全 文 ：第 27 卷　第 4期
2005 年 7 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.27 , No.4
Jul., 2005
收稿日期:2004--05--19
http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:江苏省科技攻关计划资助项目(BE2003384)和江苏省“六大”人才高峰资助项目(苏人发[ 2004] 28号).
第一作者:李杰 ,工程师 ,博士生.主要研究方向:植物生物技术.电话:0523-6969029　Emai l:jay0224@sina.com　工作单位地址:225321江苏
泰州扬子江南路 88#江苏省兰花工程研究中心.
植物外源激素对大花蕙兰体胚发生影响的研究
李　杰1 , 2　黄敏仁1　王明庥1　蔡　汝2
(1南京林业大学林木遗传和基因工程国家林业局重点实验室　2江苏省兰花工程研究中心)
摘要:采用正交试验设计方法研究了 3 种激素 2 , 4--D、萘乙酸(NAA)和激动素(KT)不同浓度对 4个不同品种大花蕙
兰茎段愈伤组织诱导和体胚发生频率的影响.结果表明:①3种激素对愈伤组织的诱导和体胚发生的影响均达极显
著差异;②2 , 4--D对愈伤组织的发生有非常显著的作用 ,且随浓度升高 ,诱导率增加 , 但高于 2.0 mg L时 , 外植体褐
化死亡;③KT是体胚发生的关键因子 ,其作用受到 2 , 4--D的抑制和低浓度 NAA 的促进;④体胚的发生受基因型的
影响 ,但其对基因型的依赖性具分组特性.
关键词:大花蕙兰 , 胚胎发生 , 植物激素
中图分类号:S682.31　　文献标识码:A　　文章编号:1000--1522(2005)04--0065--04
LI Jie
1, 2;HUANG Min_ren1;WANG Ming_xiu1;CAI Ru2.Effects of exogenous growth regulators on
somatic embryogenesis of Cymbidium hybridum.Journal of Beijing Forestry University(2005)27(4)65--68
[Ch , 7 ref.]
1 The Key Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering ,State Forestry Administration ,Nanjing Forestry
University ,210037 , P.R.China;
2 Orchid Research Centre of Jiangsu Province ,Taizhou ,225321 ,P.R.China.
The effects of different concentrations of 2 , 4-D , NAA and KT on the callus formation and somatic
embryogenesis of Cymbidium hybridum were investigated using an orthogonal design.The results show that:1)
the effects of 2 , 4-D , NAA and KT on the frequency of callus formation and somatic embryogenesis of
Cymbidium hybridum differ extremely significantly;2)2 ,4-D is a necessary factor to induce callus , and the
frequency of callus formation increases with the increase of concentrations , but the explants will turn brown and
die when the concentration is above 2.0 mg L;3)KT is the key factor to induce formation of somatic
embryogenesis , and its effects are restrained by 2 ,4-D and accelerated by a low concentration of NAA;4)the
frequency of somatic embryogenesis formation is also related to the genotype , but its dependence on the
genotype has clustering and scattering characteristics.
Key words　Cymbidium hybridum , somatic embryogenesis , plant growth regulator
　　大花蕙兰(Cymbidium hybridum)属兰科兰属植
物 ,是盆栽观赏的高级花材 ,具有广泛的市场需求.
其传统繁殖方式为分株繁殖 ,繁殖系数低 ,周期长.
为加速繁殖速度 ,许多研究者进行了旨在以快速繁
殖为目的的研究工作.如徐宏英等[ 1] 利用幼芽 、幼
根 ,吴晓霞等[ 2] 利用茎段分别从类原球茎途径获得
大花蕙兰的试管苗 ,郑作俐等[ 3] 利用茎尖从丛生芽
途径增殖大花蕙兰.相比较而言 ,体细胞胚具有个体
间遗传背景更为一致 、结构完整 、快速量多等优点 ,
能极大地提高繁殖效率 ,降低成本 ,因而应是最优先
研究的问题.本文以大花蕙兰茎段为材料 ,进行了愈
伤组织诱导和体细胞胚胎发生的研究.
