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高效液相色谱法测定不同产地棘托竹荪中 4 个核苷含量
钟倩霞1，吕广萍2，彭亮2，3，赵静2，李绍平2
(1．无限极(中国)有限公司，广州 510030;2．澳门大学 中华医药研究所，澳门;3．江西科技师范大学药学院，南昌 330013)
摘要 目的:运用高效液相色谱法分析棘托竹荪中尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的含量。方法:采用 Grace Prevail Select C18
(4. 6 mm × 150 mm，3 μm)分析柱，以水(A)－甲醇(B)为流动相二元梯度洗脱(0 ～ 6. 0 min，0→5% B;6. 0 ～ 15. 0 min，5% B→
25%B;15. 0 ～ 20. 0 min，25%B→100%B)，流速 1 mL·min －1，检测波长 254 nm，柱温 25 ℃，进样量 10 μL。结果:尿苷、肌苷、
鸟苷和腺苷浓度分别在 2. 0 ～ 181. 0 !g·mL －1(r = 1. 000)、1. 5 ～ 190. 0 !g·mL －1(r = 0. 9999)、0. 8 ～ 126. 4 !g·mL －1(r =
0. 9999)和 1. 0 ～ 171. 2 !g·mL －1(r = 1. 000)范围内线性关系良好，加样回收率(n = 6)分别为 100. 7%(ＲSD = 3. 4%)、98. 5%
(ＲSD = 4. 2%)、99. 5%(ＲSD = 3. 6%)和 99. 1%(ＲSD = 3. 8%);采自不同产地的棘托竹荪核苷含量差别较大，四川青川木鱼
产的竹荪中尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷 4 个核苷类成分含量是所有测试样品中最高的，含量分别为 0. 77、0. 06、1. 19 和 1. 60 mg·
g －1。结论:本法能够快速、简便地测定棘托竹荪中主要核苷的含量，为其质量控制提供保证。
关键词:高效液相色谱;棘托竹荪;核苷;尿苷;肌苷;鸟苷;腺苷;菌类含量测定;质量控制
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2014)03 － 0411 － 04
HPLC determination of 4 nucleosides in Dictyophora
echinovolvata from different places of production
ZHONG Qian － xia1，L Guang － ping2，PENG Liang2，3，ZHAO Jing2，LI Shao － ping2
(1． Infinitus (China)Company Limited，Guangzhou，Guangdong，510030，China;
2． Institute of Chinese Medical Sciences，University of Macau，Macao，China;
3． The School of Pharmacy，Jiangxi Science ＆ Technology Normal University，Nanchang 330013，China)
Abstract Objective:To determine nucleosides (uridine，inosine，guanosine and adenosine)in Dictyophora echi-
novolvata by HPLC － DAD． Methods:The Grace Prevail Select C18column (4. 6 mm ×150 mm，3 μm)was used
for simultaneous determination of uridine，inosine，guanosine and adenosine in D． echinovolvata． Gradient elution
with water (A)and methanol (B)was performed as follows:0 － 6. 0 min，0→5%B;6. 0 － 15. 0 min，5%B→25%
B;15. 0 － 20. 0 min，25%B→100%B． The flow rate was 1 mL·min －1 and the injection volume was 10 μL． The
system operated at 25 ℃ and the 4 nucleosides were monitored and quantified at a wavelength of 254 nm． Ｒesults:
Uridine，inosine，guanosine and adenosine showed good linearity in the ranges of 2. 0 － 181. 0 !g·mL －1(r =
1. 000)，1. 5 － 190. 0 !g·mL －1(r = 0. 9999)，0. 8 － 126. 4 !g·mL －1(r = 0. 9999)and 1. 0 － 171. 2 !g·mL －1(r
= 1. 000)，and the average recoveries (n = 6)were 100. 7% (ＲSD = 3. 4%) ，98. 5% (ＲSD = 4. 2%) ，99. 5%
(ＲSD =3. 6%)and 99. 1% (ＲSD =3. 8%) ，respectively． The contents of investigated nucleosides in D． echino-
volvata from different production areas were different． The contents of the four nucleosides (uridine，inosine，
guanosine and adenosine)in D． echinovolvata from Qingchuan Muyu of Sichuan Province were the highest among
