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白黎芦醇体外抗氧化活性和对细胞 DNA
损伤防护作用的实验研究＊
路萍 ,赖炳森 ,李植峰 ,孙树秦 ,陈镇童
(解放军北京军医学院 ,北京 100071)
摘　要:目的:观察白黎芦醇的体外抗氧化活性和对DNA损伤的防护作用。方法:采用超微弱化学发光
法测定白黎芦醇对氧自由基的清除能力;用比色法检测对人红细胞溶血和兔肝匀浆MDA生成的影响;
采用单细胞凝胶电泳法检测对淋巴细胞 DNA 损伤的影响 。结果:白黎芦醇可明显抑制本底的发光强
度;对 H2O2 诱导的红细胞溶血和DNA损伤有明显的抑制作用;且能抑制兔肝匀浆MDA 的生成 ,抑制率
为17.28%。结论:白黎芦醇具有较强的氧自由基清除能力和防护 DNA 损伤的作用 ,是天然的抗氧化
剂 ,具有很大的开发应用价值 。
关键词:白黎芦醇;DNA损伤;抗氧化;实验研究
中图分类号:R285.6　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2004)01-0050-02
收稿日期:2003-08-30
基金项目:全军医药卫生科研基金课题(01MA222)
作者简介:路萍(1960-),女 ,副教授 ,主要从事生物化学研究及教学工
作。
　　白黎芦醇(resveratrol ,Res)是葡萄皮中提取的活性
有效成分 ,据报道它对心血管系统具有十分明显的药
理作用 ,其作用与它的抗氧化特性有关[ 1] 。笔者用单
细胞凝胶电泳法 、溶血试验 、化学发光法 、丙二醛法分
别检测了白黎芦醇的体外抗氧化活性 ,为该药进一步
的开发提供依据 。
1　材料与方法
1.1　试剂和仪器
从葡萄皮中用有机溶剂法提取白黎芦醇。琼脂
糖 、低熔点琼脂糖为 Sigma公司产品;丙二醛(MDA)测
定试剂盒为南京建成生物工程公司产品;其余试剂均
为分析纯 。
OLMPUS BX-60 型荧光显微镜:日本 OLMPUS 公
司;FT-632型生物-化学光度计:北京市核仪器厂 。
1.2　方法
1.2.1　超微弱化学发光法检测白黎芦醇对氧自由基
的清除能力[ 2] 　碱性条件下二甲基亚砜自氧化产生氧
自由基使鲁米诺发光 , 加入不同浓度的白黎芦醇
(0.625ug.ml-1 、1.25ug.ml-1 、2.5ug.ml-1 、5ug.ml-1、
l0ug.ml-1 、20ug.ml-1)检测其发光强度。通过计算对
本底发光强度抑制率 ,观察白黎芦醇对氧自由基的清
除能力。
抑制本底发光率 (%)=本底管发光值-白黎芦醇管发光值本底管发光值 ×
100%
1.2.2　H2O2诱导人红细胞溶血试验观察白黎芦醇对
人红细胞氧化溶血的影响[ 3] 　分离人红细胞 ,生理盐
水洗涤3次后制成0.5%红细胞悬液 ,在每管 0.5ml的
红细胞悬液中加入不同浓度的白黎芦醇(0.5μg.ml-1、
1.0μg.ml-1 、2.0μg.ml-1 、3.0μg.ml-1 、4.0μg.ml-1)和
维生素 E(0.5μg.ml-1、4.0μg.ml-1),生理盐水补充至
总体积为 1ml ,充分混匀后 37℃水浴 10min。取出后加
入100mmol.L-1H2O2 ,混匀 ,37℃振荡温浴 1h。后用生
理盐水稀释 6 倍 , 3000r.min-1离心 5min , 取上清于
415nm比色测定 ,计算溶血率及抑制率。
溶血率(%)=白黎芦醇组吸光度值
H2O2 组吸光度值 ×100%
·50· ACMP.February , 2004 , Vol.32 , No.1
抑制率(%)=H2O2 组吸光度值-白黎芦醇组吸光度值
H2O2 组吸光度值-正常组吸光度值 ×100%
1.2.3　单细胞凝胶电泳法检测白黎芦醇对H2O2诱导
的淋巴细胞 DNA 损伤的防护作用　按参考文献[ 4 ～ 5]
方法简述如下:分离人淋巴细胞 ,用 1640液制成淋巴
细胞悬液 2 ～ 4.0×106个.ml-1。在 0.5ml细胞悬液中
加入不同浓度的白黎芦醇(25ug.ml-1 、50ug.ml-1、
100ug.ml-1 、200ug.ml-1 、400ug.ml-1),用 1640液补足
体积至 1ml , 37℃作用 1h 后取出 ,加入 100umol.L-1
H2O2混匀 , 37℃作用 1h 后取出 ,离心弃上清 ,用 PBS
洗2次 ,终止反应。取80uL1%正常熔点琼脂糖凝胶铺
第一层凝胶 ,取 80ul含约 104 ～ 105 个细胞的 0.5%低
熔点琼脂糖凝胶铺第二层凝胶 。pH10 的裂解液(含
2.5mol.L-1氯化钠 、100mmol.L-1乙二醇四乙酸二钠 、
10mmol.L-1Tris ,临用前加 10%的二甲基亚砜 ,1%Tri-
ton-100)中裂解 1小时。在碱性电泳液(0.3mol.L-1
氢氧化钠 , 1mmol.L-1EDTA)中放置 40min 使 DNA 解
旋 ,300mA 电泳 1h。在 pH7.5 , 0.4mol.L-1的 Tris-
HCL 缓冲液中浸泡 3次 ,每次 5min。碘化吡啶5.0mg.