1　材料与方法
1.1　材　料
供试的大花蕙兰品种由江苏省兰花工程研究中
心提供.其名称性状分别为 Cymbidium hybridum
`Huanyin (代号 HY ,中大轮花 ,萼瓣绿色 , 唇瓣红
DOI :10.13332/j.1000-1522.2005.04.013
色)、Cymbidium hybridum `Fenjia (代号 FJ ,大轮花 ,
萼瓣红色 , 唇瓣玉边红色)、Cymbidium hybridum
`Biyu (代号 BY ,矮化品种 ,萼瓣绿色 ,唇瓣黄色)和
Cymbidium hybridum `Xiyang (代号 XY ,中轮花 ,萼瓣
红色 ,唇瓣红色).在已建立的大花蕙兰无菌体系中 ,
取上述品种的丛生诱导芽[ 3] ,切取茎段接种于不同
培养基上 ,培养基配方为:Orchimax (系荷兰 Haarlem
公司生产兰花专用培养基 ,其成分为 1/2MS 培养基
+蔗糖20mg L+MES 1 000 mg L)+琼脂 7.0 g L+
不同植物外源激素组合 , 121℃下灭菌 20 min.培养
温度(25±2)℃,环境湿度 60%～ 80%,光照度为低
于500 1x 的散射光 ,每天光照 12 h.
1.2　方　法
1.2.1　实验设计
采用多因素正交试验设计 ,设计 3种外源激素
2 ,4-D(b1:0.0 mg L ,b2:0.5mg L , b3:1.0 mg L ,b4:
1.5 mg L)、NAA(c1:0.0 mg L , c2:0.5 mg L , c3:1.0
mg L , c4:1.5mg L)、激动素 KT(d1:0.0 mg L ,d2:0.5
mg L ,d3:1.0 mg L , d4:1.5 mg L)和 4 个品种(a1:
HY , a2:FJ , a3:BY , a4:XY)4因素 4水平.总共 16种
处理 ,每个处理 20个重复 ,每个重复 10 瓶培养基 ,
每瓶接入茎段 10个.
1.2.2　计算方法
体胚(愈伤组织)发生率 FEG(FCF)=发生体胚
(愈伤组织)外植体数/植入外植体数 ,以瓶为单位计
算平均数.统计数据经反正弦转换后录入计算机用
SAS程序作方差分析和显著性检验.
2　结果与分析
2.1　不同外源激素组合及浓度对大花蕙兰茎段愈
伤组织诱导和体胚发生的影响
表 1　大花蕙兰茎段诱导率和胚胎发生率方差分析表
TABLE 1　Variance analysis of frequency of callus formation and embryogenesis of Cymbidium hybridum
变异来源 自由度
愈伤组织诱导率 胚胎发生率
平方和 均方 F值 概率 P
Pr>F 平方和 均方 F值
概率 P
Pr>F
2 ,4-D 3 16.68 5.56 3 034.46 0.000 1 2.48 0.83 1 531.91 0.000 1
NAA 3 1.79 0.60 326.11 0.000 1 1.72 0.57 1 060.61 0.000 1
KT 3 0.68 0.22 124.26 0.000 1 3.02 1.01 1 867.72 0.000 1
误差 144 0.26 0.001 8 0.078 0.000 54
总变异 159 26.98 8.95
表 2　大花蕙兰茎段诱导率和胚胎发生率的显著性测验
TABLE 2　Test of significance on frequency of callus
formation and embryogenesis of Cymbidium hybridum
激素浓度
(mg·L-1)
愈伤组织诱导率
平均值 显著性
0.05 0.01
激素浓度
(mg·L-1)
胚胎发生率
平均值 显著性
0.05 0.01
2 ,4-D 1.5 0.76 a A 0.0 0.34 a A
1.0 0.69 b B 1.0 0.17 b B
0.5 0.57 c C 0.5 0.17 b B
0.0 0.024 d D 1.5 0.00 c C
NAA 1.5 0.67 a A 0.5 0.27 a A
1.0 0.54 b B 1.0 0.25 a A
0.5 0.46 b C 0.0 0.15 b C
0.0 0.45 b C 1.5 0.01 c D
KT 0.5 0.61 a A 1.5 0.36 a A
1.0 0.55 a A 1.0 0.22 b B
1.5 0.53 a A 0.5 0.08 c C
0.0 0.44 a D 0.0 0.01 d D
注:相同标记字母的即为差异不显著(以下各表同).
