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芫荽对生物大分子氧化损伤的保护作用及自由基清除能力研究



全 文 :芫荽对生物大分子氧化损伤的保护作用及自由基清除能力研究
韩潆仪,任 虹*,王丹丹,万慧洁,岳锦萍
(北京工商大学食品学院,北京市食品风味化学重点实验室,食品添加剂与配料北京高校工程研究中心,
北京,100048)

摘要:研究芫荽对生物大分子氧化损伤的保护作用及自由基清除能力,采用福林酚法检测芫荽的多酚含量,
利用 2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(2,2-azobis-2-methyl-propanimidamide,AAPH)作为体外氧化诱导
剂,采用凝胶电泳检测芫荽对 DNA 和蛋白质的氧化损伤保护,用 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼
(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)法检测芫荽自由基清除率,用 ORAC (oxygen radical absorbance
capacity) 分析检测芫荽的抗氧化能力值。结果表明,芫荽里的多酚类物质含量为 4.054 μg/mg;芫荽对 DNA
氧化损伤的最低保护质量浓度为 4.0 μg/mL,对牛血清蛋白的损伤保护质量浓度为 125.0 μg/mL;芫荽提
取物对 DPPH 的 IC50值为 0.17 μg/μL。芫荽提取物的 ORAC 值为 485.3。综上所述,芫荽提取物具有较好的
抗氧化活性。
关键词:芫荽;DNA 损伤保护;蛋白质损伤保护;抗氧化;多酚

Bio-molecules damage protective effect and free radical scavenging capacity of Coriandrum
sativum L.
Han Yingyi, Ren Hong*, Wang Dandan, Wan Huijie, Yue jinping
(Beijing Technology & Business University, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food
Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing, China)

Abstract: In order to study bio-molecules damage protective effect and free radical scavenging capacity of
Coriandrum sativum L (coriander), Folin-Phenol assay was used for estimating total polyphenol of coriander. Gel
electrophoresis was performed for detecting DNA and protein damage protective effect of coriander. Free radical
scavenging capacity of coriander extract was evaluated using DPPH assay. ORAC assays was used to confirm the
value of oxygen radical absorbance capacity. The result showed that the content of total polyphenol was 4.054
μg/mg and the minimum prote1ctive concentrations on DNA and bull serum albumin (BSA) were 4.0 μg/mL and
125.0 μg/mL. The IC50 value for DPPH radical scavenging ability was 0.17 μg/μL while the ORAC value for
                                                              
作者简介:韩潆仪,女,助理实验师,硕士,研究方向为分子和细胞生物学; 
                    *任虹,女,副教授,主要从事生物制品分析等方向的研究。通讯作者。 
 
网络出版时间:2016-11-30 10:46:34
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4644.N.20161130.1046.022.html
2
antioxidant capacity was 485.3. The result indicated that the coriander extract had distinct antioxidant activity.
Keywords: coriander; DNA damage protection; protein damage protection; antioxidant; polyphenols

中图分类号:TS201.2
文献标志码:A
文章编号:

DNA 储存了机体内遗传物质的所有信息,而蛋白质是所有遗传物质表达后的产物,是生命的物
质基础,是生命活动的主要承担者。因此,保证 DNA 和蛋白质的相对完整对人体健康有着至关重要
的作用1,2。机体内正常有氧代谢产生的自由基,也称活性氧或游离基,如超氧化自由基、过氧化氢自
由基、羟基自由基等,种类繁多,这些自由基会进攻 DNA、蛋白质等生物大分子,损伤其结构,造
成细胞损伤或突变,激活癌基因或者使抗癌基因失活,从而导致细胞失去控制,引发癌症、心血管疾
病、白内障免疫系统疾病、类风湿关节炎和脑功能紊乱等疾病3,4。
抗氧化剂是一类能帮助捕获并中和自由基,从而祛除自由基对人体损害的一类物质。抗氧化剂按
来源可分为人工合成抗氧化剂(如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙
脂(PG)等)和天然抗氧化剂(如茶多酚、植酸等)。天然抗氧化剂主要是来源于动植物或微生物
的具有抗氧化活性的物质如维生素 C、多酚、活性硒等。研究表明,蔬菜中的天然抗氧化剂种类丰富,
帮助人体预防心脏病和癌症等多种疾病,并能增进脑力,延缓衰老,抗氧化效果好5。因此,近几年
人们更趋于使用天然抗氧化剂来避免人工合成抗氧化剂有可能带来的一系列毒副作用6,目前,寻找
活性高、毒副作用低的天然抗氧化剂,尤其是寻找阻止生物大分子 DNA 或蛋白质氧化损伤的天然抗
氧化剂成为国内外学者研究的热点。
近几十年,香辛食品调料的抗氧化活性得到广泛关注和研究。芫荽(Coriadrum Sativum L.),又
称香菜,是一种具有较高的食品和药用资源,风味独特,营养丰富,保健功能强,含有多种对人体有
益的活性物质,具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等保健功能7。这些特点使芫荽得到广泛关注,其中芫荽
的抗氧化功能更是国内外研究者们争相研究的热点。戴国彪等8研究证实,芫荽籽精油具有较强的清
除·OH、还原 Fe3+ 的能力,其总抗氧化效果接近与同浓度下的常见人工抗氧化剂 BHT、PG 及维生素
C。陆占国等9研究表明,芫荽茎叶芳香精油不仅具有明显的 NaNO2 清除作用,还具有捕捉 DPPH 自
由基的能力。Esther 等10对芫荽根茎叶籽各部分的抗氧化作用进行了详细的研究,证实了芫荽根部的
3
抗氧化性要弱于其他部位,同时各部位还具有 DNA 损伤保护的作用。目前,芫荽的抗氧化研究大多
注重其清除自由基活性 3,11,12,而芫荽对生物大分子诸如蛋白质、DNA 氧化损伤的保护活性研究刚
刚起步。实验以芫荽为原料,用体积分数为 70%的乙醇提取其有效成分,探索芫荽提取物对 DNA、
蛋白等生物大分子的抗氧化活性及其对自由基的清除能力,为进一步开发和研究其价值提供新的参
考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
牛血清蛋白 BSA(Bovine Serum Albumin)购于 SIGMA-ALORICH;pBR322 质粒购于赛默飞世尔
科技有限公司。
1.2 芫荽提取方法
称取新鲜饱满的市售芫荽 150g,洗净,用研钵碾碎,浸泡于 350 mL 70%(体积分数)乙醇中,
浸泡 1h 后抽滤,连续萃取 3 次,合并上清液,浓缩,置于-20°C 条件下冷冻干燥,得到 70%(体积分
数)乙醇提取物。
1.3 多酚含量的测定
多酚含量采用福林酚法测定13。
标准曲线绘制:用移液枪精准确吸取 0.00,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45,
0.50mL 没食子酸标准溶液(100 μg/mL)于洁净离心管中,蒸馏水定容至 800 μL,分别加入 150 μL
用蒸馏水稀释一倍的福林酚试剂,避光反应 10min 后,加入 600 μL 10%(质量分数) Na2CO3 到上
述混合物里,蒸馏水稀释至 5mL,此混合物在避光条件下 25°C 反应 60min,750 nm 波长处测定其吸
光度。以吸光度为纵坐标,没食子酸浓度为横坐标,绘制福林酚法标准曲线。
样品多酚含量测定:在上述实验步骤中,将 800 μL 没食子酸的溶液替换成 800 μL 质量浓度为
1mg/mL 的芫荽提取物。根据没食子酸的浓度与吸光度之间的线性关系计算多酚含量。
1.4 芫荽对 DNA 损伤保护活性的测定
参考 Harsha 等 3芫荽对 DNA 损伤保护活性研究方法,将质粒 pBR322 用 AAPH 氧化处理,然后
进行凝胶电泳观察。
AAPH 最适损伤浓度的确定:AAPH 溶解于 PBS 磷酸缓冲液。100 ng pBR322 与不同浓度的 AAPH
