. 27%、1． 14%。
3 讨论
3. 1 流动相的选择 采用高效液相色谱法测定腺
苷含量的报道较多，以甲醇 －磷酸二氢钾体系较多
见，但是分析时间较长［9-18］。参考其他文献，发现乙
腈 － 磷酸二氢钾体系也常用于腺苷含量的测
定［19-23］。研究比较发现，乙腈 －磷酸二氢钾溶液作
为流动相体系的基线较甲醇 －磷酸二氢钾体系稳
定，通过比较乙腈 － 0． 01 mol /L 磷酸二氢钾溶液、
乙腈 － 0． 02 mol /L 磷酸二氢钾溶液、乙腈 －
0． 05 mol /L磷酸二氢钾溶液等多种流动相体系，发
现乙腈 － 0． 01 mol /L磷酸二氢钾溶液效果最好，而
高比例磷酸盐的存在可能对泵和色谱柱造成
损害［24］。
3. 2 色谱柱的选择 通过对 Agilent Zorbax SB-C18，
Agilent Zorbax SB-C8，Agilent Eclipse XDB-C18多个不
同填料色谱柱用于腺苷的分离效果进行比较，发现
腺苷在 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱的分离效果最
好，故选择 Agilent Zorbax SB-C18开展试验。
3. 3 提取溶剂的选择 通过比较甲醇、45%甲醇、
15%甲醇、水 4 种不同提取溶剂对试验的影响发现，
提取溶剂为 15%甲醇时，腺苷的提取量较高，色谱
图中杂质峰的影响较小，可能是由于牛樟芝中含有
大量多糖成分，在使用甲醇处理时多糖和其他大分
子物质发生沉淀，情况得到改善，因此，选择 15%甲
醇为提取溶剂。
人工栽培牛樟芝药用价值较高，但价格昂贵，因
此通过测定有效成分的含量，对培养条件、培养方式
进行优化显得尤为重要，可进一步保证和提高牛樟
芝产品的质量。
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