L-1染色 15min ,避光。以上操作均在 4℃下进行。在
荧光显微镜下测量总慧星长度(放大倍数为目镜 10
×,物镜 20×),计算 DNA的损伤程度和防护度 。
DNA的损伤程度(%)=
白黎芦醇组的平均总彗星长度-正常组的平均总慧星长度
白黎芦醇组的平均总慧星长度 ×100%
DNA损伤的防护度(%)=
H2O2 组的平均总慧星长度-白黎芦醇组的平均总慧星长度
H2O2 组的平均总慧星长度 ×100%
1.2.4　丙二醛法测定白黎芦醇对兔肝匀浆MDA的影
响[ 6] 　取正常家兔肝脏 ,制成肝匀浆 ,用冷生理盐水制
成10%的肝匀浆生理盐水液 。采用双缩脲法测定肝
匀浆中的蛋白含量 。肝匀浆 MDA的测定:取 10%新
鲜肝匀浆 1.5ml ,分别加入 5mg.ml-1白黎芦醇0.1ml 、
维生素E5mg.ml-10.1ml 、无水乙醇 0.1ml 、生理盐水0.
1ml ,37℃振荡温浴 1.5h ,按丙二醇测定试剂盒操作。
532nm处比色测定各管吸光度值 ,计算MDA值及抑制
率。
抑制率(%)=自氧化组 MDA 值-白黎芦醇组 MDA 值自氧化组MDA值 ×100%
2　结果与讨论
2.1　白黎芦醇对氧自由基的清除能力　测得本底发
光值(316.44±17.85)mv ,与本底管比较 ,随着白黎芦
醇的加入量增加 ,发光值逐渐降低。说明白黎芦醇具
有一定的氧自由基清除作用。且呈一定的量效关系
(表 1)。
表 1　白黎芦醇对氧自由基的清除作用( x±s , n=6)
组别 剂量(ug.ml-1) 发光值(mv) 抑制率(%)
本底组 316.44±17.85
白黎芦醇组 0.625 229.60±15.85＊＊＊ 27.44
1.25 177.57±11.36＊＊＊ 43.88
2.5 150.00±15.29＊＊＊ 52.60
5.0 122.17±10.65＊＊＊ 61.39
10 94.50±9.89＊＊＊ 70.14
20 53.67±3.56＊＊＊ 83.04
　　与本底组比较:＊＊＊P<0.0001
2.2　对人红细胞氧化性溶血的影响:H2O2 与红细胞
作用 ,血红蛋白受到氧化 ,红细胞膜脂质发生过氧化 ,
出现溶血现象。与H2O2组比较 ,白黎芦醇能明显抑制
H2O2诱导的人红细胞氧化溶血 ,使溶血率能够明显降
低 ,且呈量效关系(表 2),与相同剂量的维生素 E(0.5
ug.ml-1、4ug.ml-1)比较 ,对红细胞氧化性溶血有非常
明显的抑制作用(P <0.05 , P<0.001)。说明白黎芦
醇对 H2O2 氧化应激损伤有较明显的保护作用 。
表 2　白黎芦醇对H2O2诱导人红细胞氧化性溶血的影响( x±s , n=5)
组别 剂量(ug.ml-1) 吸光度(415nm) 溶血率(%) 抑制率(%)
正常组 0.032±0.012 4.81
H2O2组 0.665±0.020■■■ 100
白黎芦醇组 0.5 0.590±0.034＊ 88.72 11.85
1.0 0.521±0.003＊＊ 78.35 22.75
2.0 0.462±0.014＊＊ 69.47 32.07
3.0 0.382±0.025＊＊ 57.44 44.71
4.0 0.333±0.029＊＊ 50.08 52.45
维生素E 0.5 0.682±0.025
4.0 0.592±0.053＊ 90.38 9.95
　　与正常组比较:■■■P<0.0001;与 H2O2组比较:＊P<0.05　＊＊P<0.001
2.3　对淋巴细胞 DNA损伤的影响　H2O2 作为一种化
学性 DNA诱导剂 ,H2O2 能很容易地穿透细胞膜自由
进入细胞 ,在细胞核内的 H2O2 可转变成具有高活性氢
氧根(·OH),从而造成 DNA 链断裂 。本实验结果表明
正常组慧星长度平均为(7.42±0.98)um ,而被 H2O2诱
导损伤的氧化组的平均慧星长度为(36.432±3.17)
um.,加入不同剂量白黎芦醇后各组的慧星长度与
H2O2组相比均有不同程度的减小 ,说明白黎芦醇对
H2O2诱导的 DNA的损伤有一定的保护作用 ,且呈量
效关系(表 3)。
表 3　白黎芦醇对H2O2所致人淋巴细胞 DNA损伤的影响( x±s , n=100)