溶液混合,使得 AAPH 的终浓度分别为 5.0 mmol/L, 10.0 mmol/L,20.0 mmol/L,40.0 mmol/L 和 80.0
mmol/L。混合后于 37°C 反应 1h。Loading buffer 处理后,上样于质量体积分数为 1%的琼脂糖凝胶电
4
泳板中,于 180v 电压电泳 35min。 溴化乙锭染色后即可于凝胶成像分析系统 GAS7001B 观察得出
AAPH 对 pBR322 最适损伤浓度。
芫荽提取物对 DNA 损伤保护活性的测定:最适 AAPH 损伤浓度处理 DNA,加入不同浓度的芫
荽提取物,同时用已知的的抗氧化剂没食子酸作为阳性对照。37°C 条件下反应 60min。反应完成后,
将样品上样于 1%(质量体积分数)凝胶板上,180v 电压下电泳约 35min,即可观察结果。未被处理
的 pBR322 质粒作为阴性对照。
1.5 芫荽提取物对蛋白质损伤保护活性的测定
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 检测不同抗氧化剂对蛋白氧化损伤的抑制作用。
AAPH 最适损伤浓度的确定:1mg BSA 分别与不同浓度 AAPH 溶液(溶于 PBS)于 37°C 反应
24h,采用 SDS-PAGE 电泳检测蛋白质氧化损伤情况。
芫荽提取物对蛋白质损伤保护浓度的测定:不同浓度的芫荽提取物加入到有 AAPH 存在的 BSA
溶液中,37°C 孵育 24h,即可上样观察,检测芫荽对其氧化降解的抑制作用。
1.6 芫荽提取物对 DPPH 自由基清除能力的测定
DPPH 法常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价14。1.0 mg/mL 芫荽溶液加入到 2 mL DPPH 溶液
中,直到 DPPH 的紫色完全褪去,后用甲醇定容至 3mL。将此混合物充分混合,室温反应 30min,测
定其 517nm 处的吸光度值,记录此时的吸光度值为 A1 , 同时空白对照的吸光度值记录为 A0 ,芫荽提
取物对其氧化作用抑制的百分比公式(1)计算:
IR= [(A0-A1)/A0]×100%。 (1)
当 50%DPPH 被清除时的芫荽提取物浓度定义为 IC50 值。此测量进行 3 次,取其平均值。
1.7 ORAC 法测芫荽抗氧化活性的测定
ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity)是氧化自由基吸收能力的缩写,氧化自由基吸收能
力又称为抗氧化能力。用抗氧化能力(即 Trolox 当量)作为定量依据,通过体外实验测定芫荽的抗氧
化能力。ORAC 分析方法是根据自由基破坏荧光探针,使荧光强度产生变化原理。Trolox(6-羟基-2,5,7,8-
四甲基色烷-2-羧酸,6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid),水溶性维生素 E,一种
细胞通透的水溶性的 VE 类似物,具有抗氧化的性质。以 Trolox 为定量标准,使用荧光微孔板分析
仪进行分析15。荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度。在抗氧化剂存在时,它可以抑制由自由
基引起的荧光变化。抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力16。
在现有的方法上稍加改进,用 0.1 mmol/L 荧光素钠(溶解于 PBS)、 AAPH (100 mmol/L,溶解
5
于 PBS),和抗氧化剂 Trolox。20μL 不同浓度(8,6,4,2,0 μmol/L)的 Trolox 加入到 96 孔板里。
有 Trolox 溶液的 96 孔板里分别加入 20μL PBS 和 20 μL 荧光素钠。37°C 混合反应 5min。加入 140 μL
AAPH 诱发自由基产生反应。使用荧光酶标仪每隔两分钟测量 358nm 处的荧光强度。作为空白对照,
用 20 μL 甲醇来代替 Trolox 溶液,得到反应时间与荧光强度的关系,如图 1,用 ORAC 值来表示抗氧
化能力,ORAC 值即曲线下阴影部分的面积。1 ORAC 表示 1.0 μmol/L Trolox 所提供的抗氧化保护能
力。芫荽提取物的抗氧化能力可以用公式(2)计算:
ORAC 值= AUC Trolox –AUC blank。 (2)
由于 ORAC 值和 Trolox 浓度存在明显的线性关系,所以基于 Trolox 标准曲线即可计算出芫荽提
取物的 ORAC 值。