对3种外源激素 4个浓度水平正交试验的大花
蕙兰茎段诱导率和胚胎发生率进行了方差分析 , F
测验结果见表 1.从表 1可知 ,2 , 4-D 、NAA和 KT等
3个因子对大花蕙兰茎段诱导愈伤和体胚发生的影
响均达极显著水平.2 , 4-D 对愈伤组织诱导的影响
最大 , F 值达 3 034.46.KT对体胚发生的作用最大 ,
F 值达 1 867.72.而NAA对愈伤组织诱导和体胚发
生的影响都相对较小.植物外源激素对大花蕙兰诱
导率和胚胎发生率显著性测验结果见表 2.从表 2
可以看出 ,2 ,4--D对愈伤组织的发生是必需的 ,在无
2 ,4--D的情况下 ,几乎不发生愈伤组织的诱导 ,诱导
率仅为 0.024 ,随着浓度(浓度为 0.5 、1.0或 1.5 mg
L)的增加 ,愈伤组织诱导效果可极显著地增加 ,各
浓度之间达显著差异.NAA 对愈伤组织的形成有明
显的促进作用 ,且随NAA(浓度为0.5 、1.0或 1.5mg
L)浓度的增加 ,诱导率亦升高.KT 对愈伤组织诱导
效果 ,各浓度的差异不显著.3种外源激素对胚胎发
生率的影响表现在 2 , 4--D 和 KT 的是否加入上.当
2 ,4-D含量达 1.5 mg L 以上时 ,或 KT 的浓度低于
0.5 mg L时 ,均无体胚的发生.当 2 , 4-D浓度低于
1.0 mg L ,且KT 含量达到 0.5mg L 以上时 ,随 KT 浓
度增加 ,体胚诱导率随之增加.低浓度的 NAA 对体
胚发生有一定的促进作用.
2.2　基因型对愈伤组织诱导率和胚胎发生率的影响
对 4种基因型和 16种培养基诱导大花蕙兰愈
66 北　京　林　业　大　学　学　报 第 27卷　
伤和体细胞胚胎发生的影响进行了方差分析和显著
性测验 ,结果见表 3 ～ 5.
表 3表明 ,基因型和培养基对愈伤组织的诱导
和胚胎发生率的影响均表现出极显著的差异 ,即表
现出愈伤诱导和胚胎发生率对基因型的依赖性.进
而从表 4的显著性测验可知 , a1 、a2 、a3和 a4 4种基
因型对外源激素的协同反应表现基本一致.当在
Orchimax基本培养基中不加任何外源激素时 ,正交
排列到的品种 ,其愈伤组织的诱导率和体细胞胚胎
发生率均为 0 ,说明大花蕙兰愈伤组织和体胚的诱
导必须在外源激素的启动下才能发生.对当附加
1.0mg L 以上 2 ,4-D ,加或不加其他两种外源激素 ,
各基因型均可诱导产生 60%以上的诱导率 ,但当只
加入 2 ,4--D ,不发生体胚分化 ,却对非胚性愈伤组织
的形成有非常明显的作用.不论哪种基因型 ,体细胞
胚胎的发生均受 3种外源激素的共同影响 ,高浓度
的KT有利于体胚发生 ,尤其是当和低浓度的 NAA
配合 ,体胚的发生率增加 ,但会因 2 , 4-D的加入受
到抑制.在不添加 2 , 4-D 的情况下 ,体胚发生主要
受NAA 和 KT 的浓度及其比例的影响 ,高比例的
KT/NAA均对体胚发生有促进作用.在植物激素对
体胚发生影响的研究上 , 2 ,4-D的作用是受到争议
的.李步勋等人在研究大蒜体胚发生时 ,认为2 ,4--D
利于体胚的发生和发育[ 4] ,而张寒霜等在低酚陆地
棉的研究中认为 ,要去掉 2 ,4-D ,胚性愈伤组织才能
大量出现[ 5] ,后者的研究结果与本研究有一致之处.