组别 剂量(ug.ml-1) 慧星长度(um) 损伤程度(%) 防护度(%)
正常组 7.42±0.98
H2O2组 36.43±3.17■■■ 78.98
白黎芦醇组 25 29.14±3.08＊＊ 74.54 20.01
50 27.84±3.18＊＊＊ 72.66 25.50
100 22.84±4.08＊＊＊ 67.51 37.30
200 18.91±4.71＊＊＊ 60.76 48.09
400 15.74±3.49＊＊＊ 52.86 56.79
　　与正常组比较:■■■P<0.0001;与 H2O2组比较:＊＊P<0.001　＊＊＊P<0.001
·51·中医药学报 2004 年第 32卷第 1 期
2.4　对兔肝匀浆MDA的影响　正常组织匀浆在体外
自氧化或受 H2O2 等激发的氧化后 ,均可产生丙二醛 ,
使MDA生成量增加 ,而MDA 是脂质过氧化反应的终
产物 ,作为评价脂质过氧化反应强弱的指标 。本实验
观察到白黎芦醇组MDA含量比自氧化组明显降低 ,与
维生素 E组无显著差别(P>0.05),表明白黎芦醇可
抑制正常肝组织自氧化MDA的产生 ,可明显抑制细胞
脂质过氧化反应(表 4)。
表 4　白黎芦醇对兔肝匀浆脂质过氧化产物MDA的影响( x±s , n=5)
自氧化组 白黎芦醇组 维生素E组
MDA值(nmol/ml) 250.38±7.62 207.43±17.06＊ 199.64±15.36＊＊
抑制率(%) 17.28 20.27
　　与自氧化组比较:＊P<0.05　＊＊P<0.001
3　小结
白黎芦醇具有螯合铜离子 ,抑制脂质过氧化 ,可以
吞噬自由基 ,抑制血小板聚集等作用 ,从而能够有效地
预防心血管疾病的发生[ 7] ,近来还发现它具有抗肿瘤
作用 。本试验从四个方面探讨了白黎芦醇对氧自由基
的清除能力和抗氧化活性 ,试验结果表明 ,白黎芦醇具
有较强的抗氧化剂活性 ,对 H2O2 诱导的 DNA的损伤
有一定的保护作用 ,是一种很好的氧自由基清除剂 。
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426.
疏解少阳 、祛风止痛法对小鼠大脑
5-羟色胺含量的影响
旺建伟 ,李冀 ,肖洪彬
(黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
摘　要:通过实验观察疏解少阳法 、祛风止痛法对小鼠大脑 5-羟色胺含量的影响 。结果表明疏解少阳
法 、祛风止痛法能提高小鼠大脑5-羟色胺含量 ,以全方为著。
关键词:疏解少阳法;祛风止痛法;5-羟色胺;小柴胡汤;偏头痛
中图分类号:R285.6　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2004)01-0052-02
收稿日期:2003-10-03
作者简介:旺建伟(1974-),女 ,方剂学专业 2001级博士研究生 ,主要从
事中医方剂的研究工作。
　　现代医学研究发现 ,5-羟色胺(5-HT)在偏头痛
病机中具有重要作用 ,而中医学以祛风止痛 、疏解少阳
法治疗偏头痛又行之有效 ,故本实验意在研究祛风止
痛 、疏解少阳法对小鼠大脑 5-HT 含量的影响 ,以阐
明本法对偏头痛治疗作用机理 。
1　实验材料
1.1　药物与试剂
疏解少阳组(柴胡 、黄芩 、半夏 、甘草),祛风止痛组
(川芎 、天麻 、细辛 、全蝎 、蜈蚣),全方组(疏解少阳组合
祛风止痛组)。药物经水煎 ,浓缩。全方组分为全方高
量组(1.5g/ml)和全方低量组(0.75g/ml),拆方组均为
0.75g/ml。阳性对照组(复方羊角片:哈尔滨生物化学
制药二厂 ,批号:99120255),配制成浓度为 0.034g/ml
的混悬液 ,供灌胃用;1-半胱氨酸(上海康达氨基酸
厂 ,批号:980901);分析醇 。
1.2　仪器
HH·W·21型电热恒温水温箱(上海医疗器械七
厂);RF-500型荧光分光光度计(日本岛津制作所);
LXJ-Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)。
·52· ACMP.February , 2004 , Vol.32 , No.1