全 文 ： 2005, Vol. 26, No. 4 食品科学 ※营养卫生216
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加杨雄花序提取物体外抗氧化及对
DNA损伤的保护作用研究
王 晓 1，张红侠 2，邓煜光 1，时新刚 1，刘建华 1
(1. 山东省科学院测试中心，山东 济南 250014；
2.济南柴油机股份公司理化实验室，山东 济南 250014)
摘 要：利用比色法、化学发光法，研究了加杨雄花序提取物体在体外对O －2·，·OH，H 2 O 2 活性氧自由基
的清除作用，以及通过 Cu2+-Phen-H2O2-Vit.C-DNA发光体系研究加杨雄花序提取物对·OH引起的DNA氧化损伤
的保护作用。实验结果表明加杨雄花序提取物对O －2·，·OH, H2O 2自由基均有明显的清除作用，其 50 %抑制
浓度 (IC50)分别为 0.69、1.73、0.23mg/ml，并能显著抑制·OH对DNA氧化损伤。
关键词：加杨雄花序；活性氧；DN A 损伤　
Effects of the Extract of Populus canadensis Moench. Male Anthotaxy on Antioxidation and
Prevention of DNA Damage Caused by Hydroxyl Radical in vitro
WANG Xiao1，ZHANG Hong-xia2，DENG Yu-guang1，SHI Xin-gang1，LIU Jian-hua1
(1.Test Center, Shangdong Academry of Sciences, Jinan 250014, China；
2.Physics and Chemistry Lab, Jinan Diesel Engine Co. Ltd., Jinan 250014, China)
Abstract ：The effects of the extract of male anthotaxy of Populus canadensis Moench. on removal of active oxygen species
in some modified chemical systems were investigated by chemiluminescence and spectrophotometry. The inhibition of the damage
of DNA chain induced by hydroxyl radical by the extract from male anthotaxy was observed by chemiluminescence. The results
showed that the extract could efficiently remove O－2·, ·OH, H2O2 and the 50% inhibition concentrations (IC50) were 0.
收稿日期：2004-05-10
基金项目：山东省自然科学基金资助项目(Q2002b04)
作者简介：王晓(1 9 7 1 - )，男，副研究员，博士，研究方向为天然产物分离与纯化。
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加杨(Populus canadensis Moench.)系杨柳科杨属植
物，主要分布于辽宁、华北、西北、华东等地，资
源极为丰富。在《重修政和经史证类备用本草》以及
《本草纲目》中记载着杨树皮、花煎汤止痢。杨树雄
花序又称杨枸花，具有抑菌、消炎、抗病毒等功效，
被收载于 1977年中国药典[1 ]。民间常用其水煎剂治疗急
性肠炎、细菌性痢疾等，此外其对皮肤瘙痒及荨麻疹
等症也有满意的效果[1 ]，黄酮类成分是杨属植物的主要
活性成分之一，主要有芹菜素, 乔松素，鼠李素，白
杨素，乔松酮等[ 1 , 2 ]。本研究采用比色法和化学发光
法研究加杨雄花序提取物(简称 PE)在体外清除活性氧
(O －2·，·OH，H 2O 2)的作用，并通过Cu 2 +-Phen-H 2O 2-
Ｖ it.C-DNA发光体系研究 PE对·OH引起的DNA氧化
损伤的抑制作用，初步评价了 PE 的抗氧化作用，旨在
为加杨雄花序的深入研究与开发应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料 加杨雄花序采于济南市植物园。
1.1.2 试剂　槲皮素、鲁米诺 ( luminol)、VC、小牛
胸腺DNA、邻菲罗啉 (Phen)均为 Sigma公司产品；邻
苯三酚、M e t、N B T、C u C l、N a 2 C O 3、N a H C O 3、
H2 O2 等试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器　SHG-D型生物化学发光测定仪 上海上立
检测仪器厂，Delta 320 pH计 Mettler-Toledo 仪器公
司，722型光栅分光光度计 上海分析仪器厂，BUCH
旋转蒸发仪 BUCH公司。
1.2 方法
1.2.1 加杨雄花序提取物的制备
取 40g阴干的样品，粉碎后加入 200ml甲醇回流提
取 2次，每次3h，合并滤液，减压浓缩得提取物 10.08g，
然后用甲醇溶解定溶于 250ml的容量瓶中，供以下分析用。
1.2.2 加杨雄花序提取物总黄酮的测定
参照文献[3]以槲皮素为标准测定样品中总黄酮的含量。
1.2.3 超氧阴离子(O －2·)清除活性的测定
参照文献[4]，在 5ml反应液中，加入Met溶液 1.