关于其内在机制 ,需进一步探讨.基因型间的胚胎发
生率以 a2和 a3表现较好 ,两者间差异未达显著水
平 ,而极显著或显著高于 a4和 a1.这表明体胚发生
率在植物基因型间存在显著差异 ,这与 Parrot 等在
大豆体胚发生因素上的研究结果相似[ 6] .从组合关
系看 , 以 a1b4c4d4 的愈伤组织诱导率最高 , 可达
94.90%;a3b1c3d4 组合的体胚发生率最高 , 可达
69.68%.
为进一步探讨 KT 浓度在 1.5 mg L 以上时对体
胚形成的影响 ,以 a3b1c3为不变量 ,而将 KT浓度分
别设计为 1.6 ～ 2.0mg L 5个浓度梯度进行试验 ,其
结果如表 6.从表中可看出 ,在上述条件下 ,当KT 浓
度高于1.5 mg L 时 ,体胚发生率不增加 ,但外植体
直接分化出芽的比率随 KT 浓度上升而增加.试验
再次确证了外源激素浓度比例的微妙变化 ,对植物
形态建成和分化的重要影响.
表 3　不同基因型和 16 种培养基的诱导率和胚胎发生率方差分析
TABLE 3　Variance analysis of frequency of callus formation and embryogenesis on
different genotypes and 16 media of Cymbidium hybridum
变异来源 自由度 愈伤组织诱导率 胚胎发生率
SS MS F SS MS F
概率 P
Pr>F
基因型 3 5.80 1.93 1 055.57＊＊ 1.15 0.38 707.29＊＊ 0.000 1
培养基 15 26.72 1.78 972.25＊＊ 8.87 0.59 1 095.75＊＊ 0.000 1
误差 144 0.26 0.001 8 0.078 0.000 54
总计 159 26.98 8.95
注:＊＊表示达到 α= 0.01显著水平(以下各表同).
表 4　16 种培养基诱导大花蕙兰诱导率和胚胎发生率的显著性测验
TABLE 4　Test of significance on frequency of callus formation and embryogenesis on 16 media of Cymbidium hybridum
培养基 愈伤组织诱导率 % 显著性
0.05 0.01 培养基 胚胎发生率 %
显著性
0.05 0.01
a1b4c4d4 94.90 a A a3b1c3d4 69.68 a A
a1b3c3d3 88.20 b B a2b1c2d3 59.48 b B
a3b4c2d1 84.15 c BC a2b2c1d4 39.86 c C
a4b4c1d3 81.28 d C a4b3c2d4 30.41 d D
a2b4c3d2 80.28 d C a1b3c3d3 20.06 e E
a1b2c2d2 79.50 d C a3b3c1d2 19.08 e EF
a4b2c3d1 79.50 d C a1b2c2d2 14.75 f F
a4b3c2d4 61.94 e D a3b2c4d3 5.50 g G
a3b3c1d2 60.64 e D a4b2c3d1 5.30 g G
a2b3c4d1 60.24 e D a1b1c1d1 0.00 h H
a2b2c1d4 30.79 f E a1b4c4d4 0.00 h H
a3b2c4d3 30.22 f E a2b3c4d1 0.00 h H
a4b1c4d2 28.60 f E a2b4c3d2 0.00 h H
a1b1c1d1 0.00 g F a3b4c2d1 0.00 h H
a2b1c2d3 0.00 g F a4b1c4d2 0.00 h H
a3b1c3d4 0.00 g F a4b4c1d3 0.00 h H
67第 4期 李　杰等:植物外源激素对大花蕙兰体胚发生影响的研究
表 5　基因型间胚胎发生率的差异显著性
TABLE 5　Test of significance on frequency of