图 1 ORAC 值的计算 ORAC Value = AUC Trolox –AUC blank
Fig.1 Calculation of ORAC values ORAC Value = AUC Trolox –AUC blank

2 结果与分析
2.1 芫荽提取物中多酚含量
多酚类物质富含酚羟基,具有强的自由基清除能力17。标准物没食子酸浓度与吸光值之间线性关
系见图 2,根据标准曲线检测出芫荽提取物中多酚质量分数为 4.054 μg/mg。
6

图 2 没食子酸标准曲线
Fig.2 Stand curve of gallic acid
2.2 芫荽提取物对 DNA 氧化损伤保护活性的分析
AAPH 是一种叠氮化合物, 是一种公认的自由基诱导剂。在 37°C,pH 值 7.0 条件下,AAPH
会分解产生氮气和碳自由基,而碳自由基可以与氧气发生反应生成 ROS18。对于正常的 pBR322,在
凝胶电泳图谱中,超螺旋 DNA 是优势条带,但经过 AAPH 处理的 DNA,DNA 的超螺旋被破坏,DNA
分子被氧化断裂,生成线性或开环 DNA。与没有经过 AAPH 处理的 DNA 相比,AAPH 处理后超螺
旋 DNA 明显减少(如图 3),当浓度为 20 mmol/L 时,正常状态下应有的超螺旋 DNA 条带刚好消失
不见,当 AAPH 浓度大于 20mmol/L,所有形式的 DNA 都会被降解。说明 AAPH 对 DNA 氧化损伤
的最佳浓度为 20 mmol/L。
随着芫荽提取物浓度的增加,超螺旋 DNA 随之增多,同时,开环 DNA 和线性 DNA 随之减少(如
图 4)。该结果充分说明了芫荽提取物对 DNA 氧化损伤具有保护修复作用,此结果与 Guerra19等的定
性研究结果相符。实验中我们发现,在 2.0 μg/mL 到 8.0 μg/mL 质量浓度范围内,芫荽提取物对 DNA
氧化损伤保护作用具有浓度依赖性。当芫荽提取物质量浓度达到 4.0 μg/mL 时, 刚好保护超螺旋 DNA
不被氧化,揭示芫荽的最小保护质量浓度是 4.0 μg/mL,该结果为芫荽对 DNA 分子的损伤保护能力提
供了定性和定量依据。
7

图 3 AAPH 对 DNA 的氧化损伤作用
Fig.3 DNA oxidative damage induced by AAPH
泳道 1: control DNA; 泳道2: DNA+5mmol/L AAPH; 泳道3: DNA+10 mmol/L AAPH; 泳道4: DNA+20
mmol/L AAPH; 泳道 5: DNA+40 mmol/L DNA; 泳道 6: DNA+80 mmol/L AAPH.

图 4 芫荽对 DNA 氧化损伤的保护活性
Fig.4 Protective effect of coriander on the DNA oxidative damage
泳道 1 control: DNA; 泳道 2: DNA+20 mmol/L AAPH; 泳道 3: DNA+20 mmol/L AAPH+2.0 μg/mL 芫荽;
泳道 4: DNA+20 mmol/L AAPH+4.0 μg/mL 芫荽; 泳道 5: DNA+20 mmol/L AAPH+6.0 μg/mL 芫荽; 泳
道 6: DNA+20 mmol/L AAPH+8.0 μg/mL 芫荽; 泳道 7: DNA+20 mmol/L AAPH+0.02 μg/μL 没食子酸。

2.3 芫荽提取物对蛋白质损伤保护活性的分析
AAPH 可使 BSA 发生氧化损伤,用不同浓度的 AAPH 处理 BSA,随着 AAPH 浓度的提升,蛋白
质的条带密度逐渐降低,意味着蛋白质的降解越来越严重。当 AAPH 浓度上升至 40 mmol/L 时,蛋
白质电泳条带就几乎消失,说明蛋白质刚好被完全降解,如图 5,继续升高 AAPH 浓度,达到 80 mmol/L
时,蛋白质全部被氧化降解,蛋白条带消失不见,因此,40 mmol/L 为 AAPH 最适损伤浓度。
AAPH 浓度为 40 mmol/L 时,随着芫荽浓度的提高,蛋白电泳条带密度逐渐增多,说明芫荽提取
8
物对蛋白质损伤氧化具有保护作用,并且具有浓度依赖性(见图 6)。当芫荽的质量浓度提升至 125.0
μg/mL,蛋白表达的条带开始出现从无到有的变化,说明芫荽提取物的最小保护质量浓度为 125.0
μg/mL。