0ml，NBT溶液 0.5ml，最后加入 0.5ml VB2溶液，混匀，
使VB2浓度为3.0× 10-6mol/L，Met浓度为1.0×10-2mol/
L，NBT浓度为 1.0× 10-4mol/L。分别在样品管中加入
不同浓度的样品 3.0ml，在 20W日光灯下，距离 40cm，
光照 20min，立即在 722分光光度计上，以不光照的试
液作校正，于 560 nm 处测定吸光度为A，加入样品的
溶液测得的吸光度为 A 1，则清除率可计算为：
清除率 = [(A-A1) /A]× 100%
1.2.4 羟自由基(·OH)清除活性的测定
参考文献[5 ]，采用邻菲罗啉 -Cu +-VC-H 2O 2体系检
测·OH清除能力。向测量管中依次加入 50μl 待测样
品 (或 50μl甲醇作空白)，50μl 1× 10-3mol/L CuCl溶液，
20μ1 1× 10-3mol/L VC溶液，50μ1 1× 10-3mol/L邻菲
罗啉溶液，800μl 0.05mol/L pH10.5碳酸缓冲液，放入
反应池中。最后注入 1% 的H 2O 2 50.0μl，摇匀，启动
发光反应，连续测定发光强度 6 s，至出现峰值，记录
发光强度(CL)，清除自由基的物质可以降低发光强度，
根据发光强度的下降可以判断物质清除自由基的能力。
发光抑制率 =[(对照CL-样品CL)/对照CL]×100%。
1.2.5 H2O2清除活性的测定
参考文献[5]，采用H2O2-鲁米诺 -碳酸缓冲液 (pＨ
9.5)体系检测H2O2。向测量管中加入 50μl待测样品 (或
50μl甲醇作空白)，50μl 1× 10-3mol/L鲁米诺溶液，放
入反应池中。800μl pH9.5碳酸缓冲液，最后加 0.15 %
H2O2 50μl，(反应总体积为 1ml)启动发光反应，连续测
定反应强度 6s，至出现峰值，记录发光强度(CL )，发
光抑制率计算同上。
1.2.6 DNA损伤的化学发光体系
参考文献[6]，采用 CuSO4-Phen-VC-DNA-H2O2化学
发光体系。该体系生成·OH能损伤 DNA产生一迟于
Phen本身发光信号的滞后的化学发光，其发光强度与
DNA的量成正比关系。具体操作是：用 0.1mol/L磷酸
盐缓冲液(pH5.5)配制CuSO 4-Phen-VC-DNA溶液，使
Cu 2 +、Ph en、V C、D NA 终浓度分别为 5 .0 × 10 - 5、
3.5× 10-4、 3.5× 10-4、 1.0μg/ml，加入一定量的 PE(对
照用缓冲液补齐)。取该溶液 1m l，放入发光仪样品池
中，加入 200μ l 3% 的 H 2O 2溶液，立即测量化学发光
反应动力学曲线。
2 结果与分析
2.1 PE 对 O －2·的清除作用
甲硫氨酸(Met)作用于核黄素时可产生O －2·，可还
原氮蓝四唑(NBT)，使之转化为CN 4H 4，而黄酮化合物
可以抑制该反应，故可依据抑制率来研究提取物对O －2·
的清除效果[4 ]。如表 1所示，随着 PE质量浓度的增加，
69,1.73, 0.23mg/ml, respectively. The extract also protected DNA chains from being damaged by hydroxyl radical.