the 5 samples，their contents were 0. 77，0. 06，1. 19 and 1. 60 mg·g －1，respectively． Conclusion:The HPLC
method established in this study is a rapid and simple method for the simultaneous determination of nucleosides in
D． echinovolvata and is helpful to its quality control．
Key words:Dictyophora echinovolvata;high performance liquid chromatography;nucleosides;uridine;inosine;
guanosine;adenosine;fungus assay;quality control
—114—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(3)
竹荪是一种名贵的食用菌类，目前记载的共有
12 个种，其中已实现人工栽培的有长裙竹荪［Dic-
tyophora indusiata (Vent． Pers)Fisch．］、短裙竹荪
［D． duplicata (Bosc．)Fisch．］、红托竹荪［D． rubro-
volvata M． Zang，D． G． Ji ＆ X． X． Liu］和棘托竹荪
［D． echinoyolyata Zang，Zheng et Hu］［1］。竹荪具有
滋补强壮、益气补脑等功效，主要含有多糖、氨基酸、
粗脂肪和挥发性成分等［2］。核苷是生物细胞维持
生命的重要物质，是半必需营养素—核苷酸的重
要组成部分［3］，也被认为是补益中药共有的物质
基础［4 － 6］。目前，对竹荪中的核苷类成分的分析
还未见文献报道。本文采用高效液相色谱法同
时检测了竹荪中的尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷，并对
不同来源的 5 个竹荪中核苷类成分的含量进行
了比较。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱系统，包括
自动进样器、在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱和
DAD检测器。平行样品蒸发浓缩合成反应器(BU-
CHI，瑞士)。
1. 2 试剂 对照品尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷均购
自 Sigma 公司(纯度≥ 99%);甲醇(色谱纯，
Merk，德国)和水(Millipore 超纯水系统，美国);
竹荪子实体分别采自四川青川白砾(四川青川
1)、板桥(四川青川 2)、木鱼(四川青川 3)及不
明乡镇(四川青川 4)和福建莆田，经鉴定为鬼笔
科竹荪属棘托竹荪 Dictyophora echinovolvata Zang，
Zheng et Hu。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 采用 Grace Prevail Select C18分析
柱(4. 6 mm ×150 mm，3 μm)，以水(A)－甲醇(B)
为流动相二元梯度洗脱(0 ～ 6. 0 min，0→5% B;6. 0
～ 15. 0 min，5%B→25%B;15. 0 ～ 20. 0 min，为 25%
B→100% B，流速 1 mL·min －1，检测波长 254 nm，
柱温 25 ℃;进样量 10 μL。
2. 2 对照品储备液的制备 准确称取对照品尿苷
9. 70 mg、肌苷 9. 56 mg、鸟苷 6. 35 mg 和腺苷 9. 36
mg，分别置于 10 mL 量瓶中，用水溶解并稀释至刻
度，摇匀，制得。
2. 3 供试品溶液制备 棘托竹荪于 40 ℃干燥 8 h，
打粉，过 60 目筛。精密称取药材粉末 0. 5 g 于 60
mL平行提取管中，加入水 25 mL，称定质量。涡
旋使 药 材 与 水 充 分 混 匀，置 平 行 反 应 器 中
100 ℃，150 r·min － 1提取 30 min，补足失重，提
取液 13000 r·min － 1离心 5 min，取上清过 0. 45
μm 滤膜，即得。
2. 4 线性关系考察 分别准确量取尿苷、肌苷、鸟
苷和腺苷的对照品储备液各 0. 5 mL，混合制成混合
对照品溶液，取混合对照品溶液 1. 0 mL，加水依次
稀释，制成 6 个浓度的系列混合对照品溶液，以
0. 45 μm微孔滤膜过滤，进样分析。以各对照品峰
面积 Y对浓度 X(!g·mL －1)进行线性回归，结果见
表 1。测定最低检测限(LOD，S /N = 3)和最低定量
限(LOQ，S /N = 10) ，结果见表 1。
表 1 尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的回归数据及检测限和定量限
Tab 1 Ｒegression data，limit of detection (LOD)and limit of quantification (LOQ)
of uridine，inosine，guanosine and adenosine
分析物
(analyte)
线性范围
(linear rang)/!g·mL －1
回归方程
(regression equation)
r
最低检测限(LOD)/
!g·mL －1
最低定量限(LOQ)/
!g·mL －1
尿苷(uridine) 2. 0 － 181. 0 Y =15. 36X －0. 48 1. 000 0. 38 1. 05
肌苷(inosine) 1. 5 － 190. 0 Y =8. 68X －0. 92 0. 9999 0. 25 0. 82
鸟苷(guanosine) 0. 8 － 126. 4 Y =11. 89X －0. 78 0. 9999 0. 18 0. 55
腺苷(adenosine) 1. 0 － 171. 2 Y =15. 55X －0. 65 1. 000 0. 21 0. 78
2. 5 精密度考察 取同一份混合对照品溶液，同 1