embryogenesis among genotypes of Cymbidium hybridum
基因型 胚胎发生率 % 差异显著性
x--8.73 x--9.03 x--25.18
a2 25.87 17.14＊＊ 16.84＊＊ 0.69
a3 25.18 16.45＊＊ 16.15＊＊
a4 9.03 0.30
a1 8.73
表 6　KT 对诱导大花蕙兰胚胎发生率的影响
TABLE 6 Effect of KT on frequency of embryogenesis
formation of Cymbidium hybridum
KT 浓度 (mg·L-1) 胚胎发生率 % 芽形成率 %
1.6 72.21 a 17.35d
1.7 70.94 a 23.98 c
1.8 62.54 b 33.66b
1.9 41.66 c 55.08 a
2.0 30.89 d 69.00 a
3　讨　　论
许多研究者认为 ,兰花体细胞胚胎的发生是类
原球茎形成的早期阶段 ,但体胚和类原球茎在形态
发育上的真实联系 ,未见研究报道.最近几年 ,先后
有学者报道了建兰(Cymbidium ensifolium)、蝴蝶兰
(Phalaenopsis)、文心兰(Oncidium)体胚发生和植株再
生的研究结果 ,认为体胚是单细胞起源 ,形态发育上
体现出明显的极性分化[ 7] ,但对单细胞发育的全过
程追踪以及类原球茎是否都源于体胚发育的后续阶
段 ,需进一步深入研究.在本试验中 ,大花蕙兰的体
胚发生 ,需较高浓度的 KT 配合低浓度的生长素启
动 ,这与大花蕙兰类原球茎诱导的激素反应情况相
似 ,但类原球茎是否均源于体胚 ,需进一步作其他佐
证.不同基因型和不同培养基的胚胎发生率在基因
型间存在分组特性 ,即表现出体细胞胚胎发生对基
因型的依赖性 ,有些品种间差异显著 ,如 a1和 a2 、a1
和 a3 ,有些差异不显著 ,如 a1和 a4 、a2和 a3.在生产
实践中 ,我们也曾观察到 ,不同基因型大花蕙兰丛生
芽诱导效果也存在分组规律.这可能与不同品种大
花蕙兰基因组高度杂合有关.大花蕙兰本身是由兰
属中的碧玉兰(Cymbidium lowianum)、独占春(C.
enburneum)、建兰等杂交而成 ,品种间基因型差异很
大 ,亲缘远近不同 ,因而诱导效率不同.在下一步实
验中 ,我们正试图以胚性愈伤组织为材料 ,建立大花
蕙兰胚性悬浮细胞系 ,希望从悬浮细胞系获得发育
良好的体胚 ,并实现植株再生.
总之 ,本研究初步表明了在含有较高浓度KT 的
Orchimax基本培养基上 ,大花蕙兰胚性愈伤组织有
较好的诱导率.在相同的培养基上 ,能在较短的时间
内快速增殖并分化形成类原球茎 ,进而实现植株再
生.该研究展示出了利用生物技术的方法 ,实现大花
蕙兰规模化生产的辉煌前景.
参 考 文 献
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Communications , 2001 ,37(6):534.
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WU X X , JIANG D Y , CUI Y H , et al.Tissue culture and rapid
propagation of Cymbidium grandiflorum [ J ] .Plant Physiology
Communications , 2002 , 38(2):141.
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北农林科技大学学报:自然科学版 ,2002 , 30(5):31--39.
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(责任编辑　董晓燕)
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