Key words：Populus canadensis Moench；male anthotaxy；active oxygen；DNA damage
中图分类号：Q523 文献标识码：A 文章编号：1002-66330(2005)05-00216-04
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对O －2·清除率呈上升趋势。其发光抑制率 50% 的浓度
(IC50 )为 0.69mg/ml (黄酮含量为 53.06μg/ml)，而对照实
验槲皮素在本体系中的 IC50 为 13.69μg/ml(见表 4)，说
明 1.73mg/ml的 PE清除O －2·的能力与之相当。
2.2 PE对羟自由基(·OH)的清除作用
通过化学模拟体系研究PE对活性氧自由基的清除作
用如表 2所示。PE的 IC50为 1.73mg/ml (即黄酮含量为
133.04μg/ml)，与 99.50μg/ml的槲皮素的清除能力相当，
且随着浓度的增加，其清除能力亦增强，呈现一定的
量效关系。众所周知，羟自由基(·O H)是最活泼也最
具危害性的自由基，具有极强的反应性，寿命极短，
在很多的缓冲液中，只要一产生，就会同缓冲溶液反
应。它几乎可以攻击所用的邻近细胞，同细胞中的所
有成分发生发应，对机体危害最大。而 PE 富含黄酮化
合物，具有较多的酚羟基，因此，可有效的还原羟基
自由基，另一方面由于 PE 可在分子内和分子间形成缔
合氢键，成为一个大的供氢体，从而达到对羟基自由
基清除的目的。
而有之[7]。槲皮素在本体系中的 IC50为 14.2μg/ml(见表4)，
在清除H2O2的能力上，0.23mg/ml的PE与14.2μg/ ml的槲
皮素相当。
2.4 PE对·OH引发的ＤＮＡ损伤的保护作用
CuSO4-Phen-VC-H2O2化学发光体系生成的·OH等
自由基引起 DNA损伤断裂，产生晚于 Phen本身氧化发
光信号的迟滞化学发光，最大发光在 380～420nm，此
发光反应为鸟嘌呤的特征反应[6 ]，代表DNA损伤产物发
光。抗氧化剂的加入使DNA损伤发光峰值下降, 并使该
峰的出现发生了时间的延迟，峰值下降代表抗氧化剂抑
制DNA损伤，发射峰的延时代表抗氧化剂延迟了 DNA
的损伤。实验结果(如图 1)显示，PE能使DNA损伤产
物发光峰值明显下降，而且浓度越大峰值下降越多。说
明 PE具有抑制和延迟的DNA氧化损伤的双重作用，是
提取物浓度(mg/ml) * 黄酮浓度(μg/ml)
发光峰值(cp6s) 抑制率(%)
PE Flavonoids
Chemiluminescence Inhibition
concentration concentration
Control 19958±251
0.20 15.38 18003±289 9.80
0.30 23.07 15461±363 22.53
1.00 76.89 12414±460 37.80
2.00 153.77 10258±234 48.60
3.00 230.66 7923±168 60.30
4.00 307.56 7012±282 66.00
5.00 384.45 5130±281 74.29
表2　 加杨雄花序提取物(PE)对·OH的清除作用(n=8)
Table 2 The scavenging effect of PE on·OH (n=8)
*注：y=18.325ln(x)+39.959，R2=0.9754，IC50=1.73mg/ml。
2.3 PE对H2O2的清除作用
H2O2能在有O 2和碱性条件下氧化鲁米诺产生化学
发光。如表 3所示，PE能显著抑制该体系的化学发光，
随着PE浓度的增大，发光值明显下降，其 IC50为 0.23mg/ml
(黄酮含量为 17.69μg/ml)，说明 PE具有清除 H2O2的作
用，或能竞争性地夺取 H2O 2能量，或者这两个作用兼
表 3　加杨雄花序提取物(PE)对H2O2的清除作用 (n=8)
Table 3 The scavenging effect of PE on H2O2 (n=8)
*注：y=14.39ln(x)+71.048，R2=0.9969，IC50=0.23mg/ml。
提取物浓度(mg/ml)* 黄酮浓度(μg/ml)
发光峰值(cp6s) 抑制率(%)
PE Flavonoids
Chemiluminescence Inhibition
concentration concentration
Control 49556 ± 416
0.10 7.69 31050 ± 545 37.35