d连续进样 6 次，计算各成分峰面积的 ＲSD，考察日
内精密度;每天进样 2 次，连续测定 3 d，计算各成分
峰面积的 ＲSD，考察日间精密度。结果尿苷、肌苷、
鸟苷和腺苷的日内 ＲSD(n = 6)分别为 0. 48%、
0. 89%、0. 46%和 0. 35%，日间 ＲSD(n = 6)分别为
2. 8%、1. 0%、1. 8%和 2. 0%。
2. 6 重复性考察 精密称取同一竹荪样品粉末
0. 40、0. 50、0. 60 g各 3 份，按“2. 3”项下方法制备供
试品溶液，分别进样测定，结果含量的 ＲSD 分别小
于 3. 4%、1. 5%和 2. 1%。
2. 7 加样回收率考察 称取已知含量的竹荪粉末
—214— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(3)
6 份，每份约 0. 25 g，精密称定，按各成分在原药材
中的含有量分别精密加入等量的对照品，按“2. 3”
项下方法制备供试溶液，进样测定，计算加样回收
率。结果尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的平均加样回收率
(n = 6)分别为 100. 7% (ＲSD = 3. 4%)、98. 5%
(ＲSD = 4. 2%)、99. 5% (ＲSD = 3. 6%)和 99. 1%
(ＲSD =3. 8%)。
2. 8 不同来源竹荪中核苷类成分含量测定 按
照“2. 3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以
外标法计算不同来源的竹荪中的尿苷、肌苷、鸟
苷和腺苷含量，HPLC 谱图见图 1，含量测定结果
见表 2。
图 1 混合核苷对照品(A)及四川青川 3 棘托竹荪样品(B)的 HPLC谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)and extract of D． echinovolvata from Qingchuan Muyu of Sichuan
1．尿苷(uridine) 2．肌苷(inosine) 3．鸟苷(guanosine) 4．腺苷(adenosine)
表 2 5 个产地竹荪中尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的含量(mg·g －1)
Tab 2 Contents (mg·g －1)of uridine，inosine，guanosine and adenosine in D． echinovolvata
序号
(No．)
产地
(growing area)
尿苷
(uridine)
肌苷
(inosine)
鸟苷
(guanosine)
腺苷
(adenosine)
1 四川青川 1(Qingchuan 1，Sichuan) 0. 42 低于定量限(below the limit of quantification) 0. 76 1. 04
2 四川青川 2(Qingchuan 2，Sichuan) 0. 54 低于定量限(below the limit of quantification) 0. 96 1. 31
3 四川青川 3(Qingchuan 3，Sichuan) 0. 77 0. 06 1. 19 1. 60
4 四川青川 4(Qingchuan 4，Sichuan) 0. 41 低于定量限(below the limit of quantification) 0. 55 0. 84
5 福建莆田(Putian，Fujian) 0. 53 低于定量限(below the limit of quantification) 0. 71 1. 16
3 讨论
3. 1 提取方法的选择 由于竹荪在日常生活中
多以熬汤的方式食用，且核苷类成分水溶性良
好，故本实验选用水加热回流的提取方式。使用
平行反应器可同时对多个样品进行提取，最大程
度地保证了提取条件的一致，可有效降低由于提
取条件差异带来的实验误差。另外，对样品提取
涉及的参数如粉末粗细、提取时间、溶剂用量、转
动速度等均进行了优化，确定了本文的供试品溶
液制备方法。
3. 2 色谱条件的优化 核苷类成分是极性较大的
碱性化合物，用反相 HPLC色谱进行分离时，由于碱
性化合物与固定相硅醇基的相互作用，常会出现色
谱峰拖尾的问题。本实验首先选择可以用水做流动
相的 Zorbax SB － Aq 分析柱进行色谱分离，考察了
甲醇 －水、甲醇 －甲酸水溶液、甲醇 －三乙胺水溶液
和甲醇 －磷酸盐缓冲系统 4 种流动相系统的分离效
果。实验结果表明，虽然三乙胺对核苷峰形有较明
显的改善作用，但上述 4 种流动相系统分离得到的
色谱峰均有不同程度的拖尾现象。在此基础上，本
实验又比较了不同型号的色谱柱对核苷类成分的分
离效果，包括 Agilent SB － C18、Agilent Bonus － ＲP、
Agilent Eclips XDB C18和 Grace Prevail Select C18。
结果显示，Grace Prevail Select C18在甲醇 －水体系
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下即可对尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷 4 个核苷类成分进
行良好的分离，峰形也未见明显拖尾，且该型号的色
谱柱在高水相流动相下有良好的柱寿命及稳定性，
适合核苷类成分的分离，各成分在测定范围内线性
关系良好。
3. 3 不同产地竹荪中核苷含量的差异 从表 2 可
以看出，不同产地的棘托竹荪中尿苷、肌苷、鸟苷
和腺苷 4 个核苷的含量均存在较大差异，其中肌
苷的含量在所有竹荪样品中均较低，除了四川青
川木鱼产的外，其他 5 个竹荪样品中肌苷含量均
低于定量限。不同产地竹荪中核苷类成分的含
量差异与产地或采收时间的关系，值得进一步深
入研究。
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(本文于 2013 年 11 月 15 日收到)
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