图 5 AAPH 对蛋白质的氧化损伤作用
Fig.5 Protein oxidative damage induced by AAPH
泳道 1: 5μg BSA; 通道 2: 5μg BSA +2.5 mmol/L AAPH; 泳道 3: 5μg BSA +5 mmol/L AAPH; 泳道 4:
5μg BSA +10 mmol/L AAPH; 泳道 5: 5μg BSA +20 mmol/L DNA; 泳道 6: 5μg BSA +40 mmol/L AAPH;
泳道 7: 5μg BSA+ 80 mmol/L AAPH。


图 6 芫荽对蛋白质氧化损伤的保护活性
Fig.6 Protective effect of coriander on protein oxidative damage
泳道 1 control: 5μg BSA; 泳道 2: 5μg BSA + 40 mmol/L AAPH; 泳道 3: 5μg BSA + 40 mmol/L AAPH +
31.25μg/mL 芫荽; 泳道 4: 5 μg BSA + 40 mmol/L AAPH + 62.5 μg/mL 芫荽; 泳道 5: 5μg BSA +40
mmol/L AAPH+125.0 μg/mL 芫荽; 泳道 6: 5μg BSA +40 mmol/L AAPH+250.0 μg/mL 芫荽; 泳道 7: 5μg
BSA +40 mmol/L AAPH+500.0 μg/mL 芫荽; 泳道 8: 5 μg BSA+40 mmol/L AAPH+1000.0 μg/mL 芫荽.

2.4 DPPH·清除能力的分析
DPPH 方法被广泛用于自由基清除能力的快速检测。三次平行实验的实验数据平均值和标准差
(SD)显示于表 1 中。图 7 中的数据点均是表 1 中的平均值。从图 5 中可以看到芫荽提取物质量浓
度从 0.07 μg/μL 到 0.33 μg/μL,清除能力逐渐提高。芫荽提取物具有中等强度的 DPPH 自由基清除的
9
能力,其 IC50 值为 0.17 μg/μL。我们的研究与相关文献报道一致,进一步证实了芫荽提取物的自由基
清除能力 3,20 。
表 1 芫荽提取物对 DPPH 自由基的清除率
Table.1 DPPH radical scavenging activity of coriander extract (% scavenging)


图 7 样品浓度与 DPPH 清除率之间的关系
Fig.4 Correlation between the concentration of samples and the DPPH radical scavenging activity (%
scavenging).

2.5 ORAC 法测芫荽抗氧化能力的分析
以 Trolox 为定量标准,荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度 12。在抗氧化剂存在时,可以
抑制由自由基引起的荧光变化,抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力21。实验中,AAPH 扮演过
氧化氢自由基的引发剂,Trolox 作为阳性对照。随着 Trolox 浓度变化,荧光衰退变化的曲线如图 8(A)。
抗氧化能力值 ORAC 与 Trolox 浓度之间的线性关系,通过 ORAC 值的检测对芫荽的抗氧化能力进行
了量化,见图 8(B)。1 ORAC 相当于 1 mL 1μmol/L Trolox 所产生的抗氧化保护能力,芫荽的 ORAC
10
值是 485.3。芫荽的 ORAC 值说明芫荽具有较强抗氧化能力。


图 8(A) 不同浓度下 Trolox 的荧光衰退曲线,(B) AUC 与 Trolox 浓度之间的线性关系
Fig.8 (A) Effects of different concentrations of Trolox on fluorescence decay curves, (B) The linear
relationship between the net AUC and Trolox concentration.

3. 结论
近几年来,辛香调料的抗氧化活性已被人们重视22,23。本实验结果显示,芫荽提取物对生物大分
子 DNA 和蛋白质的氧化损伤均具有保护活性,且呈浓度依赖性,对 DNA 损伤的最小保护质量浓度
为 4.0 μg/mL,对 BSA 的最小保护质量浓度为 125.0 μg/mL。同时,检测了芫荽提取物对 DPPH 自由
基的清除能力,其 IC50 值为 0.17 μg/μL。ORAC 方法也进一步有效证明了芫荽的抗氧化活性,其 ORAC
11
值是 485.3,本实验为芫荽的抗氧化活性提供了定性和定量的证据。芫荽提取物对生物大分子 DNA、
蛋白质氧化损伤的保护活性及自由基清除活性,为其进一步开发为功能性食品提供了科学依据。目前
的研究拓宽了抗氧化活性评价的方法,也为今后研制更多天然、无毒害的抗氧化功能性食品提供了思
路。

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