0.20 15.38 24884 ± 331 49.47
0.50 38.44 20086 ± 470 59.47
1.00 76.89 14128 ±283 71.49
2.00 153.77 9388 ± 237 81.06
3.00 230.66 6461 ± 237 86.96
加杨雄花序提取物 槲皮素
PE(mg/ml) Quercetin(μg/ml)
超氧阴离子自由基 (O －2·) 0.69 13.69
羟自由基(·OH) 1.73 99.50
过氧化氢(H2O2) 0.23 14.20
表4 加杨雄花序提取物(PE)、槲皮素清除活性氧的能力(IC50)
Table 4 The scavenging effect of PE and quercetin on active
oxygen (IC50)
提取物浓度(mg/ml)* 黄酮浓度(μg/ml) 抑制率(%)
PE concentration Flavonoids concentration Inhibition
0.10 7.69 7.70
0.20 15.38 30.00
0.50 38.44 44.08
1.00 76.89 53.04
2.00 153.77 72.00
3.00 230.66 82.01
表 1　加杨雄花序提取物(PE)对O－2·的清除作用(n=3)
Table 1 The scavenging effect of PE onO－2·( =3)
*注：y=20.466ln(x) + 57.733 R2=0.9836，IC50=0.69mg/ml。
219※营养卫生 食品科学 2005, Vol. 26, No. 4
兼有预防型和断链型的抗氧化剂[6 ]。
3 讨 论
活性氧自由基包括超氧阴离子( O －2·)、羟自由基
(·O H)、多种有机氧自由基 ( RO·、R OO·)、单线
态氧 ( 1O 2)、无机和有机过氧化物 (H 2O 2、ROOH)等，
它们有很强的生物活性[8 ]。机体中适量的自由基对于细
胞的分裂、分化、生长、消炎解毒起积极的作用；而
过量则会对机体产生毒害，破坏生物大分子，影响细
胞活性，主要损害细胞膜包括血管内皮细胞膜及亚微结
构，并引起一系列有害的生化反应。现已明确自由基
与许多病理生理现象都有密切的关系，如衰老、肿瘤、
炎症、突变、心脑缺血、动脉粥样硬化、帕金森病
等，尤其·O H 是最活泼的活性氧自由基，它能与任
何生物分子以极快的反应速率反应[8 ]。而 H 2 O 2 及 O －2·
等与·OH 相比其反应活性不高，其对生物体的损伤可
能通过与金属离子 (Fe2 +，Cu 2 +)反应形成·OH而起作
用，因此·O H 可能是对生物体危害最大的氧自由基，
尤其是·OH引发的DNA氧化损伤更令人关注[9]。本实
验结果表明，P E 对 O －2·、·O H 和 H 2 O 2 等活性氧具
有直接清除作用，加杨雄花序中的含有丰富的黄酮类化
合物，这些物质在抗氧化反应中不仅能清除链反应引发
阶段的自由基，而且可以直接捕捉自由基反应链中的自
由基，阻断自由基链反应起到预防和断链的双重作用
[10 ]，提示 PE可能在防衰老、抗炎症等方面发挥作用。据
此推断，加杨雄花序的抗氧化作用可能是民间验方的药理
基础之一。
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信 息
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意大利开发出全球第一张有机包装纸
意大利维特波大学的科研人员研制开发出全球第一张完全无毒性、工艺无污染的有机包装纸张。这种有机纸的
主要原料为麦、玉米及其他谷类的植物纤维，利用特殊生化科技，生产出浸透力强、微黄色并带有植物香味的纸
张。目前，维特波大学已经与意大利生化公司签约，将联手合作在意大利南部开设一家工厂，生产并销售这种有
机包装纸张。
加拿大新型益生菌巧克力和谷物食品将投放市场
加拿大益生菌生产公司宣布，他们已经成功研究出一种方法，可以较好地保持益生菌的稳定性，生产出一系
列益生菌食品。他们将益生菌与巧克力混合，做成含益生菌的巧克力涂层或微粒，涂布在巧克力上，或添加到谷
物食品中。该公司测试了含益生菌巧克力涂层中益生菌的稳定性，在室温下贮存 6 个月以后，存活率为 86 %。该
公司的技术经理称，巧克力是益生菌良好的携带者，以这种方式将益生菌加入到食品中比将益生菌直接添加到食品
中要容易得多。这一发现使公司有可能开发各种涂布巧克力食品或将其制成巧克力微粒加到其他食品中。目前，公
司正在试制的其他益生菌食品包括婴幼儿配方食品、果汁等。